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。 2015年11月,485:330-9。
doi: 10.1016 / j.virol.2015.08.010。 Epub 2015年8月29日。

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒E蛋白运输钙离子和激活NLRP3 inflammasome

何塞·L Nieto-Torres1, 《布兰诗歌Verdia-Baguena2, Jose M Jimenez-Guardeno1, 何塞一个Regla-Nava1, 卡洛斯Castano-Rodriguez1, 劳尔Fernandez-Delgado1, Jaume托雷斯3, 韦森特米Aguilella4, Luis Enjuanes5
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严重急性呼吸系统综合症冠状病毒E蛋白运输钙离子和激活NLRP3 inflammasome

何塞·L Nieto-Torreset al。 病毒学。 2015年11月。
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文摘

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(冠)信封(E)蛋白质是viroporin参与毒性。E蛋白离子通道(IC)活动是专门与增强肺损伤、水肿积累和死亡。IL-1β驱动proinflammation与病理特征有关,然而其链接到IC活动仍然未知。在这个报告中,我们表明,冠E蛋白形式protein-lipid渠道ERGIC /高尔基体膜对钙离子渗透,从未报道一个高度相关的特征。钙离子与pH值调制E蛋白孔隙和选择性。有趣的是,E蛋白IC活动推动了激活NLRP3 inflammasome,导致IL-1β生产过剩。运输通过E钙蛋白IC的主要触发这个过程。这些发现惊人链接冠E蛋白IC感应离子干扰免疫病理的后果在细胞水平和疾病恶化在受感染的有机体。

关键词:钙;冠状病毒;E蛋白;Inflammasome;离子通道;发病机理;冠状的;Viroporin。

数据

图1
图1
冠E蛋白CaCl IC活动2解决方案。(A)当前录音显示强度跳跃(以pA)对应于一个或多个频道的装配和拆卸中性DPhPC膜。(B)直方图代表不同的电流强度的跳跃和各自的频率记录在中性膜。电导(G),电流强度和应用电压之间的比率,也表示(以pS)。当前跳跃(C)及其对应的直方图(D)测量ERGIC /高尔基体膜。(E)单通道电导变化的解决方案包含CaCl浓度增加2。红色圆圈表示的数据从ERGIC中性膜和蓝色的圆圈值/高尔基体膜。从三个独立的实验误差显示标准差。
图2
图2
Ca2 +选择性冠状E蛋白通道。渗透率比主成分分析2 +/ PCl−在中性DPhPC(红色列),ERGIC /高尔基(蓝色列)或带负电荷DPhPS膜(绿色列)。虚线代表的渗透比率值一个假想的中立的孔隙。值高于线代表阳离子选择性,下面那些对应于阴离子选择性。误差标准差。
图3
图3
通过Ca调制冠E蛋白通道选择性2 +。(A)逆转潜在(Erev)以不对称(500毫米| 50毫米)在添加毫克分子CaCl氯化钾的解决方案2浓度。两个进行了一系列的实验:在中性DPhPC(红色圆圈)和带负电荷的DPhPS膜(绿色方块)。虚线显示Erev值对应的离子通道。(B) pH值对E蛋白的影响Erev氯化钾相同条件下测量上述中性(红色圆圈)和带负电荷的膜没有(绿色方块)或CaCl 15毫米的存在2(橙色方块)。虚线显示Erev值对应的离子通道。误差线代表标准偏差从三个独立的实验。
图4
图4
在CaCl非典冠状E蛋白的突变抑制电导2。在100毫米CaCl单通道电导测量2,在缺乏任何肽(C−,灰色的列),或野生型冠E蛋白的存在跨膜域肽(WT、黑列),或突变肽N15A(红色列)和V25F(蓝色列)。误差棒表示标准偏差。
图5
图5
Inflammasome通过冠E蛋白激活离子通道的活动。的组件NLRP3 inflammasome(影响力),NLRP3 (NLRP3-HA), ASC (ASC-mCherry) procaspase-1 (procaspase-1-Myc)和pro-IL-1β转染州立E6细胞,在没有或存在冠E蛋白(IC+没有(IC)或−)离子通道的活动。 启德集团 1 − 代表了N15A突变 启德集团 2 − 表示V25F突变。作为一个消极的控制,细胞转染只与pro-IL-1β(C−)。(一)免疫印迹显示inflammasome复杂的组件和E蛋白的存在在州立E6细胞溶解产物。β-Actin也发现加载控制。(B)活性水平IL-1β出现在细胞上清液。误差线代表标准偏差从三个独立的实验。统计上显著的数据表示两个星号(学生׳年代t以及p值< 0.01)。
图6
图6
通过冠E蛋白Ca Inflammasome激活2 +通道的活动。(A) inflammasome复杂(影响力)重组与野生型细胞没有或E蛋白(启德集团+)浓度的增加(μM)细胞的渗透2 +螯合剂BAPTA-AM。添加DMSO -控制(−)。活动IL-1β出现在细胞的水平媒体通过ELISA测定。(B)的激活inflammasome Ca2 +离子载体ionomycin。从三个独立的实验误差代表标准差;统计上显著的数据表示两个星号(学生׳年代t以及p值< 0.01)。(C)细胞MTT分析可行性。光学密度(OD)代表细胞代谢活动在不同的实验条件下测定570海里。
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