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． 2012年4月17日;12:56。
doi: 10.1186 / 1471-2180-12-56。

BactQuant:一种增强型宽覆盖细菌实时定量PCR检测方法

Cindy M Liu1， Maliha阿齐兹， 谢尔盖Kachur， Po-Ren Hsueh， Yu-Tsung黄， 保罗Keim， 兰斯·B·普莱斯
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BactQuant:一种增强型宽覆盖细菌实时定量PCR检测方法

Cindy M Liuet al。 BMC Microbiol． ．
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摘要

背景:细菌负荷定量是细菌群落分析的重要组成部分，但需要一种不依赖培养的方法来检测和定量不同的细菌。基于对16s rRNA基因序列的分析，我们设计了一种广泛覆盖的定量实时PCR (qPCR)方法BactQuant，用于定量16s rRNA基因拷贝数和估计细菌载量。我们进一步利用硅质评价来补充基于实验室的qPCR表征，以验证BactQuant。

方法:对Greengenes数据库中4938个16s rRNA基因序列的核心序列进行分析以进行分析设计。克隆质粒标准物的生成和定量使用基于qpcr的方法。使用>67万条序列进行了覆盖率分析，并根据定量实时PCR实验(MIQE)指南的最低信息进行了进一步评估。

结果:设计了一种细菌TaqMan®qPCR方法，针对V3-V4的466 bp区域。覆盖度分析显示，89,537个物种中91%的门、96%的属和80%的物种至少包含一个与BactQuant方法完全匹配的序列。在评估的106种细菌中，扩增效率为81 ~ 120%，r2-value为>0.99，包括序列不匹配的种类。Ct数和拷贝数的组间和组内方差系数分别<3%和<16%。

结论:BactQuant检测比之前报道的通用细菌定量检测具有更广泛的覆盖范围，BactQuant体外性能优于硅片预测。

数据

图1
图1
结果 在网上 使用严格的标准对1849个属和34个门进行覆盖分析。所分析的每个门所覆盖属的数目(左)及所有未发现属的名单(正确的)。基于环状16s rRNA基因的最大简约系统发育研究(左)，每个有关的(在黑色)及未加盖(用红色)通过BactQuant方法的门，在门名称下面的括号中标注了属级数值覆盖范围。每个属级数值覆盖注释由分子(即门中覆盖属的数量)、分母(即门中符合序列匹配的属的总数)和使用分子和分母值计算的百分比组成。与已发表的测定方法比较，每个门以单个星号(*)表示未被发表的测定方法覆盖的门，以双星号(**)表示被发表的qPCR测定方法覆盖的门<50%属。还介绍了BactQuant试验未涵盖的所有属的门和属分类学鉴定(正确的) (Unc =未保密)。
图2
图2
a - b。10 μl和5 μl反应产生的BactQuant检测的标准曲线扩增谱，使用7个10倍稀释和归一化质粒标准 9 拷贝/μl。使用5 μl反应体积(图2b)的标准曲线Ct值显示，与10 μl反应体积(图2a)相比，左移了大约1个Ct。然而，在测定动态范围为10的不同反应体积之间，总体扩增谱没有显著差异2副本至10份8每个反应有16个S rRNA基因拷贝。
图3
图3
10 μl和5 μl反应的运行间和运行内变异系数(CoV)使用7个10倍稀释和归一化质粒标准在10 9 拷贝/μl使用多次运行的数据计算。数据显示为两个副本编号(实线)和Ct值(虚线)．正如预期的那样，拷贝数的CoV高于Ct值，运行间的CoV也高于运行内的CoV。两种反应量的拷贝数的CoV一直低于15%，直到107副本为5 μl反应。在两个反应体积中，Ct值的CoV始终低于5%。
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参考文献

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