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． 2017年3月1日;312(3):L309-L325。
doi: 10.1152 / ajplung.00357.2016。 Epub 2016 12月15日。

Capsaicin-induced Ca2 +特发性PAH患者的肺动脉平滑肌细胞中TRPV1通道上调，信号通路增强

姗姗的歌12， Ramon J Ayon12， 阿雅Yamamura3.， 众所周知Yamamura4， Swetaleena破折号12， Aleksandra Babicheva12， 海阳唐12， Xutong太阳12， Arlette G Cordery12， Zain Khalpey5， 斯蒂芬·M·布莱克126， Ankit A Desai2， 弗朗茨Rischard2， 金伯利M麦克德莫特12， 乔·G·N·加西亚12， 若牧野126， 袁兴杰726
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Capsaicin-induced Ca2 +特发性PAH患者的肺动脉平滑肌细胞中TRPV1通道上调，信号通路增强

姗姗的歌et al。 Am J Physiol肺细胞Mol Physiol． ．
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摘要

辣椒素是辣椒中的一种活性成分，也是一种止痛药物。辣椒素可激活TRPV1通道，增加胞质钙含量2 +浓度([Ca2 +］cyt)．的上升2 +］cyt在肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)是一个重要的刺激肺血管收缩和血管重塑。在这项研究中，我们观察到辣椒素诱导的[Ca2 +］cyt与健康供体的正常pasmc相比，特发性肺动脉高压(IPAH)患者的pasmc显著增强。此外，IPAH pasmc中TRPV1蛋白表达水平高于正常pasmc。将温度从23℃提高到43℃，或将细胞外pH值从7.4降低到5.9，辣椒素诱导的[Ca2 +］cyt；酸性(pH 5.9)和热(43°C)介导的辣椒素诱导[Ca2 +］cytIPAH pasmc比正常pasmc增加更多。将细胞外渗透压从310降至200 mOsmol/l也增加了[Ca2 +］cyt低渗诱导的[Ca2 +］cytIPAH pasmc组比健康pasmc组更大。抑制TRPV1(用5'- irtx或辣椒素)或抑制TRPV1(用短发夹RNA)减弱辣椒素-、酸性-和渗透拉伸介导的[Ca2 +］cytIPAH pasmc增加。辣椒素通过提高[Ca2 +］cyt与正常pasmc相比，IPAH pasmc中辣椒素诱导的CREB磷酸化显著增强。TRPV1的药理抑制和抑制抑制IPAH PASMC增殖。总之，辣椒素介导的[Ca2 +］cytTRPV1的上调可能是钙含量增加的重要致病机制2 +IPAH患者的内流和过度PASMC增殖。

关键词:TRPV1;辣椒素;特发性肺动脉高压;机械敏性阳离子通道;渗透压。

数据

图1所示。
图1所示。
辣椒素诱导的[Ca2 +］cyt特发性肺动脉高压(IPAH)患者的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)显著增强。一个: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cyt正常情况下(前)及IPAH (底) 1、10、50、100和500 μM辣椒素外施前后的PASMCs。B: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cyt在不存在(对照)或存在100,300和1,000 nM 5 ' -碘化树脂毒素(5 ' -IRTX)的情况下，IPAH PASMCs对50 μM辣椒素的反应(前)和1,10,40 μM capsazepine (CPZ)是TRPV1通道的有效拮抗剂(底)．C:汇总数据(均值±SE)，显示实际(前)和规范化(底)辣椒素诱导的[Ca2 +］cyt正常(白圈)和IPAH(黑方格)的pasmc (n= 120-150个细胞，3-5个独立实验)。D:汇总数据(均值±SE)，显示实际(上)和归一化(底) 5 ' - irtx诱导的(左)和cpz诱导的(正确的)抑制[Ca2 +］cyt50 μM辣椒素诱导IPAH PASMCs (n= 90至120个细胞，3个独立实验)。E:代表性图像(前)和汇总数据(平均值±SE，底)显示来自三个正常供体的pasmc中TRPV1的Western blot分析(n= 3例)和6例IPAH患者(n= 6)。F而且G:常规(F)和实时(G)三名正常供体pasmc中TRPV1的RT-PCR分析(n= 3例)和6例IPAH患者(n= 6)P< 0.05和***P与正常pasmc相比< 0.001。
图2所示。
图2所示。
辣椒素对人pasmc膜斑块单通道活性的影响。一个而且D:细胞附着膜贴片中正常pasmc和IPAH pasmc在20 mV步长+20至+100 mV的不同测试电位下的代表性电流记录(一个而且D，左)．综合电流-电压关系(I-V曲线)表明，这个辣椒素敏感通道的斜率电导对于普通pasmc为143 pS，对于IPAH pasmc为144 pS (一个而且D，正确的)．B而且E:正常pasmc在+80 mV下持续去极化所引起的细胞附着膜贴片中的代表性单位电流(B)及IPAH pasmc (E)暴露于对照(对照)、1µM辣椒素(CPS)或1µM辣椒素+ 10µM辣椒素(CPS+CPZ)。C而且F:显示正常pasmc的稳态开放概率[P(o)]的柱状图(C)及IPAH pasmc (F)作为时间的函数B而且E,分别。n=每组4-6个细胞。
图3所示。
图3所示。
K+和Cl-通道不参与辣椒素介导的人类PASMCs膜斑块单通道电流的激活。将1 μ M帕罗西林、100 nM apaamin、2 mM四乙胺(TEA)和50 μ M尼氟灭酸(NFA)组成的抑制剂鸡尾酒(IC)加入移液管中一个:正常pasmc和IPAH pasmc在20 mV步长+20至+100 mV的不同测试电位下的代表性电流记录(一个而且D，左)．综合电流-电压关系(I-V曲线)表明，这个辣椒素敏感通道的斜率电导对正常PASMC为131 pS, IPAH PASMC为135 pS (一个和D,正确的)．B而且E:正常pasmc在+80 mV下持续去极化所引起的细胞附着膜贴片中的代表性单位电流(B)及IPAH pasmc (E)暴露于载体(对照+鸡尾酒)、1µM辣椒素(CPS+鸡尾酒)或1µM辣椒素+ 10µM辣椒素(CPZ) +抑制剂鸡尾酒(CPS+鸡尾酒+CPZ)。C而且F:显示正常pasmc的稳态开放概率[P(o)]的柱状图(C)及IPAH pasmc (F)作为时间的函数B而且E,分别。n=每组3-4个细胞。
图4所示。
图4所示。
细胞外钙的去除2 +消除了辣椒素引起的[Ca2 +］cyt在PASMCs。一个而且B: [Ca .]变化的代表性个体痕迹2 +］cyt在细胞外注入500 μM(正常)和100 μM (IPAH)辣椒素之前和期间，细胞内灌注1.8 mM Ca2 +-含浴液或Ca2 +免费沐浴液。C而且D:代表[Ca .]变化的平均迹线2 +］cyt在细胞外注入500 μM(正常)和100 μM (IPAH)辣椒素之前和期间，细胞内灌注1.8 mM Ca2 +-含浴液或Ca2 +免费沐浴液。E而且F:500 μM辣椒素诱导[Ca2 +］cyt在正常和100 μM辣椒素诱导的[Ca2 +］cyt1.8 mM细胞外Ca的缺失和存在，IPAH中2 +（n= 60-90个细胞，3个独立实验)。＊P与1.8 mM Ca相比< 0.052 +．
图5所示。
图5所示。
将细胞外pH从7.4降低到5.9，[Ca2 +］cyt并显著增强辣椒素诱导的[Ca2 +］cytIPAH pasmc。一个:显示不同[Ca .]模式的代表性痕迹2 +］cyt当细胞外溶液pH值为7.4或5.9时，10 μM辣椒素(CPS)作用前后正常PASMCs的变化，[Ca2 +］cyt在5’-IRTX存在的情况下，当细胞外溶液pH值为5.9 (底)．B:显示不同[Ca .]模式的代表性痕迹2 +］cyt当细胞外溶液pH值为7.4或5.9时，IPAH PASMCs在10 μM CPS作用前后发生变化，[Ca2 +］cyt在5’-IRTX存在的情况下，当细胞外溶液pH值为5.9 (底)．C:显示[Ca . 2]增加幅度的汇总数据(平均值±SE)2 +］cyt在pH = 7.4或5.9时，在正常和IPAH pasmc中添加或不添加300 nM 5 ' -IRTX (n= 45-60个细胞，3个独立实验)。＊P< 0.05 vs. pH 7.4， #P< 0.05 vs. pH = 7.4和pH = 5.9。D:显示10 μM cps诱导[Ca2 +］cyt在pH = 7.4或5.9时，使用10 μΜ CPS，在正常和IPAH pasmc中添加或不添加300 nM 5 ' -IRTX (n= 45-60个细胞，3个分离实验)。＊P< 0.05 vs. pH 7.4， #P< 0.05 vs. pH = 7.4和pH = 5.9。E:显示[Ca .]增加的曲线下面积(AUC)的汇总数据(均值±SE)2 +］cyt在pH = 7.4或5.9时，在正常和IPAH pasmc中添加或不添加300 nM 5 ' -IRTX (n= 45-60个细胞，3个独立实验)。＊P< 0.05 vs pH = 7.4， #P< 0.05 vs. pH = 7.4和pH = 5.9。F:总结数据(均值±SE)显示10 μM cps诱导的[Ca2 +］cyt在pH = 7.4或5.9时，在正常和IPAH pasmc中添加或不添加300 nM 5 ' -IRTX (n= 45-60个细胞，3个独立实验)。＊P< 0.05 vs. pH = 7.4＃ P< 0.05 vs. pH = 7.4和pH = 5.9。
图6所示。
图6所示。
将细胞外温度从23°C提高到43°C， [Ca2 +］cyt并显著增强辣椒素诱导的[Ca2 +］cytIPAH pasmc。一个:有代表性的记录显示不同的[Ca .2 +］cyt细胞外溶液温度为23℃时，10 μM辣椒素(CPS)作用前后正常PASMCs的变化(左)或43°C (正确的)．B:具有代表性的个体记录，显示不同的[Ca .2 +］cyt细胞外液温度为23℃时，IPAH PASMCs在10 μM CPS作用前后的变化(左)或43°C (正确的)．C:显示[Ca . 2]增加幅度的汇总数据(平均值±SE)2 +］cyt在23或43°C没有(左)及与(正确的10 μM CPS(白色柱状)和IPAH(黑色柱状)n= 60-100个细胞，3-5个分离实验)。＊P与正常pasmc相比< 0.05，#P< 0.05 vs温度23°C。D:显示[Ca .]增加AUC的汇总数据(均值±SE)2 +］cyt在23或43°C没有(左)及与(正确的10 μM CPS(白色柱状)和IPAH(黑色柱状)n= 60-100个细胞，3-5个独立实验)。＊P与正常pasmc相比< 0.05，#P< 0.05 vs. 23°C。
图7所示。
图7所示。
渗透拉伸诱导[Ca2 +］cyt在IPAH PASMCs中部分通过5 ' - irtx敏感的TRPV1通道增加。一个: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cyt在正常和IPAH pasmc中应用低渗(200 mOsml/kg)溶液之前、期间(实心单杠)和之后。汇总数据(平均值±SE，正确的)显示低渗(200 mOsml/kg)介导的[Ca2 +］cyt在普通及IPAH pasmc (n= 3个独立的实验)。**P< 0.01比正常。B: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cyt在正常和IPAH pasmc中应用高渗(400 mOsml/kg)溶液之前、期间(实心单杠)和之后。汇总数据(平均值±SE，正确的)显示高渗(400 mOsml/kg)介导的[Ca2 +］cyt在普通及IPAH pasmc (n= 3个独立的实验)。＊P< 0.05。C:代表轨迹(左)显示[Ca .2 +］cyt在细胞外Ca存在或不存在的情况下，在应用低渗(200 mOsml/kg)溶液之前、期间和之后，IPAH PASMCs中都有明显的变化2 +．汇总数据(平均值±SE，正确的)显示低渗介导的[Ca2 +］cyt在IPAH pasmc中注入含有1.8 mM Ca的控制溶液2 +或Ca2 +游离溶液(n= 3个独立的实验)。**P与对照组相比< 0.01。D- - - - - -G: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cyt在没有或存在100 μ M La的情况下，在应用低渗(200 mOsml/kg)溶液之前、期间和之后，在IPAH pasmc中进行了测试3 +（D)， 300 nM 5 ' -IRTX (E)， 10µM地尔硫卓(F)，或10µM环匹onic acid (CPA) (G)．汇总数据(平均值±SE)正确的显示低渗介导的[Ca2 +］cyt在应用低渗(200 mOsml/kg)溶液之前(Cont)，期间和之后，在IPAH PASMCs中没有或有La处理3 +（D)， 5 ' -irtx (E)、地尔硫卓(F)，或注册会计师(G） (n=每人3个独立实验)。＊P< 0.05和**P与对照组相比< 0.01。
图8所示。
图8所示。
TRPV1的抑制减弱辣椒素-、酸性-和渗透拉伸诱导的[Ca2 +］cytIPAH pasmc。一个: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cytRNA (shRNA)和TRPV1 shRNA在转染的正常pasmc中构建。汇总数据(平均值±SE，左)显示辣椒素诱导的[Ca2 +］cyt对照组中正常的pasmc和转染scramble shRNA或TRPV1 shRNA的pasmc (n= 9-12个细胞，每个细胞3个独立实验)。B: [Ca .]变化的代表性痕迹2 +］cyt对照组将胞外液pH降至5.9前和过程中，scramble shRNA和TRPV1 shRNA转染正常pasmc。汇总数据(平均值±SE，左)显示酸诱导(pH = 5.9) [Ca .2 +］cyt对照组中正常的pasmc和转染scramble shRNA和TRPV1 shRNA的pasmc (n= 9-12个细胞，每个细胞3个独立实验)。C- - - - - -艾凡:有代表性的[Ca2 +］cyt在使用50 μΜ辣椒素之前和期间(C)、酸性细胞外溶液(pH = 5.9) (D)、低渗(200 mOsml/kg)溶液(E)和TRPV1 shRNA转染IPAH PASMCs。总结数据(均数±SE)显示[Ca2 +］cyt在对照组IPAH PASMCs和PASMCs中转染辣椒素激活的scramble shRNA和TRPV1 shRNA (C，左)、酸度(pH = 5.9) (D，左)和低渗透性(E，左） (n= 9-12个细胞，每个细胞3个独立实验)。＊＊＊P与对照和打乱相比< 0.001。F:对照pasmc中TRPV1蛋白表达水平的代表性Western blot图像(左)及IPAH pasmc (正确的)转染scramble shRNA和TRPV1 shRNA (n= 3)。
图9所示。
图9所示。
CREB磷酸化的增加与高的基础[Ca2 +］cyt辣椒素诱导的[Ca2 +］cytIPAH pasmc。一个: Western blot检测在低血清(0.1% FBS)培养基中培养的正常PASMCs和IPAH PASMCs中磷酸化CREB (pCREB)和总CREB (CREB)(左)。显示pCREB与总CREB比值(pCREB/CREB)的汇总数据(平均值±SE) (中间)和总CREB蛋白水平(正确的)和IPAH pasmc (n= 3). ** .P与正常pasmc相比< 0.01。B:显示基底[钙]分布的直方图2 +］cyt普通pasmc(开放式柱状图)和IPAH pasmc(深灰色柱状图)。基底[Ca2 +]在正常和IPAH pasmc中分别为81.94和120.66 nM。总结数据(平均值±SE)显示平均基础[Ca2 +］cyt正常情况下(n= 300个细胞)和IPAH (n= 600个细胞)pasmc (正确的)．＊＊＊P与正常pasmc相比< 0.001。C:经(+EGTA/BAPTA)或无(- EGTA/BAPTA) 2 mM EGTA和30 μ M BAPTA- am处理24 h IPAH PASMCs中pCREB和CREB的Western blot分析(前)．汇总数据(平均值±SE，底)显示对照IPAH pasmc和EGTA和BAPTA- am处理IPAH pasmc (+EGTA/BAPTA)的平均pCREB/CREB比值(n= 3). *** .P与对照组IPAH pasmc相比< 0.001。D: Western blot分析IPAH PASMCs经(+EGTA)或无(- EGTA) 2mm EGTA处理24 h后pCREB和CREB的变化(前)．汇总数据(平均值±SE，底)显示对照IPAH pasmc和EGTA处理IPAH pasmc的平均pCREB/CREB比值(n= 3). *P与对照组IPAH PASMCs相比< 0.05。E:剂量-反应曲线(前)和时间-过程曲线(底)研究辣椒素对正常和IPAH pasmc中pCREB/CREB比值的影响(n= 3)。数据以均值±SE表示。剂量反应实验中每次辣椒素处理的时间为15 min，时间过程实验中每次辣椒素处理的剂量为50µM (n= 3)。数据以均值±SE表示。F:用50 μ M辣椒素处理IPAH PASMCs，在2mm EGTA或EGTA + 30 μ M BAPTA-AM缺失(−)或存在(+)15 min时，pCREB和CREB的Western blot分析(左)．汇总数据(平均值±SE，正确的)显示对照IPAH pasmc和辣椒素处理IPAH pasmc在有无EGTA或EGTA加BAPTA-AM情况下的平均pCREB/CREB比值(n= 3). *P与对照组IPAH PASMCs和EGTA/BAPTA或EGTA处理IPAH PASMCs比较< 0.05。
图10所示。
图10所示。
辣椒素(Capsazepine, CPZ)可抑制IPAH PASMC增殖。一个而且B:核染色代表性图像(前， Hoechst，蓝色)，EdU染色(中间， AlexaFluor，红色)和叠加图像(底(紫色，覆盖层)将正常和IPAH pasmc在无(载体)或1、10和40 μM CPZ下孵育48小时。C而且D:显示包含EdU的细胞百分比的汇总数据(平均值±SE) (左)和占总细胞数的百分比(正确的)用于经车辆和cpz处理的普通和IPAH pasmc (n= 3个独立的正常和实验n= 9个独立的IPAH实验)。＊P< 0.05和***P与对照组和IPAH pasmc相比< 0.001。E:经载液-和10 μM cpz处理的正常细胞占总细胞数的百分比的汇总数据(均值±SE)左)及IPAH (正确的) pasmc 72小时(n= 3个独立的实验，分别为正常和IPAH pasmc)。＊P< 0.05和***P与对照组和IPAH pasmc相比< 0.001。F:代表性的Western blot图像(左)显示正常pasmc中TRPV1蛋白的表达水平(前)及IPAH pasmc (底)分别转染80 pM的scramble siRNA和40 pM和60 pM的TRPV1 siRNA (n= 3).汇总数据(平均值±SE) (正确的)显示80 pM scramble siRNA-和80 pM TRPV1 siRNA处理的正常和IPAH pasmc 48小时内总细胞数量的百分比(n= 3个独立的实验，分别为正常和IPAH pasmc)。＊P< 0.05和#P与scramble sirna处理的正常pasmc和IPAH pasmc相比< 0.05。
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