跳转到主页内容
访问键 NCBI主页 myncbi主页 主要内容 主要导航
。 2012; 7（2）：E32366。
DOI：10.1371 / journal.pone.0032366。 EPUB 2012 2月28日。

中性粒细胞细胞外捕集性直接诱导上皮和内皮细胞死亡：组蛋白的主要作用

蒙娜沙弗齐德1那 克丽丝汀Juenemann那 Markus是队列那 Guenter Lochnit.那 Guillermo Barreto.那 塞巴斯蒂安P热斯卡那 Juergen Lohmeyer那 Klaus T Preissner.
隶属关系
免费PMC文章

中性粒细胞细胞外捕集性直接诱导上皮和内皮细胞死亡：组蛋白的主要作用

蒙娜沙弗齐德等等。 普罗斯一体。 2012年。
免费PMC文章

摘要

中性粒细胞在先天免疫中起着重要的作用，它可以保护宿主免受微生物的入侵。中性粒细胞的抗菌活性是通过释放抗菌肽、吞噬作用以及中性粒细胞胞外陷阱(NET)的形成来介导的。这些结构由DNA、组蛋白和颗粒蛋白(如中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶)组成。本研究聚焦于NET对宿主细胞功能的影响，特别是对人肺泡上皮细胞这一主要负责肺内气体交换的细胞的影响。NET与上皮细胞和内皮细胞直接相互作用后，以剂量依赖的方式诱导细胞毒性作用，NET对DNA的消化不会改变NET介导的细胞毒性。NET与组蛋白抗体、聚唾液酸或髓过氧化物酶抑制剂(而不是弹性酶抑制剂)预孵育可降低NET介导的细胞毒性，表明组蛋白和髓过氧化物酶负责NET介导的细胞毒性。虽然活化蛋白C (activated protein C, APC)在纯化系统中确实降低了组蛋白诱导的细胞毒性，但它并没有改变NET诱导的细胞毒性，这表明组蛋白依赖的NET的细胞毒性可以防止APC降解。此外，在lps诱导的急性肺损伤小鼠模型中，肺组织和支气管肺泡灌洗液中均有NET形成。这些数据揭示了NET中蛋白质组分的重要作用，特别是组蛋白，它们可能导致宿主细胞的细胞毒性，并可能参与肺组织破坏。

利益冲突陈述

利益争夺：作者宣布没有存在竞争利益。

数字

图1
图1.净导致肺上皮细胞死亡以浓度依赖性方式。
（a）在用培养基（对照），净或石榴孢菌素治疗4或16小时后评价A549细胞的形态。所示是> 8个独立实验的代表图片，在20×倍率下。（b）通过测量16小时后占用细胞面积的差异来定量来自（a）的细胞生长。（c）用两种浓度的净治疗（3.4和10.1μg/ ml DNA-Net）或Staurosporine治疗16小时后测量A549细胞的多硅藻活性。显示的是三个独立实验的代表性数据（平均值公式的形象SD) *P.<0.05;**P.<0.01;***P.<0.001。（d）对16小时后，用两种浓度的净血液（3.4和10.1μg/ ml DNA-net）或Staurosporine进行乙酸亚偶氮（乙锭-HD，红色），吞蛋白v（绿色），和hoechst 33342（黑色和白色）。显示的是三个独立实验的代表图片。（e）通过形态学分析评价来自（d）的乙锭-HD和annexin-V阳性细胞的百分比。
图2
图2.净诱导在上皮和内皮细胞中的细胞毒性，与消化无关。
(A)用未消化的NET(−)、完全消化的NET (DNase)、部分消化的NET (MNase)或煮沸形式的NET处理A549细胞16小时后，测量细胞毒性的程度。以相同浓度的DNA- net(3.4µg/ml)和DNase或MNase单独作为对照。所示为五个独立实验的代表性数据(平均值公式的形象SD），***P.<0.001，ns =非显着性。（b）用未消化的网（ - ）或完全（DNA酶）的净和单独的DNA处理16小时，测量细胞毒性的细胞毒性程度。显示的是三个的代表数据（除了在-II，n = 2除外）独立实验（平均值公式的形象SD），NS =非重大。
图3.
图3.组蛋诱导上皮和内皮细胞死亡。
（a）将A549细胞用不同浓度的组蛋白II-A处理16小时，并评估细胞形态。（b）在用各种浓度的组蛋白进行16小时治疗后计算A549细胞数。（c）用200μg/ ml组蛋白处理HUVEC或A549细胞16小时或未治疗（对照）。（d）HUVEC以不同浓度的组蛋白治疗16小时，并测量细胞毒性的程度。B和D是三个独立实验的代表性数据，并且在A和C图片中是来自三个独立实验的代表图片，在20×倍率下。
图4.
图4. APC降低由组蛋白引起的上皮细胞毒性，但不是通过网诱导。
（a）在37℃下在没有或存在100nM人APC的情况下预孵育1小时的组蛋白（200或100μg/ ml）与A549细胞孵育16小时，然后分析细胞毒性。（b）净与APC（质量比APC：净蛋白，1:5,1：2和1：1）温育，或者在37℃下没有APC，然后与A549细胞孵育16小时并测量细胞毒素。将APC单独或有效地封闭的APC（APC + PPACK）与A549细胞一起温育进行控制。（c）DNA酶消化的和（d）未消化形式的网在与100nM APC预孵育20至80分钟，然后与A549细胞孵育16小时，然后测定细胞毒素。显示的是四个独立实验的代表性数据（平均值公式的形象SD），***P.<0.001和ns =非显着性。
图5.
图5.组蛋白抗体和聚均酸可降低净介导的细胞毒性。
(A) NET与不同的组蛋白抗体(DNA/H1, H2A, H2B, H3，瓜氨酸化H3 [cit H3]， H4)或同型匹配的对照抗体预孵育。用抗体处理的NET或单独使用NET(−)与A549细胞孵育16 h以分析细胞毒性。显示的是三个独立实验的代表性数据（平均值公式的形象SD），***P.<0.001和ns =非显着性。（b）组蛋白或（c）网与针对组蛋白H4或聚核酸（PSA）的抗体预孵育，然后与A459细胞孵育16小时以分析细胞毒性。注意，聚核酸显着降低了组蛋白和净介导的细胞毒性。
图6.
图6.抑制中性粒细胞弹性蛋白酶不抑制净诱导的细胞毒性。
(A)收集未被刺激的中性粒细胞(Unstim)或被刺激的中性粒细胞(Stim)上清液(50 nM PMA for 4 h)，并在无刺激(Unstim)的情况下分析弹性酶活性。填充酒吧）或存在（开放式酒吧）中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂（Nei）。同样地，从刺激的细胞中分离出网，并用DNA酶或MNA酶消化，或者保持未消化的（ - ），然后以相同的方式分析弹性蛋白酶活性。（b）在缺乏或存在Nei的情况下在净（dNase-digested）治疗后，测量A549细胞的细胞毒性。对于MNA ase或非消化网以及0.125至1mm的不同NEI浓度，可以看到类似的结果。显示的是三个独立实验的代表性数据（平均值公式的形象SD），***P.<0.001和ns =非显着性。
图7.
图7. myeloperoxidase抑制中度降低了上皮细胞的净诱导的细胞毒性。
未消化或dnase消化的NET在不含或含髓过氧化物酶抑制剂(MPOI)的情况下预孵育，然后NET与上皮细胞、A549或AT-II细胞孵育16 h，并定量细胞毒性。单独MPOI (37ng /ml)对上皮细胞无毒性作用。图中显示的是三个独立实验(对于AT-II细胞，n = 2)的代表性数据公式的形象SD) *P.<0.05和ns =非显着性。
图8.
图8. LPS诱导肺损伤小鼠模型中的净形成。
（A）与对照部分进行小鼠肺部的免疫荧光染色，与对照部分相比，用于DNA /组蛋白（红色），中性粒细胞弹性蛋白酶（绿色）和DAPI（蓝色）。随机选择的插入（1,2和3）的较高倍率视图显示了净结构中的中性粒细胞弹性蛋白酶（绿色）和DNA /组蛋白（红色）的共定位。（b）对来自PBS或LPS处理的小鼠的切片的免疫荧光染色用于DNA /组蛋白（红色），CD46（绿色）作为细胞膜标记和DAPI（蓝色）。随机选择的插入（4,5和6）在LPS处理的肺中显示出在较高倍率视图中的净形成，如细胞外染色质，细胞膜的崩解以及DAPI的弱信号（染色质裂缝的指示）。单独的DAPI和单独的DNA /组蛋白也被示出为插入4,5和6.在A和B中，黄色箭头表示与网相邻的一些组织破坏区域。所示是具有组织染色的10个字段的代表图片。（c）24小时后小鼠免疫荧光染色小鼠在24小时内肌髓氧基酶（MPO，红色），瓜氨酸酶，瓜氨酸组蛋白H3（CIT HIS3，Green）和DAPI（蓝色）进行。所选区域的较高的倍率视图（右塔）显示髓过氧化物酶的共定位，其中瓜氨酸组蛋白H3表示净形成。
图9.
图9.小鼠BALF中的中性粒细胞（PMN）在LPS处理后产生净净。
（a）募集到肿瘤内LPS管理后募集到小鼠BALF的PMN，以不同的时间间隔计算。（b）以相同的时间间隔，在BALF的上清液中测量中性粒细胞弹性蛋白酶活性（自由弹性酶，开放式棒）以及在Balf的Mnase消化颗粒中（净相关的弹性蛋白酶，填充条）。（c）从小鼠的小鼠中分离PMN，用LPS刺激24小时，对DNA /组蛋白（红色），CD46（绿色）和DAPI（蓝色）进行分离细胞的免疫荧光染色（上行）。用pMA进一步刺激分离的PMN 1.5小时（下行）;箭头表示净形成，通过细胞外染色质的外观，细胞膜崩解以及染色质解囊来证明。显示的是三个独立实验的代表性数据（平均值公式的形象SD），***P.<0.001。
在PMC中查看此图像和版权信息

类似的文章

查看所有类似的文章

被引用340.文章

查看所有“引用”文章

参考文献

    1. Kanthack Aa，Hardy WB。哺乳动物湿润细胞的形态和分布。j physiol。1894; 17：80 81-119。-PMC-PubMed.
    1. Decoursy Te，Ligeti E. NADPH氧化酶活性的调节和终止。细胞mol寿命。2005; 62：2173-2193。-PubMed.
    1. 内甘蓝核糖核病和免疫：挑战和机遇。NAT Rev Immunol。2006; 6：173-182。-PubMed.
    1. Fuchs Ta，Abed U，Goosmann C，Hurwitz R，Schulze I等。新细胞死亡计划导致中性粒细胞细胞外陷阱。J细胞BIOL。2007; 176：231-241。-PMC-PubMed.
    1. Brinkmann V，Reichard U，Goosmann C，Fauler B，Uhlemann y等。中性粒细胞细胞外捕获细菌。科学。2004; 303：1532-1535。-PubMed.

出版类型

网格术语

物质

Linkout - 更多资源

反馈