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。 2014年5月15日; 189（10）：1260-72。
DOI：10.1164 / RCCM.201310-1749oC。

全脂序列序列显示TOPBP1作为特发性肺动脉高压的新基因

Vinicio A de耶稣佩雷斯1那 柯元那 玛丽亚是Lyuksyutova.那 弗雷德里克杜威那 Mark E Orcholski.那 埃里克：我洗牌那 玛雅·马图尔那 小卢克·扬西那 Vanessa Rojas.那 蔡云格雷斯李那 AIQIN CAO.那 Tero-Pekka Alastalo那 内尔·哈泽尼那 Karlene A CIMPRICH.那 Atul J Butte.那 Euan Ashley那 罗哈姆扎曼尼亚
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全脂序列序列显示TOPBP1作为特发性肺动脉高压的新基因

Vinicio A de耶稣佩雷斯等等。 am j respir crit care med。 。
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摘要

理论基础：特发性肺动脉高压（IPAH）是一种危及生命的疾病，其特征是肺部微血管的逐步丧失。尽管骨形态发生受体2（BMPR2）中的突变在80％的遗传和约15％的IPAH患者中发现，但它们的低渗透（〜20％）表明其他未识别的遗传改性剂对于疾病表型表现需要。使用全外序列（WES）最近导致了在遗传性PAH中发现了新的易感性基因，但WES是否也可以在IPAH中加速基因发现。

目标：确定WES是否可以帮助鉴定IPAH患者的新型基因改性剂。

方法：对从12个无关患者中分离的基因组DNA进行了exome捕获和测序，缺乏BMPR2突变。使用Anhovar根据其致病潜力优先考虑观察到的遗传变体。

测量和主要结果：将九个基因鉴定为高优先级候选人。我们的顶部受到Topoisomerase DNA结合II结合蛋白1（TOPBP1），该基因涉及DNA损伤和复制应力的响应。我们发现，从IPAH患者分离的血管病变和肺内内皮细胞中降低了TOPBP1表达。尽管TOPBP1缺陷使内皮细胞易于DNA损伤和凋亡的呼吸响应羟基脲，但其恢复导致较少的DNA损伤和改善的细胞存活。

结论：WES导致TOPBP1的发现，这种基因，其缺乏可能会增加对IPAH的小血管损失的敏感性。我们预测，WES的使用将有助于识别影响个人发展IPAH风险的基因改性剂。

图

图1。
图1。
在特发性肺动脉高血压发病机制中鉴定出全外膜测序鉴定的前三个候选基因的作用。ECM =细胞外基质;SMC =平滑肌细胞。
图2。
图2。
在特发性肺动脉高压患者（IPAH）患者中鉴定的拓扑异构酶DNA结合II结合蛋白1（TOPBP1）变体位于保守的蛋白质结构域内。（一种）TOPBP1的主要序列，显示三个识别的变体的位置。（B.）通过预测的氨基酸（AA）开关预测和实际等位基因频率三个TOPBP1 SNV。（C）使用突变甾型，Sift，LRT，Polyphen2（PolyP2）和GERP来预测三个观察到的TOPBP1变体的功能影响。（D.)当人类TopBP1蛋白序列与使用肌肉的其他相关生物体的TopBP1蛋白序列对齐时，变体以保守氨基酸为目标。SNV=单核苷酸变异。
图3。
图3。
特发性肺动脉高压（IPAH）患者拓扑异构酶DNA结合II结合蛋白1（TopBP1）核丰度降低(一种）从健康供体中获得的肺部的代表性免疫组织化学图像（顶面板）和IPAH（底板）。秤杆=25μm。（B.)定量聚合酶链反应检测健康供体和IPAH肺微血管内皮细胞（PMVECs）中TOPBP1mRNA的表达。酒吧代表来自涉及每组五名患者的实验的平均SEM。***P.<0.0001，未配对T.测试。（C）代表性的核提取研究，证明PMVECS的TOPBP1表达来自5个健康供体和IPAH患者的PMVEC。在表E4中可以在IPAH PMVEC中分发所有三个TOPBP1 SNV。酒吧代表来自涉及每组五名患者的实验的平均SEM。***P.<0.0001，未配对T.测试。SNV =单核苷酸变体。
图4。
图4。
特发性肺动脉高压（IPAH）肺部微血管内皮细胞（PMVECs）证明了伴随羟基脲（HU）反应的DNA损伤和凋亡增加的证据。（一种）代表性免疫荧光研究，证明核拓扑异构酶DNA结合II结合蛋白1（TOPBP1）（绿色）和p-h2ax（红色的）来自健康捐助者的PMVEC（六面板）和IPAH（下六个面板）在基线和暴露于胡（2 mm）后24小时。秤杆=25μm。（B.）Caspase 3/7健康供体和IPAH PMVecs的活性测定，在基线和Hu暴露后24小时。酒吧代表来自涉及每组五名患者的实验的平均SEM。lu =发光强度。*P.<0.05与健康的捐赠者-HU，单向分析与Bonferroni后检验未配对的差异T.测试。
图5。
图5。
候选拓扑异构酶DNA结合II结合蛋白1（TopBP1）SNV对健康肺微血管内皮细胞羟基脲介导复制应激易感性的影响。代表性免疫荧光研究显示核TopBP1(绿色）和p-h2ax（红色的）在暴露于羟基脲（2mM）后，用野生型（WT）或突变构建体转染的健康肺部微血管内皮细胞转染，含有三种TOPBP1候选SNV（RS55633281，RS17301766和RS10935070）中的每一个进行24小时。秤条=10μm。SNV =单核苷酸变体。
图6。
图6。
拓扑异构酶DNA结合II结合蛋白1（TOPBP1）siRNA敲低增加了对健康肺部微血管内皮细胞（PMVEC）的DNA损伤和凋亡的敏感性。（一种）Western印迹显示用Nontargeting（NT）或TOPBP1特异性siRNA转染PMVEC中的TOPBP1表达。相对于α-管蛋白作为负载控制测量密度测定。***P.<0.0001，未配对T.测试。（B.）表现出核顶层1的代表性免疫荧光研究（绿色）和p-h2ax（红色的)在转染NT的PMVECs中(最佳)或TopBP1 siRNA(底部）24小时后的基线。秤条=10μm。（C）相对Caspase 3/7的NT和TOPBP1 siRNA的活性测定和TOPBP1 siRNA在基线中转染PMVEC 24小时。酒吧代表从一式三份进行的实验中的平均SEM。*P.<0.05，未配对T.测试。（D.）Matrigel管形成测定比较NT和TOPBP1 siRNA转染的PMVEC。播种细胞后6小时定量管数。**P.<0.001，未配对T.测试。秤杆=150μm。
图7。
图7。
恢复拓扑异构酶DNA结合II结合蛋白1（TOPBP1）水平保护特发性肺动脉高血压（IPAH）肺部微血管内皮细胞（PMVEC）免受羟基脲诱导的凋亡，提高管形成。（一种）Western印迹显示在IPAH PMVEC中的TOPBP1表达，用野生型（WT）TOPBP1表达构建体（0,1和2μg）转染。相对于α-管蛋白作为负载控制测量密度测定。***P.<0.0001与健康捐赠者。与Bonferroni后差异（ANOVA）的单向分析，n = 3.（B.)羟基脲暴露24小时后，用空载体或WT-TopBP1表达构建物转染的IPAH pMVEC的半胱天冬酶3/7活性测定。酒吧代表从一式三份进行的实验中的平均SEM。***P.<0.0001与健康供者比较，采用Bonferroni后测进行单因素方差分析(C）Matrigel管形成测定比较健康供体，IPAH +载体和IPAH + WT TOPBP1 PMVEC。播种细胞后六小时定量管数。*P.<0.05与健康捐赠者，***P.<0.0001与健康捐赠者，单向ANOVA与Bonferroni后测试。秤杆=150μm。
图8。
图8。
提出的模型。Topoisomerase DNA结合II结合蛋白1（TOPBP1）有助于保护肺部微血管内皮细胞免受损伤并促进血管生成（最佳）。降低TOPBP1可以通过增加对DNA损伤的易感性丧失肺部微血管内皮细胞和受损血管生成的损伤（血管生成）来有助于发作性肺动脉高血压（IPAH）。底部）。
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