一波通过控制上皮细胞自我更新和分化调节肺泡形成的Wnt信号的出现
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- PMID:27880906
- PMCID:PMC5214982
- DOI:10.1016 / j.celrep.2016.11.001
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一波通过控制上皮细胞自我更新和分化调节肺泡形成的Wnt信号的出现
细胞代表．
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摘要
肺泡发生是肺发育的高潮，包括正确的时间和空间信号，以产生呼吸所需的微妙的气体交换界面。使用wnt信号报告系统，我们证明了在肺泡发生过程中出现的wnt反应性肺泡上皮细胞亚区，称为axin2+肺泡2型细胞，或AT2Axin2．AT2的编号Axin2细胞在肺发育后期显著增加，与肺泡形成期间的一波Wnt信号有关。转录组分析、体内克隆分析和体外肺类器官分析显示AT2sAxin2在肺泡形成过程中促进增强AT2细胞的生长。激活Wnt信号通路会导致AT2s的扩增，而抑制Wnt信号通路则会抑制AT2细胞的发育，并将肺泡上皮细胞的发育转向肺泡1型细胞系。这些发现揭示了一波wnt依赖的AT2扩张是肺泡发生和成熟所必需的。
关键词:Wnt;肺泡;细胞的命运;肺。
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数据
(A和B) TheAxin2CreERT2-TdTom在分支形态发生过程中，该等位基因在位于间充质和Nkx2.1 . +上皮近端和远端wnt -敏感(Axin2+)细胞(A)中产生TdTomato表达，(B)仅用RFP和DAPI染色显示相同的图像。白色虚线分别勾勒出气道远端和近端。(C) E10.5 in诱导重组Axin2CreERT2-TdTom: R26REYFP4天随访小鼠的结果表明，Axin2+细胞在近端和远端都产生了Nkx2.1+肺上皮，远端区域(黄色括号)标记有更多的细胞。(D和E)从E15.5-E16.5开始，标记的Axin2+细胞局限于远端Sox2−(D)， Sox9+ (E)肺上皮。(F-I) E17.5-E18, Axin2+肺上皮细胞稀疏分布于远端细支气管和肺泡上皮。细支气管Axin2+细胞主要为Scgb1a1分泌细胞(F)，极少有Tubb4+纤毛细胞(G)。肺泡区有少量Pdpn+ AT1s (H)和Sftpc+ AT2s (I)。在P4, Axin2+分泌(J)和纤毛(K)细支气管细胞和AT1s (L)变得非常罕见。然而，Axin2+ AT2 (AT2Axin2(N)对Axin2+分泌型(Scgb1a1+)和纤毛型(Tubb4+)细支气管上皮、AT2s (Sftpc+)和AT1s (Pdpn+)的定量分析显示，谱系特异性Axin2+ Wnt应答型肺上皮发生了显著变化。(O)在E18，少数Axin2+ Wnt应答上皮为Sftpc+。然而，到P4时，超过97%的Axin2+上皮细胞是Sftpc+ AT2谱系的亚系，即AT2Axin2s. F-M中的箭头表示阳性细胞，插图为放大倍数较高的Axin2+细胞。D=远端肺内胚层/上皮，P=近端肺内胚层/上皮。细胞数量的定量表示为平均值±SEM。双尾学生t检验:*P< 0.05, n.s =无统计学意义;每组N =3。比例尺= 50 μm。
(A)图形模型显示了肺发育过程中Axin2+ wnt反应性肺上皮细胞的动态变化。晚期肺发育的标志是Axin2+上皮细胞限制到远端肺泡和AT2显著增加Axin2肺泡形成过程中的细胞。而AT2很少Axin2在E17.5-E18.0 (B和C)， P1 (D和E)和P4 (F和G)显著增加细胞数量Axin2在P30 (H和I)继续观察细胞。虚线环绕Sftpc+ AT2和AT2Axin2插图C, E, G, i中的细胞(J-L)谱系追踪AT2Axin2E18.5至P10 (J)和P4至P10 (K)细胞AT2明显升高Axin2这些时间点之间的细胞膨胀。箭头表示阳性细胞，在(L)中定量。(M)经过24小时他莫西芬诱导后，通过FACS分离出的AT2s总数。(N)与E18.5相比，AT2s中P4处axin2mrna的表达增加了两倍。(O和P) Axin2+肺上皮细胞采用CD31和CD45(上FACS图)阴性选择和TdTomato和EpCAM(下FACS图)阳性选择分离。(P)通过流式细胞术，分离的Axin2+肺上皮细胞主要由AT2s组成Axin2细胞内Sftpc染色和细胞外Pdpn染色。定量细胞数量，qPCR数据，细胞类型百分比以均值±SEM表示。双尾学生t检验:P< 0.05;每组N =3-4。比例尺:B、D、F、H、J、K = 50 μm;C, E, G, I = 10 μm;J, K = 5 μm。
(A和B) AT2s中克隆扩增增强Axin2在alveologenesis。使用R26R跟踪沿袭Br2.1记者,at₂Axin2可以比一般的AT2谱系更大程度的无性扩展。箭头表示单细胞克隆，虚线圆表示两个细胞克隆，实线圆表示三个细胞克隆。注意AT2中的三个细胞克隆Axin2谱系跟踪相对于Sftpc+谱系跟踪中的两个细胞克隆。(C)定量地，平均AT2Axin2克隆体的大小一般比at2大。(D)在AT2s中克隆大小的分布向更多的2个和3个细胞克隆转移Axin2与AT2的总数量相比。(E-H)通过EdU加入P4对增殖的评估表明，大多数AT2sAxin2与少数Axin2- AT2s相比，它们都在积极增殖。箭头代表EdU+ AT2sAxin2，箭头为EdU+ Axin2−AT2s。(I)平均克隆大小和EdU+ AT2s百分比的量化用均值±SEM表示，大小分布用占总克隆的%表示。双尾学生t检验:*P< 0.05, Fisher精确检验:**PAT2s < 0.007, n=5(58个克隆)Axin2， n=4(191个克隆);双尾学生t检验:***P< 0.05, n=3，每只老鼠有10个独立的视野。比例尺:A、B = 50 μm, E-H = 5 μm。
(A)主成分分析说明了AT2的独特分离Axin2从AT2总人口数的子人口数。(B)比较AT2总体和AT2的微阵列分析Axin2亚谱系显示AT2中细胞周期、血管发育和细胞外基质相互作用的上调基因富集，代谢和脂代谢相关基因的产生和下调Axin2sublineage。(C-L)对影响肺泡生长和分化的重要基因的qPCR分析证实了所选基因的芯片检测结果。qPCR数据定量用均值±SEM表示。双尾学生t检验:*P< 0.05，每组n=4。
(a - c) at₂Axin2与传代0 (P0)和传代1 (P1)的总AT2s相比，显示肺泡类器官形成集落形成效率增加。到了第二和第三段(P2-P3)，这些差异不再显著。(D和F)苏木精和伊红(H&E)染色显示AT2s和AT2s的类器官结构Axin2．(E和G)分别对AT2和AT1标记物、Sftpc和Pdpn进行免疫组化染色，显示AT2s和AT2s总数Axin2由分化的at2和at1组成。(H-L) Wnt3a处理增加CFE，而IWP2处理抑制AT2衍生类器官的CFE。IWP2和Wnt3a的治疗表明，外源性Wnt配体在一定程度上可以缓解这种抑制。CFE的定量表示为平均CFE±SEM。双尾学生t检验:*P< 0.05, A-I组在4个独立实验中每组n > 3, J-N组在3个独立实验中每组n > 2。
(A-C)当谱系追踪从P4到P30时，Wnt信号的激活增加了肺泡上皮细胞总数和AT2细胞数量SftpcCreERT2: Ctnnb1+/+控制老鼠。肺泡区Nkx2.1+和Sftpc+细胞总数均增加。(D-F) Ki67染色测定的增殖增加SftpcCreERT2: Ctnnb1fl(要是)/ +突变体与对照组比较。箭头表示Ki67+ Sftpc谱系标记细胞。(G-J) Wnt在AT2s中的激活导致AT2s的克隆扩增，表现为每个克隆的细胞数量增加和克隆大小增加。请注意，与G. (K-M)中的YFP和RFP克隆相比，H中的CFP克隆更大。AT1细胞分化不受AT2s中Wnt信号激活的影响，YFP谱系标记和Aqp5的共染色可见。细胞数量计数、%Ki67+、平均克隆大小和% YFP+细胞的定量表示为平均值±SEM。双尾学生t检验:*P< 0.05, n >每组4个;双尾学生t检验:**P< 0.05, Fisher精确检验:***P<0.05, n=142个克隆SftpcCreERT2: Ctnnb1+/+n=258克隆SftpcCreERT2: Ctnnb1fl(要是)/ +突变体。
(A-C)增殖减少SftpcCreERT2: Ctnnb1fl / fl与对照组相比，P4 - P30缺失β-catenin后AT2s突变。(D-F) Wnt信号丢失SftpcCreERT2: Ctnnb1fl / fl: R26RBr2.1从P4到P30的突变体导致肺泡发生过程中向AT1s分化的增加，这可以通过显示AT1细胞扩散和扁平形态的克隆的增加来说明。(G-I)这些数据是用R26RmTmG用Aqp5共免疫染色勾勒出AT1细胞的细胞表面。(J)图示再现Wnt信号在肺泡发生过程中平衡上皮细胞生长和分化中的作用。Ki67+的百分比、克隆的平均百分比和YFP+细胞的百分比用均值±SEM表示。双尾学生t检验:*P< 0.05, n >每组4个;双尾学生t检验:**P< 0.05，对照组n=133个克隆，对照组n=203个克隆SftpcCreERT2: Ctnnb1fl / fl突变体。
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