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． 2015年4月7日;21(4):596-608。
doi: 10.1016 / j.cmet.2015.03.010。

BMPR2在复氧过程中保护线粒体功能和DNA，促进内皮细胞存活并逆转肺动脉高压

伊莎贝尔Diebold1， 简·K·亨尼格斯1， Kazuya Miyagawa1， 李彩云1， 镍镍1， 马克Kaschwich1， 曹爱琴告诉我们1， 菱王1， Sushma Reddy2， 发夹陈1， Kiichi Nakahira3.， Miguel A Alejandre Alcazar1， 瑞秋·K·霍珀1， Lijuan霁2， 布莱恩·J·费尔德曼2， 玛琳因4
从属关系
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BMPR2在复氧过程中保护线粒体功能和DNA，促进内皮细胞存活并逆转肺动脉高压

伊莎贝尔Dieboldet al。 细胞金属底座． ．
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摘要

线粒体功能障碍、炎症和突变的骨形态发生蛋白受体2 (BMPR2)与肺动脉高压(PAH)有关，PAH是一种以肺动脉(PA)内皮细胞(EC)凋亡、微血管减少和闭塞性血管重塑为特征的不治之症。我们假设BMPR2减少诱导PAEC线粒体功能障碍，促进促炎症或促凋亡状态。BMPR2 EC缺失的小鼠出现缺氧诱导的肺动脉高压，与非转基因小鼠相比，肺动脉高压在复氧后不会逆转，并与PA微血管和肺EC p53、PGC1α和TFAM(线粒体生物发生的调节因子和线粒体DNA)减少有关。在复氧过程中通过siRNA降低PAEC BMPR2抑制p53、PGC1α、NRF2、TFAM、线粒体膜电位和ATP，诱导线粒体DNA缺失和凋亡。在常氧状态下减少PAEC BMPR2会增加p53、PGC1α、TFAM、线粒体膜电位、ATP产生和糖酵解，并诱导线粒体裂变和促炎状态。这些特征在BMPR2突变的PAH患者的PAECs中得到了总结。

利益冲突声明

两位作者没有相互冲突的经济利益。

数据

图1
图1所示。EC-Bmpr2−−/小鼠表现为未解决的肺动脉高压
EC-Bmpr2−−/（KO)和野生型(WT)小鼠暴露于三周的缺氧(10% O2)和4周的常氧再充氧(缺氧-再充氧，Reoxy)，或在常氧条件下安置7周。我们测量(一)右心室收缩压(RVSP);(B)右心室(RV)肥厚(右心室/左心室和室间隔重量)(RV/LV+S)，(C)肺泡壁和导管水平的肺动脉肌肉化，%完全或部分肌肉化的动脉(D)每100个肺泡在导管和壁水平处有动脉。(E-K)从这些小鼠中分离肺内皮细胞(E)caspase3/7荧光法检测细胞凋亡(F)线粒体膜电位(Δψ米)使用TMRE荧光探针，(G)MitoSOX产生线粒体ROS(H)二氢乙二(DHE)测定总活性氧(ROS)。具有代表性的免疫印迹和相对密度分析(我)p53,(J)PGC1α和BMPR2，以及(K)TFAM以β-肌动蛋白为加载对照。Bars= (A) n=5的平均值±SEM, WT/KO常氧;n=7, WT Reoxy, n=10, KO Reoxy， (B) n=4, WT;n=3, KO常氧;n=5, WT Reoxy;n=7, KO Reoxy;(c g) n = 3;(H) n = 9;(我)n = 6;(J) n=5， (K) n=4。 *, **, ***, P<0.05, <0.01 and <0.001 comparing genotypes under the same condition, and #, ## and ###, P<0.05, <0.01 and <0.001 comparing the same genotype across conditions. Analyses performed by two-way ANOVA and Bonferonni post-hoc or, as indicated by (), Neuman-Keuls. See also Fig. S1.
图2
图2。BMPR2调控p53和PGC1α
市售人PAEC经(一)BMPR2 (B2) siRNA，(B)p53 siRNA或(C)B2和p53 siRNA或非靶向(Con) siRNA和暴露于缺氧(0.5% O2)持续48小时，然后在常氧状态下(21% O2) 48小时，即缺氧-复氧(Reoxy)，或在常氧(21% O2) 96小时。(D-F)Δψ米转染的PAEC中(D)B2核,(E)p53 siRNA和(F)PGC1α (PGC) siRNA与Con siRNA用荧光探针JC-1检测(D, F)或TMRE(E)(胃肠道)。Caspase3/7在转染的PAEC中的发光(G)B2,(H)p53或(我)PGC1α siRNA vs.非靶向(Con) siRNA。bar = (A) n=5， (B-H) n=3， (I) n=4的均值±SEM。图1()图例中的分析反映了Tukey或Neuman-Keuls事后检验。另见图S2。
图3
图3。在常氧状态下降低BMPR2可诱导炎症反应
在常氧和缺氧-复氧(Reoxy)条件下，用B2或Con siRNA转染PAEC，如图2所示。(一)DHE荧光法测定ROS。(B)用B2或Con siRNA转染PAEC，用antiycin (AA, 10µM)或载体(Veh)在常氧条件下处理1h。(C)IL8 mRNA和(D)白细胞介素6 mRNA。(E)在常氧和AA处理下，B2或Con siRNA转染PAEC BMPR2、IL6和IL8 mRNA。(F)B2 siRNA或B2+TFAM siRNA转染PAEC的BMPR2、TFAM和IL8 mRNA水平。所有mRNA归一化为β-Actin, Bars=Mean±SEM, n=3，分析如图1和图2所示。
图4
图4。在缺氧-复氧过程中，减少BMPR2会导致mtDNA缺失，这与TFAM减少和caspase活性升高有关
在常氧或缺氧-复氧(Reoxy)条件下转染的PAEC中TFAM的代表性免疫印迹和密度测定(一)B2(B)PGC1α (PGC)和(C)NRF2 siRNA vs. Con siRNA。(D)MitoTracker Green染色测定线粒体形态、碎片指数和总数的共聚焦图像a . (E)总mtDNA/核DNA (18S)。mtDNA 4977bp缺失在2%琼脂糖凝胶上显示为352bp扩增子(F)q-RT-PCR检测(G)转染B2 siRNA后。(H)用TFAM (TF)转染PAEC vs. Con siRNA。在常氧和复氧条件下，用caspase活性检测细胞凋亡和右侧的代表性免疫印迹。bar = n=3的均值±SEM，分析结果如图1所示。另见图S3。
图5
图5。BMPR2的缺失改变了肺动脉内皮细胞的线粒体功能和葡萄糖利用
转染B2 siRNA或非靶向(Con) siRNA的人PAEC耗氧率如图2所示。(一)基线和(B)FCCP治疗后最大呼吸量(C)呼吸能力不足(D)来源于线粒体ATP的产生。测量细胞外酸化率以确定(E)有氧糖酵解和(F)用10mM葡萄糖和1µM寡霉素依次处理后的糖酵解储备。(G)在相同条件下，100mM 2-脱氧葡萄糖处理后无糖酵解酸化。bar = (A-G) n=3的均值±SEM，分析如图1所示。
图6
图6。肺动脉高压患者的肺动脉内皮细胞在常氧状态下表现为促炎症状态，在缺氧-复氧状态下表现为促凋亡状态
来自患者(PAH)或未使用供体(Don)肺的PAEC作为对照，在常氧或缺氧-复氧方案(Reoxy)下孵育。(两者)用β-肌动蛋白作为负载对照，进行代表性免疫印迹和定量密度测定(一), PGC1α(B)和TFAM(C) (D)。JC-1的线粒体膜活性，(E)通过DHE荧光(DHE Fluor)产生ROS，(F)代表4977bp mtDNA缺失的扩增子，以及(G)caspase活性诱导细胞凋亡。IL8的qRT-PCR见(H)而且(我)．为了评估TLR-9对IL8的激活，在常氧条件下，在供体和PAH PAEC中使用抑制剂(inh, ODN TTAGG)或载体(veh)(我)．酒吧=意味着±SEM, n = 3。如图1所示，()通过Neuman-Keuls (C, F, G)或Fisher LSD (H)表示显著性。
图7
图7。工作模型:bmpr2信号与线粒体功能之间的联系
在常氧状态下，PAEC中BMPR2的缺失增强了线粒体生物发生，由p53 PGC1α， NRF2和TFAM驱动，增加Δψ米和ATP，糖酵解，导致裂变，并通过白细胞介素如IL8引起促炎状态。TFAM的增加似乎部分减轻了IL8的增加。缺氧后复氧期间BMPR2的损失损害p53依赖的PGC1α和TFAM的调节，降低Δψ米和ATP，引起线粒体裂变和线粒体DNA缺失，诱导PAEC凋亡，导致微血管丢失和sm样细胞异常增殖。炎症和EC凋亡都有助于肺动脉高压(红箭头表示上调或下调;黑色箭头，后遗症)。
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