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。 2015年8月1日,192(3):324 - 36。
DOI：10.1164 / rccm.201410-1765OC。

人间充质的治疗作用干细胞的微泡在重症肺炎小鼠

安托万Monsel123., 迎朱刚3., 斯特凡·贺源内3., 七号3., 淑玲胡3., 让-雅克•Rouby1, 米歇尔Rosenzwajg2, 迈克尔一个Matthay3., Jae W李3.
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人间充质的治疗作用干细胞的微泡在重症肺炎小鼠

安托万Monsel等。 牛J和呼吸暴击护理医学。 。
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摘要

理由是:微泡(MVs)是从核内体室释放或从表面膜脱落的无核细胞碎片。我们和其他研究人员证明，间充质干细胞(MSCs)释放的MVs在炎症损伤(如内毒素诱导的急性肺损伤)中与细胞本身一样有效。然而，MVs在急性肺损伤感染模型中的治疗效果尚不清楚。

目标：我们严重的细菌性肺炎后，研究了肺部炎症，蛋白的通透性，细菌清除，和人类生存的MV MSC的影响。

方法:我们测试对小鼠大肠埃希氏菌肺炎的人类干细胞衍生的MV效果。我们还研究了MV和人单核细胞和人体之间的相互作用肺泡上皮型2细胞。

测量和主要结果:MV的施用源自人MSC部分通过角质细胞生长因子的分泌改善存活和减少炎症细胞，细胞因子，蛋白质的涌入，以及在小鼠中的细菌与细菌性肺炎受伤。在人单核细胞或肺泡2型细胞的原代培养物，MV的摄取是通过CD44受体，其是用于治疗性效应所必需的介导。的MV增强，同时减少炎性细胞因子分泌的细菌的单核细胞的吞噬作用和肺泡上皮型2细胞受伤增加的胞内ATP水平。与toll样受体3激动剂MSC的预刺激进一步增强释放的MV的治疗效果。

结论:从人骨髓间充质干细胞中提取的骨髓间充质干细胞在重症细菌性肺炎中与母源干细胞同样有效。

关键词:急性呼吸窘迫综合征;细菌性肺炎;间充质干细胞;微泡。

数字

图1所示。
图1所示。
从人间充质干细胞释放的微泡（MVS）的表征（MSCS）（MSC的MV）。(一个血清饥饿后，人骨髓间充质干细胞组成性释放MVs (箭头），小膜封闭从质膜体（规模的酒吧 = 1 μm).插入显示纯化的间充质干细胞MVs为均匀的球状粒子群(规模的酒吧= 2μm)。(B)用于小动物研究的治疗剂量——90°l间充质干细胞MVs的蛋白浓度与之前文献中使用的间充质干细胞MVs的剂量相似。MSC MVs中含有大量的总RNA。MSC的MV蛋白和RNA含量分别用mean±SD表示，分别为总蛋白(gen g/90 mol e)和总RNA (ng/90 mol e)(蛋白n = 24;RNA含量n = 7)。(C)对MSC MVs的Western blot分析显示CD44水平显著，CD44是一种受体，之前参与MSC转运到炎症部位。与间充质干细胞相似，我们推测间充质干细胞MVs通过CD44受体定位于损伤组织。分子量。
图2。
图2。
角质形成细胞生长因子(KGF)介导的间充质干细胞(MSC)微囊(MVs)对重症患者生存的影响大肠杆菌肺炎小鼠。MV的静脉给药小鼠从改善的MSC（MSC的MV）公布的生存严重大肠杆菌肺炎使用MSC MVs中和性KGF抗体则取消了这种治疗效果。(一个MSC或MSC的MV的）管理显著提高存活率超过72小时。*P < 0.01 versus phosphate-buffered saline (PBS),# P与正常人肺成纤维细胞(NHLF) mv治疗组比较，< 0.05__ P < 0.05 versus PBS by log-rank test. (B）逆转录酶表明MSC的MV表示KGF信使RNA聚合酶链式反应。以甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，对RNA样品进行正装。PCR产物的大小KGF 210基点。(C）MSC MV的静脉内施用中的支气管肺泡灌洗液（BAL）增加了人类KGF蛋白水平大肠杆菌在18小时时，它完全不会受到细胞内MV KGF蛋白水平占-injured小鼠;lysates of 90 μl of MVs yielded only 16.5 ± 5.4 pg total of KGF protein. Data are shown as mean ± SD for each condition (n = 29 for PBS, n = 12 for MSCs, n = 22 for MVs released from standard mesenchymal stem cells, and n = 10 for polyinosine-polycytidylic acid [Poly (I:C)] MVs). ***P < 0.01 versus the Poly (I:C) MV group by ANOVA (Bonferroni). (D)一个dministration of an anti-KGF neutralizing antibody with the MSC MVs significantly decreased survival over 72 hours compared with the MSC MV + control IgG–treated group. *P < 0.01 versus PBS;✔ P < 0.01 versus MSC MV + anti-KGF antibody–treated group by log-rank test. MV + IgG = MVs released from MSCs combined with control IgG antibody; MV + anti-KGF Ab = MVs released from MSCs combined with an anti-KGF neutralizing antibody; NHLF MV = MVs released from normal human lung fibroblasts.
图3。
图3。
从骨髓间充质干细胞的炎性细胞的涌入和炎症后释放（MSCS）（MSC的MV）的微泡（MVS）的影响。大肠杆菌诱导急性肺损伤小鼠。静脉内和人MSC MV的气管内给药减少炎症细胞和肺蛋白渗透性的涌入在肺泡损伤后大肠杆菌肺炎(一个）MSC MV的静脉内给药在支气管肺泡灌洗（BAL）液的减少总的白血细胞（WBC）和中性粒细胞计数大肠杆菌在24小时时-injured小鼠。Data are shown as mean ± SD for each condition (n = 21 for sham, n = 20 for phosphate-buffered saline (PBS), n = 6 for MSCs, n = 22 for MSC MVs, and n = 5 for normal human lung fibroblast [NHLF] MVs). *P中性粒细胞计数的ANOVA (Bonferroni)与PBS比较< 0.05，**P < 0.01 versus PBS;✔ P < 0.05 versus NHLF MV group by ANOVA (Bonferroni) for total WBCs. (B）静脉MSC的MV与损伤小鼠的BAL液中减少肺蛋白渗透性和MIP-2水平大肠杆菌pneumonia at 24 and 18 hours, respectively (n = 17–21 for sham, n = 19–22 for PBS, n = 6–9 for MSCs, n = 14–20 for MSC MVs, and n = 5–14 for NHLF MVs). *P < 0.05 versus MSCs for protein concentration by ANOVA (Bonferroni), ***P < 0.01 versus PBS, and✔ P < 0.05 versus NHLF MVs. (C）气管内MSC MV施用降低总的WBC，中性粒细胞计数，并且蛋白质浓度在BAL液大肠杆菌在24小时时-injured小鼠。Data are shown as mean ± SD for each condition (n = 2–3 for sham, n = 5–20 for PBS, n = 9–14 for MSC MVs, and n = 5 for NHLF MVs). MIP-2 = macrophage inflammatory protein-2.
图4。
图4。
（MVS）的间充质干细胞（MSCs）（MSC的MV）发布了肺损伤微泡行政的影响后严重大肠杆菌肺炎小鼠。(一个)经组织学评估，静脉注射间充质干细胞MVs或MSCs可显著改善肺损伤。苏木精和伊红染色的肺切片在18小时显示中性粒细胞内流、水肿、壁增厚和空域充血减少。(B通过半定量得分评估）肺损伤是由MSC或MSC MV治疗减少。Data are shown as mean ± SD for each condition (n = 4–5). *P < 0.01 versus phosphate-buffered saline (PBS),✔ P < 0.01 versus the normal human lung fibroblast (NHLF)-treated group, and__ P < 0.01 versus MSCs by Kruskal-Wallis test (Dunn).
图5。
图5。
效果从总细菌负荷的间充质干细胞（MSC）（MSC MVS）释放的微泡（MVS）的。人MSC MV的静脉内给药在肺泡空间减小的总细菌负荷（一个)、肺组织(B)，及血液(C）后大肠杆菌肺炎人MSC MV的气管内给药数值减少总肺泡细菌负荷（D）和显著降低菌血症的发生率（E)。(一个）静脉MSC的MV减少在小鼠受伤总肺泡细菌负荷大肠杆菌肺炎在18小时时。Total bacterial counts were expressed as mean (colony-forming unit [cfu] counts/ml) ± SD for each condition (n = 15 for phosphate-buffered saline [PBS], n = 9 for MSCs, n = 11 for MSC MVs, and n = 7 for normal human lung fibroblast [NHLF] MVs). *P < 0.05 versus PBS;✔ P经Kruskal-Wallis检验(Dunn)与NHLF MV组比较< 0.05。(B）静脉MSC的MV在由损伤小鼠的肺匀浆减少细菌总负载大肠杆菌肺炎在18小时时。Total bacterial counts were expressed as mean (cfu counts/ml) ± SD for each condition (n = 9 for PBS; n = 8 for MSC MVs). *P < 0.05 versus PBS group by Mann–Whitney test. (C）用PBS相比，MSC MV处理组是没有菌血症在18小时时。总细菌计数表示为单独的标绘值（CFU计数/ ml）的（在酒吧表示每个条件的值;n = 10 for both groups). (D)气管内间充质干细胞MVs数值降低了肺泡损伤小鼠的总细菌负荷，并降低了小鼠血中细菌负荷大肠杆菌肺炎24小时。(E）总细菌计数表示为单独的标绘值（CFU计数/ ml）的（在酒吧表示每个条件的值;n = 5 for PBS, n = 9 for MSC MVs, and n = 5 for MVs released from NHLFs [NHLF MVs]). BAL = bronchoalveolar lavage.
图6。
图6。
CD44在从间充质干细胞(MSC)释放的微泡摄取到原代培养的人单核细胞和人肺泡上皮2型细胞中的作用。在人单核细胞和人肺泡上皮2型细胞中，细胞间充质干细胞MV的摄取都依赖于CD44，细胞表面透明质酸受体。(一个）LPS刺激增加的荧光标记的MSC的MV摄取到单核细胞，这是依赖于在所述的MV CD44受体。Fluorescence intensity was expressed as mean (arbitrary units) ± SD for each condition (n = 352–477 cells for all groups). *P< 0.01相对于LPS−，__ P< 0.01与cd44预培养的间充质干细胞MVs比较，和§ P < 0.01 versus IgG preincubated MSC MVs by ANOVA (Bonferroni). Photomicrographs display the pattern of fluorescence levels observed in each experimental condition.规模的酒吧 = 20 μm. (B利用绿色荧光蛋白转染的间充质干细胞释放的MVs，我们证实脂多糖刺激了间充质干细胞MVs的摄取(n = 269-343)。*P < 0.01 versus LPS− by Student’st测试。显微照片显示在两种实验条件下观察到的荧光水平（绿色荧光蛋白）的图案。规模的酒吧 = 20 μm. (C)Stimulation by LPS with an inflammatory injury (cytomix + LPS) increased the uptake of fluorescent-labeled MSC MVs into alveolar epithelial type 2 cells, which was dependent on the CD44 receptor on the MVs. Fluorescence intensity was expressed as mean (arbitrary units [A.U.]) ± SD for each condition (n = 179–239 cells for all groups). *P < 0.01 versus cytomix− LPS−,__ P< 0.01与cd44预培养的间充质干细胞MVs比较，和§ P < 0.01 versus IgG preincubated MSC MVs by ANOVA (Bonferroni). Photomicrographs display the pattern of fluorescence levels observed in each experimental condition.规模的酒吧 = 20 μm. (D阻断间充质干细胞MVs上的CD44受体可降低小鼠的存活率大肠杆菌MVs与IgG对照抗体阻断肺炎(MV + IgG = 21, MV + CD44ab = 33)比较。*P < 0.01 versus MV + IgG by log-rank test. Ab = antibody.
图7。
图7。
通过对人单核细胞和人原代培养的间充质干细胞（MSC）（MSC MVS）释放肺泡上皮2型（ATII）细胞的微泡（MVS）的作用效果。(一个骨髓间充质干细胞MVs处理人血单核细胞24小时增加大肠杆菌24％的细菌清除。Total bacterial counts are expressed as mean (% of phosphate-buffered saline [PBS]) ± SD for each condition (n = 46 for PBS, n = 12–13 for MVs released by normal human lung fibroblasts [NHLFs] [NHLF MVs] or MSCs, and n = 26 for MSC MVs). *P < 0.05 versus PBS, **P < 0.01 versus PBS, and✔ P方差分析(Bonferroni)显示NHLF MVs < 0.01。(B间充质干细胞MVs减少了30%的单核细胞肿瘤坏死因子(TNF- TNF)的分泌。TNF-细胞的分泌水平以平均(PBS的%)±SD表示(PBS n = 21, NHLF MVs或MSCs n = 10, MSC MVs n = 15)。* * *P< 0.01与PBS比较，****P < 0.01 versus PBS, and✔ PANOVA (Bonferroni)对MSCs的影响< 0.01。(C) MSC MVs在48小时内恢复了炎性损伤(巨细胞)的人ATII细胞内ATP水平(每个条件下n = 11-14)。
图8。
图8。
间充质干细胞的效果（MSC）预处理聚肌苷 - 聚胞苷酸[聚（I：C）]，toll​​样受体3（TLR3）的激动剂，对信使RNA（mRNA）的表达为环加氧酶2（COX2）和IL-10在MSC和其释放的微泡（MVS），并在暴露于由聚（I：C）的MV释放的单核细胞的MSC -pretreated（MSC MVS）。在这些实验中，总RNA从人MSC萃取（B,C），MSC的MV（D），或人单核细胞（E,F），进行和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。最佳：半定量RT-PCR产物的代表性琼脂糖凝胶从COX2（B,D,E）和IL-10（C,F) mRNA放大。以甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，对RNA样品进行正装。PCR产物COX2为295 bp, IL-10为500 bp。底部：光密度读数从PCR凝胶衍生的。The band density relative to that of the GAPDH is expressed as mean ± SD. (一个）人MSC表达TLR3。(B,CC）1小时，血清饥饿48小时：）人类MSC用或不用聚（I培养。TLR3 stimulation further increased the expression of COX2 and IL-10 mRNA in MSCs [n = 8–22 for standard control (STD MSCs) and Poly (I:C)–stimulated MSCs]. *P< 0.01由学生t测试。(D)TLR3 stimulation also further increased the mRNA expression for COX2 in the released MVs, Poly (I:C) MVs (n = 10 for MVs released from standard MSCs [STD MVs] and MVs released from MSCs prestimulated with Poly (I:C) MVs [Poly (I:C) MVs]). *P < 0.01 by Mann–Whitney test. (E,F)mRNA expression for COX2 and IL-10 was increased in human monocytes exposed to Poly (I:C) MVs (n = 5–8). *P< 0.01由学生t测试。
图9。
图9。
单核细胞暴露于来自多肌苷-多胞苷酸[Poly (I:C)]刺激的间充质干细胞(MSCs)的微囊(MVs)后，细菌吞噬指数升高，炎症细胞因子分泌减少。(一个- - - - - -C具有代表性的吞噬作用大肠杆菌细菌通过人类单核细胞暴露于磷酸盐缓冲盐水（PBS）（一个，对照），MVS从标准的MSC（STD的MV释放）（B)，或用Poly (I:C)预刺激MSCs释放的MVs [Poly (I:C) MVs] (C)。规模的酒吧 = 5 μm. (D- - - - - -F人类单核细胞暴露于多聚(I:C) MVs后表现出较高的单核细胞活性大肠杆菌细菌清除能力与性病MV治疗相比（D)。虽然吞噬率两组相似（E）中，用聚（I处理：C）的MV进一步增加了细菌吞噬作用指数与STD的MV处理（比较F)。数据以mean±SD表示[n = PBS 5-13, STD MVs n = 6-22, Poly (I:C) MVs n = 6-19]。* * *P < 0.01 versus PBS;✔ PANOVA (Bonferroni)检测STD MVs < 0.01。(G,H) Poly (I:C) MVs进一步降低肿瘤坏死因子(TNF- TNF)的含量，增加单核细胞分泌IL-10水平[n = 11-13 PBS, n = 11-12 STD MVs, n = 11-20 Poly (I:C) MV]。* *P< 0.01与PBS比较，***P < 0.01 versus PBS, and✔ PANOVA (Bonferroni)检测STD MVs < 0.01。(我)在受伤的小鼠中大肠杆菌在肺炎、静脉注射Poly (I:C) MVs与STD间充质干细胞MVs相比，可进一步降低肺泡细菌负荷。每种情况下的细菌总数以平均值(STD间充质干细胞MVs的%)±SD表示[STD间充质干细胞MVs的n = 14];对于Poly (I:C) MVs n = 8]。支气管肺泡灌洗术。
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