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． 2012; 7 (9): e45001。
doi: 10.1371 / journal.pone.0045001。 Epub 2012 9月26日。

成人囊性纤维化气道微生物群随时间和感染类型的变化是稳定的，并且对抗生素治疗的恶化具有高度的弹性

安东尼·A·福多1， 埃里克·R·克莱姆， 迪尔德丽·F·吉尔平， J斯图尔特·艾尔本， 理查德·C·布歇， 迈克尔·M·托尼， 马修·沃尔夫冈
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成人囊性纤维化气道微生物群随时间和感染类型的变化是稳定的，并且对抗生素治疗的恶化具有高度的弹性

安东尼·A·福多et al。 《公共科学图书馆•综合》． 2012．
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摘要

囊性纤维化(CF)的特征是有缺陷的粘液纤毛清除和慢性气道感染复杂的微生物群。感染、持续炎症和急性肺加重的周期性发作可导致CF肺功能的不可逆下降。虽然导致急性加重的因素尚不清楚，但抗生素治疗可以暂时解决肺部症状并部分恢复肺功能。以往的研究表明，恶化可能与微生物密度的变化和新微生物种的获得有关。考虑到CF菌群的复杂性，我们应用大规模并行焦磷酸测序技术来鉴定23例成年CF患者在急性肺加重、抗生素治疗后和疾病稳定期间气道微生物群落结构的变化。产生了超过35万个序列，代表了近170个不同的微生物类群。获得的大约60%的序列来自已识别的CF病原体假单胞菌和伯克霍尔德氏菌，它们在大部分不重叠的患者亚群中检测到。相比之下，其他类群包括普雷沃氏菌、链球菌、罗氏菌和细孔菌在几乎所有患者样本中都很丰富。虽然抗生素处理与物种丰富度的小幅下降有关，但整体微生物群落结构的变化很小。此外，患者在急性加重期和临床稳定期的微生物群落组成高度相似，这表明急性加重可能代表了感染的肺内扩散，而不是微生物群落组成的变化。 Mouthwash samples, obtained from a subset of patients, showed a nearly identical distribution of taxa as expectorated sputum, indicating that aspiration may contribute to colonization of the lower airways. Finally, we observed a strong correlation between low species richness and poor lung function. Taken together, these results indicate that the adult CF lung microbiome is largely stable through periods of exacerbation and antibiotic treatment and that short-term compositional changes in the airway microbiota do not account for CF pulmonary exacerbations.

利益冲突声明

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

数据

图1
图1。CF微生物组主要由先前确定的细菌类群组成。
在CF样本集中确定的每个一致OTU都使用程序校准与细菌16S rRNA基因序列SILVA数据库的104版进行比对。请按照方法中的描述，在“Mothur”软件包中安装seqs。所产生的全局比对的百分比标识显示为每个OTU中序列数量的函数。红线代表97%的身份。
图2
图2。CF是一种多微生物疾病。
在CF痰液数据集中鉴定的169例OTUs的系统发育树。树的构建是通过将每个OTU的共识序列映射到SILVA参考树来实现的(参见方法)。树的每一片叶子都代表一个一致的OTU，标记着由RDP分类器分配的最密切相关的属。
图3
图3。定性细菌培养结果与454焦磷酸测序的优势CF病原体之间有广泛的一致性。
属(a)的序列分数假单胞菌或(b)洋葱作为患者报告的CF病原体培养状态的函数，对每个患者和样本时间点进行绘图铜绿假单胞菌而且不过复杂的物种。患者样本按时间点进行颜色编码(绿色，发作期;红色，静脉注射抗生素加重治疗结束;蓝色，临床稳定区间)。19号患者两项培养均为阴性铜绿假单胞菌而且不过．
图4
图4。培养总活菌数与相对序列丰度呈显著的非线性一致。
(a)电视广告铜绿假单胞菌和(b)不过根据每个痰样本中对应属的序列比例绘制出复杂的物种。黑线表示最小二乘拟合线性回归。值假单胞菌(右2= 0.71, p<0.001)洋葱(右2= 0.86, p<0.001)表示相关性显著。红线旨在说明潜在的非线性关系，并基于任意选择参数的双参数Michaelis-Menten函数。
图5
图5。丰度类群在恶化期间和抗生素治疗反应中高度稳定。
为了确定特定类群的相对丰度是否在加重期间或抗生素治疗后发生变化，比较了所有检测到的OTUs的归一化平均序列丰度(a)在加重(n = 22)和治疗结束时间点(n = 22)之间以及(b)在加重(n = 22)和稳定时间点(n = 13)之间。对于每个分类单元，归一化的平均序列丰度值被绘制为以10为底的对数(log10)．红圈表示在抗生素处理后以10%的错误发现率显着降低了标准化平均序列丰度的类群。(c)在所有三个采样时间点的总体微生物丰富度的比较表明抗生素治疗后略有但短暂的下降。通过两两t检验，加重时间点与治疗结束时间点(p = 0.06, n = 21)、加重时间点与稳定时间点(p = 0.87, n = 13)、稳定时间点与治疗结束时间点(p = 0.076, n = 13)之间的丰富度比较在p≤0.05阈值下均未达到统计学意义。
图6
图6。普遍类群也是丰富类群。
显示转换后的日志(log10)每个分类单元的平均归一化序列计数与该分类单元存在的样本数量的比较。平均值只包括存在该分类单元的样本。只绘制了存在于两个或两个以上样本(155个OTUs)中的类群。用于生成分析的原始数据见表S7。红色符号表示已识别的CF主要病原体。
图7
图7。序列特征区分感染类型、时间点和个体患者。
采用Bray-Curtis距离对痰样本序列数据进行主坐标分析(PCoA)。(a, b) PCoA，根据患者报告的CF病原体培养状态对样本进行彩色编码铜绿假单胞菌(蓝色),不过复杂的物种(红色)或对两者培养均为阴性的物种(绿色)。(c, d) PCoA，样品按时间点进行颜色编码;急性加重期(EX，绿色)、抗生素治疗结束期(EOT，红色)或临床稳定时(蓝色)。(e, f) PCoA，样本按患者ID彩色编码。每个样本都有一个符号表示，标记有患者ID和时间点(EX，加重开始;EOT，静脉抗生素治疗结束;ST，临床稳定区间)。(a, c, e) PCoA包括数据集中至少有10个序列的所有分类群。(b, d, f) PCoA与所有假单胞菌而且洋葱从数据集中删除的序列。对每个OTU的相对丰度数据(表S3)进行对数转换和归一化，然后使用方法中所述的程序Mothur中的PCoA算法计算和分析Bray-Curtis不相似度。
图8
图8。漱口水和痰液样本具有高度相似的分类群分布。
为了确定口腔菌群是否有助于CF气道微生物群落，我们比较了来自9名患者的22对漱口水和痰样本中所有OTUs的归一化平均序列丰度。对于每个分类单元，归一化的平均序列丰度值被绘制为以10为底的对数(log10)．红色符号表示在22个样本被视为独立测量值的参数t检验中，样本类型之间分布显著不同的类群，错误发现率为10%。
图9
图9。痰标本中较低的物种丰富度与肺功能下降有关。
所示为平均FEV图1与每位患者痰液中微生物的平均丰富度进行比较。FEV1每个患者的微生物丰富度值在所有时间点上都是平均的。每个符号旁边的数字表示患者的ID。符号根据患者的培养情况进行颜色编码(铜绿假单胞菌、蓝色;不过杂种，红色;两种文化都是阴性的，绿色)。线性回归分析的结果(红线)表明显著相关(r2= 0.42, p = 0.0009)。
图10
图10。肺功能与总细菌丰度无关。
通过(a) TVC和qPCR测量痰中总细菌丰度具有良好的相关性(r2= 0.63, p<0.0001;n = 23)。FEV1与(b) TVC (r2= 0.017, p = 0.55;n = 23)或(c) qPCR (r2= 0.003, p = 0.8;n = 23)，与(d)的TVC仅呈正相关。不过复杂物种(r)2= 0.29, p = 0.13;N = 8)和(e)铜绿假单胞菌(右2= 0.26, p = 0.05;n = 14)。测量细菌丰度和FEV1对23名患者的时间点进行平均。每个面板上的标签都标明了患者的ID。直线表示线性最小二乘回归拟合。只包括TVC值>0不过而且铜绿假单胞菌比较。TVC值代表log10每克痰液总菌落形成单位(cfu)的回收率。qPCR值代表log10每克痰中检测到细菌16S rRNA基因的拷贝。
图11
图11。漱口水样品中较低的物种丰富度与肺功能下降有关。
所示为平均FEV图1与9名患者漱口水样本中的平均微生物丰富度进行比较。FEV1每个患者的微生物丰富度值在所有时间点上都是平均的。每个符号旁边的数字表示患者的ID。线性回归分析的结果(红线)显示与肺功能(r2= 0.42, p = 0.057)。
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参考文献

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