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． 2013年6月,48(6):742 - 8。
DOI：10.1165 / rcmb.2012-0339oc。

严重急性呼吸综合征冠状病毒感染人肺泡II型细胞的先天免疫反应

赵惠谦1， 艾米丽一个Travanty， 劳伦奥奥， 凯伦Edeen， 安德鲁·巴瑞， Jieru王， 洋子Ito， 凯瑟琳·V福尔摩斯， 罗伯特J梅森
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严重急性呼吸综合征冠状病毒感染人肺泡II型细胞的先天免疫反应

赵惠谦et al。 Am J Respir Cell Mol Biol． ．
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严重急性呼吸综合征(SARS)-冠状病毒(CoV)产生破坏性的原发性病毒性肺炎，弥漫性肺泡损伤和循环细胞因子显著增加。感染的主要细胞类型之一是肺泡II型细胞。然而，原代人肺泡上皮细胞感染SARS-CoV的先天免疫反应尚未确定。我们的目标包括在原代人II型细胞中开发一种允许SARS-CoV感染的培养系统，并确定其固有免疫反应。在气液界面(A/L)培养原代人肺泡II型细胞可改善其分化，并极大地增加其对感染的易感性，使我们能够确定其原代干扰素和趋化因子反应。在被感染的II型细胞的细胞质中检测到病毒抗原，电镜显示分泌囊泡中充满病毒粒子，病毒RNA浓度随时间增加，感染性病毒粒子从极化的II型细胞的顶端表面通过胞吐释放出来。干扰素-β、干扰素-λ (IL-29)和大量促炎细胞因子、趋化因子的mRNA浓度明显升高。一个令人惊讶的发现涉及到血管紧张素转换酶-2 (sars冠状病毒受体)在来自不同供体的II型细胞中的表达差异。总之，在气液界面培养II型肺泡细胞提供了原代培养物，在其中研究对SARS-CoV感染的肺固有免疫应答，并探索可能的调节这些固有免疫应答的治疗方法。

数字

图1 <我>。< / i >
图1所示。
在空气 - 液体界面（A / L）培养的人肺泡II细胞。如所述用SARS-COV的感染所述，在A / L条件下培养人牙槽型II细胞。（一个)单层上皮内含物(板层小体)的相显微图，由箭头，在II型细胞的细胞质内清晰可见。（B) A/L培养条件及IL-4、IL-13处理对所选蛋白免疫印迹的影响。巷1是新鲜分离的II型细胞的提取物，巷2是空的，车道3和4含有单独用KIAD在A/L条件下培养的细胞，道5和6含有KIAD、IL-4和IL-13在A/L条件下培养的细胞，车道7和8含有KIAD在水下培养的细胞道9和10.含有通过KIAD，IL-4和IL-13在浸没条件下培养的细胞。A / L病症增加了血管紧张素转换酶-2（ACE2），表面活性剂蛋白（SP）-A，PROSP-B，PROSP-C和ATP结合盒子亚家庭的表达式构件3（ABCA3），但是不是脂肪酸合成酶（Fas）。IL-4和IL-13显着增加了ACE2的表达。GAPDH，甘油醛3-磷酸脱氢酶。
图2 <我>。< / i >
图2。
SARS-CoV核衣壳蛋白和选定的肺泡II型细胞标记物的免疫荧光染色。细胞在A/L条件下生长，如M aterials和米 eThods.，用SARS-COV接种估计的2，并在接种后24小时固定24小时。（模拟) E-cadherin染色(一个)、冠(B），dapi（C)，并合并(D)．（E-H.）SP-A染色（E)、冠(F），dapi（G)，并合并(H)．（我）TTF-1染色（我)、冠(J），dapi（K)，并合并(l)．感染SARS-CoV染色II型细胞标记物的细胞。
图3 <我>。< / i >
图3。
sars冠状病毒感染肺泡II型细胞的超微结构。细胞按M aterials和米 eThods.在A/L条件下，在根尖表面接种SARS-CoV，接种48小时后固定并电镜观察。（一个）在感染细胞的细胞质中的膨胀，光滑壁分泌囊泡中发现了具有其特征层状体（LB）和SARS-CoV病毒粒子的分化的肺泡型II细胞。几个萌芽的病毒群体被表明箭头．（B)几个光滑的双膜泡(V)，是SARS-CoV RNA、靠近质膜的分泌泡中的病毒粒子和吸附在顶质膜上的病毒粒子的复制位点。的插图图示双膜囊泡的高倍放大图。
图4 <我>。< / i >
图4。
肺泡II型细胞产生sars冠状病毒II型细胞在A/L培养，接种sars冠状病毒，如M aterials和米 eThods.．（一个)接种病毒后6小时和24小时处理细胞，提取RNA并实时定量RT-PCR，检测sars - cov特异性病毒RNA。在这一系列实验中，我们使用了6个不同的供体，在接种24小时后，所有供体的SARS-CoV mRNA均有显著升高。（B(图中显示了传染性病毒的产生。在这一系列的实验中，从根尖(红色的)或底外侧(黑色的）表面或细胞提取物（蓝色的)在接种后4、24和48小时通过空斑试验滴度Vero E6细胞，并表达为每次插入的总病毒产量。这些点代表四个独立实验的平均值和标准误差。
<i>图5. </ i>
图5。
肺泡II型细胞对sars冠状病毒感染的先天免疫反应在A/L培养II型细胞并接种sars冠状病毒，如M aterials和米 eThods.．在4小时接种时段后，吸出鞘内，并在6至24小时后收获培养物。通过定量RT-PCR测量趋化因子和细胞因子的特异性mRNA浓度，并向组成探针36b4（酸性核糖体磷蛋白）标准化。的白色酒吧代表嘲弄接种插入物的数据，以及黑条表示来自受sars冠状病毒感染的插入的数据。（一个）在病毒接种后6小时，检测到的mRNA浓度的唯一显着增加涉及干扰素响应基因ISG56。（B）在病毒接种后24小时，所有选定基因表达的显着增加是明显的。*P< 0.05。**P< 0.01。＊＊＊P< 0.001。结果来自六个独立的供体，每个条件和时间都有重复的插入。
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