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。 2015年7月,29 (7):2912 - 29。
doi: 10.1096 / fj.14 - 268276。 Epub 2015年3月19日。

mitophagy受损导致吸烟压力诱导细胞衰老:对慢性阻塞性肺疾病的影响

Tanveer艾哈迈德1, 艾萨克·K桑达尔1, 乍得一勒纳1, 贾尼斯Gerloff1, 安娜米Tormos1, 宏伟么2, 艾尔•拉赫曼2
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mitophagy受损导致吸烟压力诱导细胞衰老:对慢性阻塞性肺疾病的影响

Tanveer艾哈迈德et al。 美国实验生物学学会联合会J。 2015年7月。
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文摘

香烟(CS)全身的细胞衰老参与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制。CS诱导细胞衰老的分子机制尚不清楚。在这里,我们表明,CS压力(暴露主肺细胞CS提取half-maximal抑制浓度的0.2 - -0.75%∼0.5%)导致受损mitophagy和细胞核周围的积累受损的线粒体和细胞衰老相关的人类肺成纤维细胞和小气道上皮细胞(SAECs)。mitophagy受损是由于减少了帕金易位线粒体受损,这是由于CS-induced细胞质p53与帕金积累及其交互。受损的线粒体受损帕金易位也观察到在小鼠肺肺气肿(6个月CS曝光,100毫克TPM / m(3))以及慢性吸烟者和COPD患者的肺。主要SAECs COPD患者还表现出受损mitophagy通过suborganellar信号和增加细胞衰老。Mitochondria-targeted抗氧化剂(Mito-Tempo)恢复mitophagy受损,降低线粒体质量积累,延迟细胞衰老Parkin-overexpressing细胞。总之,缺陷mitophagy导致CS压力诱导肺癌细胞衰老,和恢复mitophagy延迟细胞衰老,它提供了一种有前途的治疗干预慢性气道疾病。

关键词:DNA损伤;帕金;Pink1;细胞核周围的线粒体聚类;活性氧物种。

数据

图1所示。
图1所示。
CSE导致肺成纤维细胞细胞衰老和线粒体功能障碍。一个)代表SA-β-gal活动的图像在HLFs CSE (HFL1)有或没有。案子,控制。BC)12FDG HFL1细胞荧光被流式细胞仪测量和绘制平均荧光强度(FC12FDG在HFL1)显示,任意单位细胞衰老的程度(美)。* * *P< 0.001vs。控制。C)代表图像的p16和p21 HFL1细胞免疫荧光和没有CSE(如上所述)。D)代表图像HFL1细胞沾γ-H2AX(绿色),而DAPI核(蓝色)用于标签。地区广场在右面板放大如图所示。E)mtROS通过流式细胞仪测量和绘制平均荧光强度(FMitoSOX在HFL1)。* *P< 0.01vs。控制。F)细胞内ATP水平测量细胞数量相等。*P< 0.05vs。控制。G)代表图像显示HFL1细胞线粒体形态沾MitoTracker红(MitoRed)使用共焦显微镜,数码图像放大。HHFL1细胞)电子显微镜图像显示线粒体形态变化。我)代表衰老HFL1细胞线粒体形态变化的图像如图所示的colocalization MitoTracker衰老标记红色,C12FDG(绿色)。CSE与替代0.5%使用天治疗15天。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。规模的酒吧、10µm (一个),20µm (C,D,我),0.5μm (H)。
图2。
图2。
CSE诱导细胞核周围的线粒体的DNA损伤积累和肺成纤维细胞。一个)时间动力学实验表明细胞衰老(C之间的相关性12FDG), mtROS (MitoSOX红色),ΔΨ米(TMRM)和线粒体质量(MitoGreen) HFL1细胞。* *P< 0.01vs。0小时。B)代表图像显示线粒体结构改变在细胞衰老HFL1细胞治疗0.5% CSE表示时间点。HFL1细胞沾MitoTracker红(水红色),和C12FDG(绿色)用于标签衰老细胞。C)代表图像显示细胞核周围的线粒体HFL1细胞中积累处理CSE(0.75%)为24小时。线粒体是沾MitoTracker红(白),phalloidin(目录A12380数量;生命技术)对肌动蛋白(绿色),DAPI对核(蓝色)。案子,控制。D)的3 d表示细胞核周围的线粒体聚集在治疗CSE(线粒体红细胞核蓝色)使用ImageJ。E)代表MitoSOX红色的图片(绿色)和线粒体沾MitoTracker红色。细胞治疗CSE(0.75%)成像前24小时。F)数据被绘制为平均荧光强度(FMitoSOXMitoSOX),通过流式细胞仪测定HFL1。美大,arbitrary units. ***P< 0.001vs。控制。G)代表图像的CellROX ROS的测量。HFL1细胞治疗有或没有CSE(0.75%) 24小时和沾CellROX(绿色)和DAPI(蓝色)可视化ROS的细胞核。H(F)的平均荧光强度CellROX)测量的CellROX HFL1细胞使用MetaMorph软件。* * *P< 0.001vs。控制。我)之间的关联数据细胞核周围的线粒体DNA积累和焦点的形成。HFL1细胞被染色和汤姆20线粒体和DAPI核可视化细胞核周围的线粒体,连同γ-H2AX DNA损伤病灶。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。酒吧、规模20μm (B,C,E,G)。
图3。
图3。
CSE治疗导致mitophagy损伤肺成纤维细胞。一个)代表的图像Pink1帕金,进行Mfn2, Drp1 HFL1细胞(绿色)治疗或没有CSE。细胞转染mitochondria-targeted红色荧光蛋白(mRPF;红色)(CellLight Mitochondria-RFP BacMam,目录C10505数量;电池技术)与相应的抗体染色前24小时(绿色)和DAPI(蓝色)。地区广场在右面板放大如图所示。倾斜线在图像显示区域荧光强度的评估。案子,控制。B)线扫描数据的荧光强度对应的图像显示的程度之间colocalization mRFP(线粒体)和相应的蛋白质。美大,arbitrary units. *P< 0.05vs。控制。C)西方滴Pink1,帕金,进行Mfn2, Drp1全细胞提取准备从HFL1细胞治疗或没有CSE。β-Actin(目录号码R-22 sc - 130657;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)被用作加载控制。代表管家加载控制。D)微各自的屁股。*P< 0.05vs。控制。E)免疫印迹的帕金线粒体提取物HFL1细胞有或没有CSE治疗。挺是用作积极控制诱导帕金线粒体易位。汤姆20被用作加载控制。阿明费、车辆。F)微各自的屁股。*P< 0.05vs。车辆。G)代表图像LC3-GFP (CellLight Mitochondria-GFP, BacMam,目录C10600数量;生命技术)细胞表达HFL1沾MitoTracker红色。细胞治疗CSE(0.5%) 15天之后挺治疗2小时。图像显示的colocalization LC3-GFP CCCP治疗后线粒体(水红色)。倾斜线在图像显示区域荧光强度的评估。H)相应的荧光强度线扫描显示了colocalization LC3-GFP线粒体(红色)。*P< 0.05vs。控制。CSE与替代0.5%使用天治疗15天。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。酒吧、规模20μm (一个和G)。
图4。
图4。
受损的线粒体的积累会导致肺成纤维细胞的细胞衰老。一个)代表鼠肺成纤维细胞的图像显示线粒体伸长和积累的线粒体质量与鱼藤酮(腐烂)和Mdivi-1治疗。鱼藤酮(10海里),Mdivi-1(1µM)及其组合与另一天15天治疗。阿明费、车辆。B绿色(F)的平均荧光强度MitoTrackermitogreen)反映线粒体质量,以流式细胞仪在小鼠肺成纤维细胞。美大,arbitrary units. *P< 0.05vs。车辆。C)代表SA-β-gal活动的图像和不使用鱼藤酮在小鼠的肺成纤维细胞(10海里),Mdivi-1(1µM)和联合治疗。DC)12FDG在小鼠的肺成纤维细胞用流式细胞仪和荧光绘制平均荧光强度(FC12FDG在细胞),显示任意单位细胞衰老的程度。*P< 0.05和* *P< 0.01vs。车辆。E)代表鼠肺成纤维细胞的图像显示colocalization LC3-GFP线粒体(水红色)。车辆或鱼藤酮和Mdivi-1-treated细胞进一步处理或不挺2小时前成像。F)线扫描的荧光强度在相应的图片。*P< 0.05vs。控制。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。规模的酒吧、10μm (一个和E)和100μm (C)。
图5。
图5。
帕金过度降低CS-induced mitophagy损害肺成纤维细胞。一个)代表与mCherry-Parkin HFL1细胞转染的图像。细胞治疗CSE(0.75%)为24小时,沾染了汤姆20线粒体(绿色)。案子,控制。在广场区域放大显示在右面板。倾斜线在图像显示区域荧光强度的评估。B与mCherry-Parkin)比例的细胞线粒体。*P< 0.05vs。控制。C)线扫描相应的图像。盟,任意单位。*P< 0.05vs。控制。D)细胞核周围的线粒体积累HFL1细胞治疗或没有CSE(0.75%)为24小时。* * *P< 0.001vs。向量(矢量);# P< 0.05vs。CSE +向量。E)代表图像的DNA损伤病灶(反映在γH2AX疫源地)向量或Parkin-overexpressing HFL1细胞(帕金),有或没有CSE治疗。DAPI(蓝色)用于标签和γ-H2AX核DNA损伤病灶(绿色)。F平均每个细胞的DNA损伤病灶数。G绿色(F)的平均荧光强度MitoTrackermitogreen在HFL1),由流式细胞仪测量。* *P< 0.01vs。向量;# P< 0.05vs。CSE +向量。H)代表SA-β-gal活动的图像向量或Parkin-overexpressing HFL1细胞治疗或没有备用的CSE 15天(0.5%)。Vec代表细胞转染与向量,而帕金代表与mCherry-Parkin细胞转染质粒。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。酒吧、规模20μm (一个和E)和100μm (H)。
图6。
图6。
Mitochondria-targeted抗氧化变弱线粒体质量积累和细胞衰老Parkin-overexpressing HFL1细胞。一个)细胞核周围的线粒体积累HFL1细胞,流式细胞仪测定overexpressing帕金(帕金),这是接受或不CSE(0.75%)为24小时。平均细胞核周围的线粒体积累强度是策划。美大,arbitrary units; Con, control.# P< 0.001vs。CSE加上向量(矢量)。B绿色(F)的平均荧光强度MitoTrackermitogreen)是衡量HFL1细胞流式细胞仪治疗或没有CSE (0。5%)为15天。* *P< 0.01vs。控制向量;# P< 0.05vs。CSE +向量。C)数据显示,每个细胞的DNA损伤病灶数γ-H2AX-stained HFL1细胞治疗有或没有CSE(0.75%)为24小时。* * *P< 0.001vs。控制向量;# P< 0.05vs。CSE +向量。平均每个细胞的DNA损伤病灶数是策划通过计算> 50个细胞。D)流式细胞仪数据显示细胞的细胞衰老程度或没有处理CSE(0.5%)为15天。C的平均荧光强度12FDG (FC12FDG在HFL1)绘制。* *P< 0.001vs。控制向量;# P< 0.05vs。CSE +向量。Vec代表细胞转染与向量,而帕金代表与mCherry-Parkin细胞转染质粒,与Mito-Temp MitoT代表了细胞治疗。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 4)。
图7。
图7。
帕金过度和MitoT救援缺陷mitophagy和保护人类主要SAECs CS-induced细胞衰老。一个)代表细胞的图像显示线粒体形态在人类主要SAECs处理或不CSE(0.2%)与另一天治疗10天。线粒体的细胞被沾MitoTracker红。B)平均MitoTracker绿色荧光(Fmitogreen)是衡量流式细胞仪在正常和慢性阻塞性肺病SAECs治疗或没有CSE (0。2%)为10天。美大,arbitrary units. *P< 0.05vs。正常的。C)代表图像显示SA-β-gal活动SAECs治疗或没有CSE。细胞治疗10天染色与SA-β-gal紧随其后。DC)的平均荧光强度12FDG (FC12FDG)在SAECs通过流式细胞仪测定。案子,控制。*P< 0.05vs。Con-Normal;# P< 0.05vs。Con-COPD。E)代表图像的正常和慢性阻塞性肺病细胞转染和YFP-Parkin CCCP(10µM)处理2小时。SAECs沾汤姆20(红色)和DAPI(蓝色)。倾斜线在图像显示区域荧光强度的评估。F)相应的荧光强度线扫描显示了colocalization YFP-Parkin的线粒体。*P< 0.05vs。正常的。G)代表图像的SAECs正常人沾γ-H2AX(绿色);DAPI用于标签核(蓝色)。矢量,向量。H)平均MitoTracker绿色荧光(Fmitogreen流式细胞仪)测量的SAECs治疗或没有CSE (0。2%)为15天。*P< 0.05vs。控制向量;# P< 0.05vs。CSE +向量。我C)的平均荧光强度12FDG (FC12FDG)在SAECs通过流式细胞仪测定。*P< 0.05vs。控制向量;# P< 0.05vs。CSE +向量。矢量是一个矢量,MitoT代表与MitoT细胞治疗,并与mCherry-Parkin帕金代表细胞转染,而MitoT +帕金代表细胞转染帕金和对待MitoT有或没有CSE(0.2%)治疗15天。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3)。规模酒吧、10μm (一个和E),100μm (C),20μm (G)。
图8。
图8。
慢性CS诱发受损mitophagy在小鼠肺肺气肿。一个)代表图像的肺泡和支气管区域显示p16和p21染色在小鼠肺部暴露在CS为6个月。组织与p16(绿色)染色,p21(红色),和DAPI(蓝色)。B)的平均强度p16和p21 MetaMorph计算软件。美大,arbitrary units. ***P< 0.001vs。空气中。C)免疫印迹Pink1,帕金,进行Mfn2和Drp1全细胞从老鼠的肺,提取准备和β-actin用作加载控制。代表管家加载控制。D)微各自的屁股。*P< 0.05vs。空气中。E)免疫印迹帕金和汤姆在线粒体20从肺中提取准备的老鼠暴露在CS为6个月。代表加载控制。F)微各自的屁股。*P< 0.05vs。空气中。G和我)代表肺泡和支气管的图像区域显示Pink1和帕金染色在小鼠肺。空气是对照组,CS代表老鼠暴露在CS为6个月。组织是沾Pink1(绿色),帕金(红色),和DAPI(蓝色)。H和J)的平均强度Pink1并使用MetaMorph帕金染色计算软件。* * *P< 0.001vs。空气中。数据显示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。酒吧、规模50μm (一个,G,我)。
图9。
图9。
受损mitophagy吸烟者和COPD患者的肺。一个进行Mfn2)西方滴Pink1、帕金,和Drp1全细胞提取准备从人类肺所示,而β-actin被用作加载控制。代表管家加载控制。NS,不吸烟者。B)微各自的屁股。C)西方滴帕金和汤姆在线粒体20从肺中提取准备的不吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者。代表加载控制。D)微各自的屁股。*P< 0.05和* *P< 0.01vs。不吸烟者。数据被表示为±的手段 扫描电镜(n= 3 - 4)。
图10。
图10。
示意图显示CS引起线粒体功能障碍和mitophagy障碍导致细胞衰老通过在慢性阻塞性肺病suborganellar信号。CS压力会导致线粒体伸长和功能障碍(即。,减少ATP和增加活性氧释放),导致细胞核周围的积累受损的线粒体和DNA damage-initiated细胞衰老通过suborganellar信号在慢性阻塞性肺病的发展。CS接触也会增加p53帕金,之间的相互作用,削弱Parkin-dependent mitophagy,进一步增强细胞核周围的线粒体集群。帕金过度连同MitoT治疗减少mitophagy损伤和细胞衰老。红点表示ROS。
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