doi: 10.1016 / j.ajhg.2013.07.004。
Epub 2013年8月22日。
BMP9突变导致血管畸形综合症与表型重叠与遗传性出血性毛细血管扩张
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- PMID:23972370
- PMCID:PMC3769931
- DOI:10.1016 / j.ajhg.2013.07.004
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BMP9突变导致血管畸形综合症与表型重叠与遗传性出血性毛细血管扩张
是J哼麝猫。
。
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文摘
遗传性出血性毛细血管扩张(HHT),最常见的遗传性血管疾病,是由基因突变引起的转化生长因子β(TGF-β)信号通路(ENG、ACVRL1和SMAD4)。然而,大约15%的患者临床特征的遗传性出血性毛细血管扩张症没有这些基因的突变,这表明还有其他未被发现的突变基因遗传性出血性毛细血管扩张症和重叠的表型可能是血管疾病。191年的遗传病因无关的个人临床怀疑患有遗传性出血性毛细血管扩张症研究使用外显子组和Sanger测序;这些人没有突变ENG, ACVRL1和SMAD4。突变BMP9(也称为GDF2)被确定在三个不相关的渊源者。这三个人有鼻衄和皮肤病变称为telangiectases但其位置和外观类似病变中所描述的一些人RASA1-related障碍患者(毛细管malformation-arteriovenous畸形综合症)。变异蛋白的分析表明,突变影响蛋白质加工和/或函数,和bmp9-deficient斑马鱼模型表明,BMP9参与血管生成。这些数据证实血管畸形综合征,表型的遗传原因重叠与遗传性出血性毛细血管扩张症。
版权©2013年人类遗传学的美国社会。由爱思唯尔出版公司。保留所有权利。
数据
皮肤血管病变在个人2所示是左手的中位数(A),右手背的一面(B),几个后背和肩膀上的大约20病变(C),通过激光消融治疗和血管病变以前右侧下颌的轮廓(D)。
BMP9变异改变配体的蛋白加工和绑定ALK1 (A) BMP9图描绘改变位置,prodomain,成熟的蛋白质。BMP9前体编码信号序列的氨基酸22页,从氨基酸prodomain 23 - 319 (proBMP9)和成熟的BMP9氨基酸320 - 429。分泌BMP9包括氨基酸23 - 429;furin-type蛋白酶裂开的prodomain BMP9生成成熟。(B)质粒编码人类WT BMP9或p。Arg68Leu, p。Pro85Leu或p。一个rg333Trp variants were transfected into HEK EBNA cells. Cell lysates and conditioned media were fractionated with nonreducing SDS-PAGE and immunoblotted for BMP9 with a mouse monoclonal BMP9 antibody (clone #360107, R&D Systems). For cell lysates, equal protein loading was confirmed by subsequent immunoblotting for α-tubulin and densitometry of the bands normalized to the α-tubulin bands. Supernatants were also fractionated and immunoblotted for BMP9. A parallel gel was run and stained with Coomassie blue. For verification, the Coomassie-stained bands were sequenced. WT and variant BMP9 proteins fractionated as three bands corresponding to the mature BMP9 dimer associated with both prodomains (∼125–150 kDa), the mature BMP9 dimer associated with a single prodomain (75 kDa), and mature BMP9 (22 kDa). Mature BMP9 is indicated by an arrow. Densitometry graphs are also shown. (C) BMP9 levels were determined by a specific ELISA (n = 3). The ELISA was developed with a colorimetric substrate comprising 1 mg/ml 4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate in 1 M diethanolamine (pH 9.8) containing 0.5 mM MgCl2。黑暗中的试验了在室温下,吸光度测量在405海里。未知值从标准曲线外推4-parameter对数曲线拟合。(D)与人类ALK1 C2C12细胞转染和处理研发系统BMP9(0.1至3000 pg / ml)或WT BMP9稀释至相同的活动。细胞暴露于Lipofectamine(“脂肪”)单独治疗与BMP9研发系统。所有细胞都与BRE-luciferase cotransfected pTK -Renilla。BMP9-driven萤火虫荧光素酶反应正常化Renilla活动。数据均值±SEM (n = 4井)为代表的实验。WT蛋白质滴定的活动相比,商业BMP9建立一个活动概要。C2C12细胞转染ALK1成为敏感的商业BMP9(320 - 429)成熟BMP9、氨基酸浓度低至1 pg / ml。(E) (B)的上层清液稀释,这样有等量的成熟媒体BMP9 BMP9条件与WT和变体。WT BMP9的活动配置文件类似于商业BMP9概要,虽然减少了活动的最低浓度1和10个pg / ml。对于每一个变体,相对上层清液卷必要实现等值的成熟WT BMP9下定了决心。(F)与人类ALK1 C2C12细胞转染和治疗BMP9 WT或变体。细胞暴露于Lipofectamine独自与WT BMP9并行处理。所有细胞都与BRE-luciferase cotransfected pTK -Renilla。BMP9-driven萤火虫荧光素酶反应正常化Renilla活动。ALK1激活发生的范围。数据均值±SEM n = 4井从代表性的实验。最高稀释准备在1 (WT)到8.3 (p.Arg68Leu) 1.3 (p.Pro85Leu)到4 (p.Arg333Trp)和连续稀释BMP9变体是准备与商业BMP9进行稀释系列一样。化验这些BMP9变异在C2C12细胞转染ALK1表明p。Arg68Leu和p。Pro85Leu变异表现出更少的活动比10 WT BMP9 pg / ml (p。WT Arg68Leu: 79.2%±10.3%;p。Pro85Leu: 82.2%±7.6%的WT)和30个pg / ml (p。WT Arg68Leu: 78.9%±4.3%;p。Pro85Leu: 78.6%±7.2%的WT)等价的稀释,但p。一个rg333Trp variant did not (10 pg/ml equivalent: 100.92% ± 11.8% of WT; 30 pg/ml equivalent: 99.6% ± 2.1% of WT).
错义替换BMP9改变蛋白质活动鼠标chondrogenic细胞系ATDC5孵化了1 ng / ml WT BMP9或p。Arg68Leu, p。Pro85Leu或p。一个rg333Trp variants produced in HepG2 cells, as shown in Figure S2. Alkaline phosphatase activity was measured in permeabilized ATDC5 cells with the use of p-nitrophenyl phosphate as a soluble substrate. Relative activity units are shown in the vertical axis.∗p < 0.001;∗∗p < 0.07。
bmp9Morphant斑马鱼显示静脉重建受损(A和B)亮场的图像活胚胎;盒装地区(A)和(B)指定的区域集中在(C)和(D),分别。200μm比例尺表示。流通(C和D)双光子共焦图像在尾静脉丛2 dpf。内皮细胞是绿色的,和红细胞是红色的。酒吧代表50μm规模。缩写如下:DV,背静脉;VV,腹侧静脉。斑马鱼Tg (kdrl: egfp); Tg (gata1 dsRed2):胚胎注射在1 - 4细胞阶段7 ng控制吗啉代(A和C)或7 ngbmp9吗啉代(B和D)和成像2 dpf。胚胎徕卡TCS SP5共焦显微镜成像(徕卡微系统)配备一个APO L 20×/ 1.00水浸客观、标准的可见激光,美态DeepSee红外激光(Spectra-Physics,新港集团)。EGFP成像在900 nm, DsRed2成像在561海里。系列是每隔2μm收集的,和二维投影生成MetaMorph 7.7(分子设备)。所有图片显示左前外侧的观点。
BMP9和TGF-β信号通路BMP9绑定到特定的I型和II型细胞表面受体(分别为我和R-II)展览serine-threonine激酶活性,以及辅助受体endoglin。配体结合后,R-II transphosphorylates ALK1 (i),然后通过磷酸化的receptor-regulated传播信号(R-Smads) Smad1 Smad5, Smad8 (“Smad1/5/8”)。一旦磷酸化,R-Smads heteromeric复合物与同族体合作形式,Smad4,和把核调节靶基因的转录活性,包括Id1。Endoglin、ALK1和Smad4编码英格,ACVRL1和SMAD4分别的致病性突变产生HHT1 HHT2和JP-HHT分别。BMP9编码是GFDF2这里描述的致病性变异。以下简称:使用GTM,一般转录机器。这个图是改编自图2在费尔南德斯et al。
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