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． 2013年4月1日；187(7):751-60.
doi: 10.1164 / rccm.201206 - 0990摄氏度。

人骨髓间充质干细胞在离体肺损伤中的治疗作用

JAE W LEE.1., Anna Krasnodembskaya., David H McKenna., Yuanlin歌, 杰森·艾伯特, 迈克尔·马蒂
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人骨髓间充质干细胞在离体肺损伤中的治疗作用

JAE W LEE.et al。 am j respir crit care med． ．
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理由：间充质干细胞分泌旁分泌因子，可调节肺通透性和减少炎症，使其成为治疗急性肺损伤的潜在疗法。然而，如果针对肺损伤的感染原因，间充质干细胞的免疫调节特性是否会产生有害影响，这一点值得关注。

目标：因此，我们测试了间充质干细胞对肺液平衡、急性炎症和细菌清除的影响。

方法：我们在离体灌注的人肺中建立了大肠杆菌肺炎模型，以测试间充质干细胞对细菌诱导的急性肺损伤的治疗效果。

测量和主要结果：临床级人间充质干细胞恢复肺泡液清除率到正常水平，减少炎症，并与增加细菌杀灭和减少菌血症有关，部分通过增加肺泡巨噬细胞吞噬和抗菌因子的分泌。角化细胞生长因子是一种由间充质干细胞分泌的可溶性因子，具有大部分的抗菌作用。在随后的体外研究中，我们发现人单核细胞表达角质形成细胞生长因子受体，角质形成细胞生长因子通过AKT磷酸化降低人单核细胞凋亡，增加细菌清除率。中和抗体抑制角质形成细胞生长因子降低了间充质干细胞在体外灌注人肺和大肠杆菌损伤的单核细胞的抗菌作用。

结论：在大肠杆菌受伤的人肺中，部分充质干细胞恢复了肺泡流体清除，降低炎症和施加抗菌活性，部分通过角质形成细胞生长因子分泌物分泌。

数字

图1。
图1。
示意图大肠杆菌肺炎离体灌注人肺。如果总缺血时间小于48小时，并且如果选择标准如M eThods.部分见面。用晶体溶液（Dulbecco的改性鹰的[DME] H-21 H-21培养基）轻轻再次再次再磨损并灌注1小时，并用10cm H氧合氧化2.持续气道正压通气（CPAP）（FiO）2.0.95). 灌注率或心输出量设置为0.2 L/min，左心房压力设置为0 mm Hg，以防止静水肺水肿。如果对照组右上肺叶（RUL）或左上肺叶（LUL）的肺泡液体清除率（AFC）大于或等于每小时10%，则为10%9cfu大肠杆菌将细菌（K1菌株）注入右中叶（RML）或左下叶（LLL），并向灌流液中加入100 ml新鲜全血。对于间充质干细胞治疗组，将人间充质干细胞经支气管内注入RML或LLL或灌流液（静脉内）受伤后1小时。
图2。
图2。
临床级，冷冻保存的同种异体人能间充质干细胞（MSC）对肺泡流体清除和炎症细胞浸润到受伤肺叶和组织学中的影响大肠杆菌肺炎(A.）临床等级的滴注，冷冻保存人同种异体MSC IntraBrononal（IB）或静脉内（IV）恢复肺叶中肺泡流体清除（AFC）的降低大肠杆菌6小时时发生肺炎。通过在肺叶滴注5%白蛋白1小时后蛋白质浓度的变化来测量AFC，并表示为每种情况下的平均AFC（%每小时，每150毫升支气管肺泡灌洗液）±SD。对照肺叶n=20，对照肺叶n=4大肠杆菌–肺叶损伤，n=3大肠杆菌-用MSC IB或IV或正常人肺成纤维细胞（NHLF）治疗受损肺叶*P通过方差分析（ANOVA；Bonferroni），与对照叶相比<0.008(B)临床级MSC-IB或IV滴注可减少炎症细胞，特别是中性粒细胞流入肺损伤的肺叶大肠杆菌6小时患肺炎。绝对中性粒细胞计数表示为平均中性粒细胞计数（×107.每个条件下的电池）±SD。n=20表示控制叶，n=4表示控制叶大肠杆菌–肺叶损伤，n=3大肠杆菌- 用MSC IB或IV或NHLF处理的肺肺叶，*P通过方差分析（Bonferroni），与对照叶相比<0.0001，√ P< 0.0002和大肠杆菌Anova（Bonferroni）的肺炎。(C)人类的肺暴露在大肠杆菌将含或不含MSC的细菌在10%福尔马林中固定6小时。切片用苏木精和伊红染色。注射人MSC 1小时后大肠杆菌肺炎损伤在6小时时降低了受伤肺叶的出血、水肿和细胞数量。尽管方差分析没有统计学意义，但给人MSC IV后大肠杆菌肺炎也以剂量依赖的方式降低了炎症细胞因子的水平;将MSC剂量加倍至10 × 106.细胞将IL-1β水平降低63％，肿瘤坏死因子-α与肺泡流体相比减少87％大肠杆菌肺叶IL-1β: 1193±549大肠杆菌，926±156用MSC [×1]，437±345处理，MSC [×2];肿瘤坏死因子-α：3,019±1,767大肠杆菌，用MSC [×1]，1,604±377处理，384±189用MSC [×2]处理，值为平均值±SD pg / ml，n = 3-4）。
图3。
图3。
异基因人骨髓间充质干细胞（MSC）对肺泡灌流的影响大肠杆菌细菌负荷后大肠杆菌肺炎(A.)经支气管内（IB）或静脉内（IV）滴注临床级、冷冻保存的人同种异体MSC可降低肺损伤肺叶的总细菌负荷大肠杆菌6小时患肺炎。总细菌计数以平均值(× 10)表示6.CFU计数/ml)±SD。n = 18用于控制叶，n = 3大肠杆菌-损伤的肺叶，伴或不伴MSC IB或IV或正常人肺成纤维细胞，*P通过分析方差分析<0.0005与控制叶CFU计数（Anova; Bonferroni），√ P<0.0001与大肠杆菌通过方差分析（Bonferroni），肺炎CFU每毫升计数(B)经人MSC-IB或人MSC-IV处理的肺叶肺泡液体条件培养液对细菌的抗菌活性增强大肠杆菌表现为细菌在体外．总细菌计数以平均值(× 10)表示4.每种情况下的CFU计数/毫升）±SD。n=19表示控制瓣，n=4表示控制瓣大肠杆菌–肺叶损伤，n=3大肠杆菌-用MSC IB或IV或正常人肺成纤维细胞治疗受损肺叶*P<0.0005与ANOVA（Bonferroni）的每毫升计算CFU计数。
图4。
图4。
同种异体人间充质干细胞(MSC)对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬的影响大肠杆菌细菌(A.）从不同治疗条件下的受损肺泡的细胞螺旋液从残留的肺泡中发现的代表性肺泡巨噬细胞：Intrabronial（IB）MSC，静脉内（IV）MSC和IB角质形成细胞生长因子。(B）1小时后人体MSC IB的滴注大肠杆菌肺炎显着提高了肺泡巨噬细胞的吞噬作用百分比和吞噬症大肠杆菌细菌在6小时内。尽管没有统计学意义，但在1小时后静脉滴注人MSC大肠杆菌肺炎增加了肺泡吞噬作用的百分比和肺泡巨噬细胞的吞噬指数大肠杆菌在6小时时，细菌数量分别为80%和110%。通过量化每种情况下三种不同肺制剂的支气管肺泡灌洗液中100个巨噬细胞中含有细菌的肺泡巨噬细胞的数量，并量化每种情况下的平均细菌数，计算吞噬率和吞噬指数每个条件下，分别含有来自三种不同肺制剂的细菌的100个巨噬细胞中的巨噬细胞。数值表示为每个条件下的平均值±SD。n=3*P小于0.05%的吞噬率和*P吞噬指数< 0.03。
图5。
图5。
抗生素或人间充质干细胞（MSC）的影响大肠杆菌10小时患肺炎。我们延长了离体灌注人肺模型受伤大肠杆菌肺炎持续10小时，以确定如果在以后的时间点给予MSC治疗是否具有治疗作用大肠杆菌支气管内(IB)剂量为1010CFU从109CFU导致灌注液中的瞬时菌血症。类似于前6小时的前一组实验，IB MSC在诱导后2小时后恢复了肺损伤的所有参数大肠杆菌肺炎(A.肺泡液清除率(AFC)的损失表示为平均AFC(每小时百分比，每150ml支气管肺泡灌洗±SD)。控制瓣N = 12，控制瓣N = 3大肠杆菌- 用或不施用MSC或Ampicillin IV±MSC处理或不施用肺肺叶，*P<0.0001相对于控制叶，√ P<0.0.0001与大肠杆菌和# P<0.0005与大肠杆菌+IV Amp AFC通过方差分析（ANOVA；Bonferroni）。(B）将中性粒细胞的涌入受伤的肺泡。绝对中性粒细胞计数表示为平均中性粒细胞计数（×107.(细胞)±SD。(C）增加了受伤的肺泡中的总细菌CFU。总细菌计数表示为平均值（×106.CFU计数/ml)±SD。*P通过方差分析（Bonferroni），每毫升CFU计数小于0.002与对照组相比(D）灌注液中存在的菌血症。每小时灌注液中发现的最高细菌计数表示为平均值（×105.CFU计数/ml)±SD。*P<0.0001相对于控制叶，√ P<004与大肠杆菌CFU通过ANOVA（Bonferroni）计算每毫升。治疗大肠杆菌肺炎西米霉素（0.2g）IV的肺炎恢复了大部分急性肺损伤的参数，类似于MSC，除了恢复AFC（广告).静脉注射后2小时添加IB MSC，静脉注射后1小时添加IB MSC大肠杆菌肺炎对恢复受伤肺泡中的AFC率和降低肺泡和灌注液中的总细菌负荷有叠加效应(C和D）.
图6。
图6。
重组人角蛋白细胞生长因子（KGF）对的影响大肠杆菌肺炎。术后1小时支气管内（IB）滴注KGF（100纳克）大肠杆菌肺炎恢复了许多与间充质干细胞相似的急性肺损伤参数（MSC）。(A.KGF IB灌注可恢复肺损伤后肺泡液清除率(AFC)的下降大肠杆菌6小时患肺炎。AFC表示为平均AFC(每小时，每150ml支气管肺泡灌洗)±SD)。控制瓣N = 20，控制瓣N = 3-4大肠杆菌–使用或不使用KGF治疗受损肺叶*P通过方差分析（ANOVA；Bonferroni），与对照叶AFC相比<0.009。(B)注入KGF-IB可在6小时内减少中性粒细胞流入受损肺叶。绝对中性粒细胞计数表示为平均总中性粒细胞计数（×10）7.每个条件下的电池）±SD。n=20表示控制叶，n=4表示控制叶大肠杆菌–使用或不使用KGF治疗受损肺叶*P通过方差分析（Bonferroni），与对照叶相比<0.0001，√ P<0.006与大肠杆菌Anova（Bonferroni）的肺炎。(C）KGF IB的滴注在6小时内降低了受伤肺叶中的总细菌载荷。总细菌计数以平均值(× 10)表示6.CFU计数/ml)±SD。n = 18用于控制叶，n = 3大肠杆菌-inuregured肺叶，有或没有kgf，*P通过方差分析（Bonferroni），每毫升CFU计数小于0.007与对照组相比，√ P<0.0001与大肠杆菌通过方差分析（Bonferroni），肺炎CFU每毫升计数(D）滴注KGF IB 1小时后大肠杆菌肺炎显着提高了肺泡巨噬细胞的吞噬作用百分比和吞噬症大肠杆菌细菌在6小时内。各条件下的值均表示为平均值±SD。n=3*P<0.03%的吞噬率和*P<0.05用于吞噬作用指数。
图7。
图7。
重组角质形成细胞生长因子（KGF）对外周血单核细胞的影响。(A.)同时向分离的人血单核细胞中添加KGF（100 ng/ml）增加大肠杆菌细菌杀灭率为20%。总细菌计数表示为每种情况下的平均值（对照组的%）±SD。n=14–16*P<0.0001与控制CFU计数。(B)通过逆转录聚合酶链反应和westernblot分析，发现人血单核细胞表达KGF受体FGFR2的mRNA和蛋白。以原代培养的人肺泡上皮Ⅱ型细胞（TII）作为阳性对照。(C和DKGF的添加降低了24小时后乳酸脱氢酶(LDH)的释放，这与1小时后细胞内AKT磷酸化水平的升高有关。在每个条件下，释放的LDH以平均值(总LDH的%)±SD表示。N = 20-24， *P< 0.0008 vs控制LDH释放;各条件下磷酸化AKT/总AKT的比值以平均值(%对照)±SD表示。N = 10， *P<0.03与控制P-AKT / TOT AKT比率。磷酸化的STAT5 /总Stat5的比例表达为每种条件的平均值（对照的％）±SD。N = 10， *P>与对照组相比，P-STAT5/Tot-STAT5比值为0.05。GAPDH=甘油醛磷酸脱氢酶。
图8。
图8。
人间充质干细胞（MSC）对外周血单核细胞的影响。(A.)同时加入混合在一起或用Transwell平板分离的人MSC和分离的人血单核细胞增加大肠杆菌细菌杀戮。每个条件的总细菌计数表达为平均值（对照的百分比）±SD。n = 8-15，*P<0.0002与控制CFU计数。(B此外，肿瘤坏死因子（TNF）-α的水平降低，IL-10的水平增加，表明抗炎作用。对于每个条件，TNF-α水平表示为平均值（对照的百分比）±SD。n = 8-11，*P< 0.02与对照组和√ P<0.0001与TNF-α电平的MSC（Transwell）。对于每个条件，IL-10水平表示为平均值（对照的百分比）±SD。n = 8-11，*P与对照组相比，IL-10水平<0.03(C)人骨髓间充质干细胞，无论是混合在一起还是用Transwell平板分离，与人血单核细胞相比，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的分泌分别增加了×17和×6。GM-CSF水平表示为每种情况下的平均%（对照组）±SD。n=8–15*P< 0.003与对照组和√ P<0.0001与MSC（Transwell）用于GM-CSF级别。(D)添加角质形成细胞生长因子（KGF）或人MSC对培养7天以呈现肺泡巨噬细胞表型的单核细胞具有相同的抗菌作用。细菌总数表示为每种情况下的平均值（%）±SD。n=4*P<0.05与每毫升控制CFU计数相比，以及√ P<0.05与每毫升KGF CFU计数相比。
图9。
图9。
抗人角质形成细胞生长因子（KGF）或抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）中和抗体对人骨髓间充质干细胞（MSC）作用的影响在肺泡巨噬细胞和外周血单核细胞上。通过中和抗体抑制KGF可消除人MSC对细胞的抗菌作用(A.)肺泡巨噬细胞离体灌流人肺和肺组织(B)血单核细胞培养在体外．(C类似于抗KGF AB，通过中和抗体抑制GM-CSF废除了人体MSC的抗微生物作用在体外. 灌注人肺肺泡液中的细菌总数以平均值（×10）表示6.CFU计数/ml)±SD。N = 3-5， *P<0.05与经山羊对照IgG治疗的MSC CFU每毫升计数相比。生长的单核细胞的细菌总数在体外表达为每种条件的平均值（对照的百分比）±SD。n = 8-9。对于抗kgf ab，*P< 0.05与用山羊对照IgG处理的MSC相比。n = 14 - 16。对于anti-GM-CSF Ab， *P<0.04与山羊控制IgG处理的MSC。
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