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． 2013年10月1日，中国科学院学报(自然科学版);
doi: 10.1164 / rccm.201212 - 2297摄氏度。

肺周细胞和常驻成纤维细胞在肺纤维化发病机制中的作用

洪太极1， 杰弗里·林恩， 余华周润发， 丰田小林， 克里斯汀Mittelsteadt， 威廉·阿特梅耶， 新浪微博， Lynn M Schnapp， 杰里米·S·达菲尔德
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肺周细胞和常驻成纤维细胞在肺纤维化发病机制中的作用

洪太极et al。 J呼吸急救医疗吗． ．
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摘要

理由是:肺疾病中产生病理性纤维性胶原基质的细胞来源一直存在争议。最近的研究表明间充质细胞可能直接导致纤维化。

目的:表征正常小鼠肺中离散的间充质细胞群，并绘制其在博莱霉素诱导的肺损伤后的命运。

方法:我们绘制了Foxd1-Cre中表达foxd1的胚胎祖细胞及其后代在肺发育、成人体内平衡和纤维化损伤后的命运图;Rs26-tdTomato-R老鼠。我们用col - gfp (Tg)小鼠研究了正常和病变肺中产生胶原- i (α)1的细胞。

测量及主要结果:表达foxd1的胚胎祖细胞在受孕后13.5天前进入肺芽，扩展并形成具有周细胞特征的间充质细胞的广泛谱系。在成人肺中也发现了表达胶原i (α)1的不同谱系间充质群体，具有常驻成纤维细胞的特征。与常驻成纤维细胞相比，Foxd1祖细胞衍生的周细胞富含先天免疫、血管发育、WNT信号通路和细胞迁移的转录本。博来霉素肺损伤后Foxd1祖源性周细胞扩张，激活纤维化灶中胶原- i (α)1和肌成纤维细胞标志物α sma的表达。此外，我们的研究表明，表达胶原i (α)1的常驻成纤维细胞的独特谱系在肺损伤后也会扩张，是肌成纤维细胞的第二个主要来源。

结论:我们得出结论，肺中含有大量Foxd1祖细胞衍生的周细胞，这是一个重要的肺肌成纤维细胞前体细胞。

数据

图1 <我>。< / i >
图1所示。
表达foxd1的祖细胞进入早期肺芽，分化为肺间质，成熟形成成肺壁细胞。（一个) BigenicFoxd1-Cre;Rs26R老鼠或Foxd1-Cre;tdTR小鼠激活早期肺芽中存在的肺祖细胞中GFPCre融合蛋白的表达，并分化成肺间质群体。GFPCre重组酶可以去除这些间充质细胞基因组DNA中的loxP-STOP-loxP序列，从而在Foxd1祖细胞中永久、可遗传地表达lacz或tdTomato。（B实时聚合酶链反应分析Foxd1mRNA在肺发育过程中的表达。数据归一化为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶表达。y轴表示与成人相比增加了几倍。表示平均值±SD。每个时间点N = 3-4。（C)完整的心脏和肺芽来自Foxd1-Cre;Rs26R小鼠显示来自Foxd1祖细胞的蓝色间充质细胞。这种蓝色染色的特异性显示在对照肺中缺乏lacz表达。左）.通过检测Foxd1位点调控下的CreGFP表达，Foxd1表达祖细胞主要位于整个肺芽的后部(正确的）.（D肺芽来自Foxd1-Cre;Rs26R小鼠显示大量来自Foxd1祖细胞的蓝色染色间充质细胞(左）.箭头说明一个lacz+血管附近的间充质细胞。这种蓝色染色的特异性体现在对照肺芽中缺乏lacz的表达(正确的）.（eg)正常成人的共聚焦图像Foxd1-Cre;tdTRFoxd1祖细胞后代的肺显示可遗传标记tdTomato荧光团。番茄细胞位于CD31标记的肺泡内皮细胞附近。箭头) （E)，但不与内皮细胞重叠(插图）.相比之下，几乎所有的tdTomato细胞都共表达PDGFRβ (箭头) （F)，并且许多显示NG2的表达(箭头)，而少数则不表达这种蛋白质(箭头) （G）.（H)图量化tdTomato细胞共表达指示标记物的比例。（我)图像显示αSMA的存在+小动脉血管平滑肌(a)共表达td番茄。Bar = 50 μm。平均值±SEM。每组N = 3。
图2 <我>。< / i >
图2。
正常肺组织中表达胶原- i α1 GFP基因的细胞共表达PDGFRα。（一个)图显示Coll-GFP转基因与3.2 kb片段Col1a1启动子和1kb增强子与GFP融合。（罪犯)共聚焦图像显示GFP在成人肺中的表达Coll-GFP Tg小鼠与(B) pdgfrβ， (C) PDGFRα，和(DCD31)。Coll-GFP的例子+电池(绿色)缺少标记用a表示薄的箭头．绿色荧光蛋白−表达指定标记物的细胞(红色的)用一个表示箭头．Coll-GFP+共表达指示标记物的细胞(黄色的合并图像中的质膜用a表示厚的箭头．插图在D显示了分隔Coll-GFP的空格+来自内皮的细胞。（E)图显示Coll-GFP细胞共表达指示标记物的比例。Bar = 50 μm。平均值±SEM。每组3只。
图3 <我>。< / i >
图3。
正常肺中有3个间充质细胞群Foxd1-Cre;tdTR;Coll-GFP Tg老鼠。（一个)正常肺共聚焦图像显示三个不同的间充质细胞群:箭头表明tdTomato+细胞(红色的），薄的箭头表明Coll-GFP+细胞(绿色),块箭头表明tdTomato+同时表达Coll-GFP转基因的细胞(黄色的在合并图像中)。（B肺实质中有核细胞的定量+, Coll-GFP+和tdTomato+Coll-GFP+．（C)正常肺单细胞制备的荧光活化细胞分选图Foxd1-Cre;tdTR;Coll-GFP Tg小鼠显示三种不同的肺间充质细胞群。（D)显示三个人口的数据:(1) tdTomato+CollGFP−;（2) CollGFP+tdTomato−;和(3.) tdTomato+CollGFP+荧光激活细胞分选器计算的总事件的百分比。（E）Foxd1-Cre;tdTR;Coll-GFP TgPDGFRβ或PDGFRα标记的小鼠肺(白色）.箭头表示td番茄细胞(红色的)与PDGFRβ (白色),而薄的箭头表明Coll-GFP+细胞(绿色)与PDGFRα (白色）.块箭头表明tdTomato / Coll-GFP+PDGFRα或β标记的细胞(白色）.bar = 50 μm。平均值±SEM。N = 3只。
图4 <我>。< / i >
图4。
Foxd1祖细胞衍生周细胞的基因表达谱鉴定了两个具有不同转录和功能特征的亚群。这个综合图总结了三个单独的成对比较的结果。（一个) Foxd1祖基因衍生/CollGFP−周(仙女)和Foxd1祖细胞衍生的CollGFP+周(仙女 科尔+）.（B) Foxd1祖基因衍生/CollGFP−周(仙女)和常驻成纤维细胞(非foxd1 /CollGFP)+) （纤维）.（C) Foxd1祖细胞衍生/CollGFP-周细胞(仙女)与其他肺细胞群(Foxd1−/ CollGFP−) （其他）.对于每个面板，使用热图显示差异表达基因(红色的,差异;蓝色的每个表达模式都与其相应的功能类别相关联(调节富集)P数值使用彩虹刻度显示)。请注意两个foxd1衍生的周细胞群体在转录和功能上的巨大差异(一个）.与Foxd1祖基因衍生的/CollGFP比较−生成胶原的Foxd1祖细胞/CollGFP+周细胞和非foxd1 /CollGFP+成纤维细胞在基质重塑、发育和伤口修复等类似过程中富集，而foxd1衍生的/CollGFP−周细胞的特征是免疫通路基因上调(一个和B）.与其他肺细胞群(non-Foxd1/CollGFP−)， Foxd1祖基因衍生/CollGFP−周细胞在免疫过程、脉管系统发育和细胞迁移中丰富(C）.（D)通过定量逆转录酶聚合酶链反应验证微阵列数据。在微阵列检测中鉴定的几个基质相关和免疫相关基因进行了评估。表达式相对于tdTomato显示−CollGFP−人口(其他）.平均值±SEM。N = 3。
图5 <我>。< / i >
图5。
Foxd1祖源性周细胞与col - gfp+在二维培养中，常驻成纤维细胞表现出形态和行为上的差异。（一个永久表达tdTomato的Foxd1祖细胞(周细胞)原代培养的荧光图像Foxd1-Cre;tdTR老鼠(左）.Foxd1祖细胞衍生的细胞具有周细胞特征的长足突在体外（箭头）.tdTomato的免疫染色+细胞在体外在tdTomato中显示PDGFRβ的共标记+细胞，而只有一些tdTomato+与NG2 (正确的）.（B) Coll-GFP+成纤维细胞从Coll-GFP Tg传代2的小鼠表现出与Foxd1祖细胞来源的周细胞明显不同的形态。（C) tdTomato+从Foxd1-Cre; tdTR小鼠激活α - sma (绿色)蛋白表达和应激纤维形成对tgf - β刺激的响应在体外24小时后。（D) Foxd1祖细胞衍生周细胞(tdTomato+, Coll-GFP−从…分离出来Foxd1-Cre;tdTR;Coll-GFP Tg两代培养后的小鼠。foxd1衍生周细胞持续表达红色命运标记(左，红色的）在体外．几乎所有Foxd1祖细胞衍生的周细胞都激活高水平的col - gfp (中间，绿色）在体外(bar = 50 μm)。（E和F) Coll-GFP+与周细胞相比，成纤维细胞对tgf - β (1 ng/ml)、PDGF-BB (50 ng/ml)和PDGF-AA (30 ng/ml)的反应增加了迁移，24小时对照:无血清(平均值±SEM, n = 3， *)P成纤维细胞vs周细胞< 0.05)。（G和H) PDGF-BB治疗可增加col - gfp的增殖+成纤维细胞与对照组(无血清)相比，在72小时，但周细胞没有。BrdU酶联免疫吸附法测定的增殖值为相对于对照组的吸光度。(均值±SEM, n = 3， *P< 0.05与对照组比较)。
图6 <我>。< / i >
图6。
Foxd1祖细胞衍生周细胞的命运图谱确定它们是肺损伤中肌成纤维细胞前体的主要来源。（一个)博来霉素肺损伤实验图式。在气管内给予博莱霉素后第7天或第14天取肺。（B的定量逆转录酶聚合酶链反应Foxd1在博莱霉素损伤后第7天和第14天，损伤小鼠肺中显示没有激活Foxd1表达量与未损伤成年小鼠肺比较(mean±SD;N = 3-7 /组)。（C)博来霉素肺损伤后第7天和第14天的共聚焦图像显示纤维化灶Foxd1-Cre;tdTR肌成纤维细胞标记αSMA (绿色）.Coexpression of myofibroblast marker αSMA and the tdTomato fate marker of Foxd1-derived pericytes indicated by箭头．（D) tdTomato比例曲线图+共表达αSMA的细胞+博来霉素损伤后指定时间点成纤维细胞病灶(平均±扫描电镜;N = 3)。E和F)三联转基因小鼠博来霉素肺损伤后第7天的共聚焦图像显示纤维化灶Foxd1-Cre;tdTR;Coll-GFP Tg肺，以及tdTomato细胞在纤维化灶中共表达Coll-GFP的比例图表(平均值±SEM;N = 3)。G和H)共聚焦图像和tdTomato比例图+细胞周期中成纤维灶中的细胞(Ki67)+)，第7天(平均值±SEM;n = 3)， Bar = 50 μm。
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评论

  • 对肺肌成纤维细胞的神秘起源有了新的认识。
    Rosas IO, Kottmann RM, Sime PJ。 罗萨斯，等。 [J]中华呼吸与急救医学杂志，2013;18(7):756 - 756。doi: 10.1164 / rccm.201308 - 1494。 我是呼吸急救医学博士。2013。 PMID:24083856 免费的PMC文章。 没有摘要。

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