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。 2011年10月28日; 147（3）：525-38。
DOI：10.1016 / J.Cell.2011.10.001。

远端气道干细胞在H1N1流感感染后体外和肺再生过程中的肺泡

Pooja a Kumar.1那 Yuanyu Hu那 yusuke yamamoto.那 Neo Boon Hoe.那 泰硕伟那 达海穆那 燕太阳那 LIM SIEW JOO.那 拉尼娅Dagher那 Elisabeth M Zielonka那 德云王那 冰头那 文森特Ť周那 克里斯托弗P crum.那 WA Xian.那 弗兰克麦克斯顿
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远端气道干细胞在H1N1流感感染后体外和肺再生过程中的肺泡

Pooja a Kumar.等等。 细胞。 。
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在这种过程中灾难性损伤后肺再生的程度和成人干细胞的潜在作用仍然模糊不清。与1918大流行触发器相关的H1N1流感病毒的核对致死感染大规模的气道损伤，随后是明显的再生。我们在此显示在充血性上皮中的表达P63表达干细胞在感染后经历快速增殖，并辐射到肺泡消融的中间体烧蚀区域。在那里，这些细胞组装成离散，KRT5 +豆荚，并引发典型的肺泡标记的表达。这些豆荚的基因表达谱表明它们是肺泡 - 毛细血管网络重建中的中间体，其被病毒感染造成的肺泡 - 毛细血管网络。肺再生中该P63表达干细胞的动态镜像我们的平行发现，所述人远端气道干细胞的定义群体在体外组装肺泡状结构，并向急性和慢性气道疾病提出新的治疗途径。

数字

图。1
图1.感染肺中P63 / KRT5表达细胞的出现
A.感染，并在11dpi控制肺。肺水肿和出血的肺部感染是显而易见的。在渐进DPI（顶面板）肺组织中的病毒B. M2蛋白的表达。在对应dpi的（下图）的肺组织学。图形描绘病毒载量与肺组织损伤的总体趋势。比例尺，200微米。下和在11dpi的p63的表达在0dpi在肺的部分细胞（顶部）检测。秤杆，20μm。D.在肺实质p63和表达KRT5的共定位在“吊舱”在15dpi。布尔，支气管。秤杆，20μm。E. krt5（棕色）的定位在15dpi。布尔，支气管。比例尺，100微米。F.在Brdu标记4天后在15dpi下检测Brdu（绿色）和Krt5（红色）。布尔，支气管。比例尺，100微米。
图2
图2.从人肺中克隆和谱系跟踪细胞肺细胞
A.人类气道的示意图作为干细胞克隆的细胞来源。nescs.，鼻上皮细胞;TASCs，气管藻上上皮细胞;DASCS.，小气道上皮细胞。左侧面板，上皮细胞克隆在照射的瑞士3T3细胞上。中间伙计，p63免疫荧光。右侧小组，角蛋白5（KRT5）免疫荧光。秤条，50μm。NESC，TASC和DASC表达谱的比较B.热图。C.主成分分析表达微阵列的（PCA）。D.示意图显示谱系追踪和扩张。NESCs的E.空气 - 液体界面（ALI）分化通过抗体微管蛋白和粘蛋白5A，分别标记纤毛细胞和杯状细胞表示。纤毛细胞计数的柱状图（浴缸）和脚杯细胞（muc）。在3T3饲养细胞（NESC-3T3）上比较NESC的表达热图与Ali培养物分化的那些。秤杆，20μm。F. NESCS的自组装球体（SAS）测定。染色Sass与管蛋白（绿色）和muc5a（红色）的抗体分别显示纤毛细胞和脚卵细胞。Heatmap描绘了NESC的差异基因表达和SAS培养物中的那些。秤条，50μm。G. 21天3-D Matrigel培养NESCC（相位对比，左上面板）和使用抗体的共聚焦免疫荧光，使用抗体和KRT10（右上面板和左下面板）。秤条，50μm。NESC的基因表达热图和基质素（右下方）。 H. PCA of whole genome expression microarrays of NESCs and those differentiated by indicated methods.
图3.
图从DASCs 3.肺泡状结构在3-d的Matrigel培养
A. Tascs和Dascs在21天的Ali培养后使用抗体（绿色）和Muc5a（红色）以分别揭示纤毛细胞和脚卵细胞。秤杆，20μm。基因表达差异在阿里培养中分化的基因表达差异。B.在3-D Matrigel中21天后由Tascs和Dascs形成的结构的比较。顶面板，塔斯卡球的相互感和共聚焦图像。与鳞状标记物Krt10（红色）的抗体共聚焦免疫繁糖。秤杆，20μm。底部面板，以下在基质胶和共聚焦免疫荧光图像21天表示PDPN免疫荧光通过DASCs形成多泡，unilaminar结构。秤条，50μm。C。顶面板，对人体肺部深处用抗肺泡单克隆抗体4C10染色模式的免疫荧光显微照片。比例尺，100微米。底部面板，单克隆抗体4C10的上的结构的免疫荧光显微照片从DASC线在为期21天的培养物的Matrigel开发。秤条，50μm。D.的热图中差异表达的从在3-d的Matrigel分化DASC的微阵列和TASC线基因。被都是差分Matrigel中表达，并且在小鼠肺的间质区域中表达的基因DASC的E.热图。从TASC和DASC分化3 d基底膜文化派生的数据集F.基因集富集分析。
图4.
的图4保护肺泡状大鼠DASC谱系分化
A.大鼠DASC在3T3细胞上衍生自深肺组织的单细胞悬浮液。左上方，相反;左下方，免疫荧光与抗p63抗体（红色）。中间伙计，在3-D matrigel培养中21天后由大鼠DASC谱系统群制的UniLaminar结构的图像。秤条，50μm。B.展示用大鼠肺癌免疫小鼠的示意图并对间质肺特异性单克隆抗体进行筛选。C.用抗肺泡单克隆抗体13a1和54d1从大鼠DASC系列从大鼠DASC系列产生的大鼠深肺和UniLaminar结构的免疫荧光。比例尺，100微米。D.来自多种体外模型的细胞型气道干细胞的分化电位的示意图。E.描绘Tasc和Dasc干细胞谱系之间的差异表达基因的Venn图，而下面的图形表明TaSC和DASC之间的基因表达的绝对折叠变化在17,000多个信息基因中。
图5.
图5.感染后肺部的基础细胞群的扩展
左上，源自三周龄小鼠肺的基础细胞典型殖民地的图像。比例尺，200微米。右上，用抗KRT5（绿色）和抗P63（红色）染色的典型菌落的免疫荧光图像。秤条，50μm。左下角，通过克隆细胞生长在3-D matrigel培养中产生的球体的形象10天显示中空腔。秤条，50μm。右下方，用抗AQP5抗体染色的3-D球体部分。秤条，50μm。B. Heatmap显示克隆干细胞和3-D基质球中所选基因的相对基因表达模式。C.在12dPI下从对照和感染的小鼠获得的菌落号的定量。 Number of mice n=7. Error bars, SD of mean. D. Heatmap of differentially expressed genes (> two-fold) between three different colonies obtained from control and infected lungs. E. Unsupervised clustering analysis using whole transcriptome for control and infected colonies. F. Immunofluorescence micrographs showing distribution of Krt5 (left panel; green), Krt6 (middle panel; green), and p63 (red) and Krt6 (green) in sections of 12dpi lung (right panel). Bronchiolar and interstitial lung regions are marked. Scale bar, 20µm. G.GSEA survey data showing enrichment of wound healing gene expression in colonies derived from infected lung.
图6.
图6.感染肺牙科肝癌kRT5豆荚的动态
A.感染肺部的切片显示KRT5免疫组化显示的KRT5荚的可变外观。秤杆，20μm。B.在11,15和21dpi时定量KRT5 POD大小类别。计数在11,15和21dpi的簇（N）分别为200,424和572。C。左侧面板，具有11b6单克隆抗体的正常肺的染色，显示肺泡特异性信号。中间板，分别具有11b6单克隆抗体（绿色）和Krt5抗体（红色）的受损肺中Krt5荚的染色。右侧小组，中间板的11b6和Krt5抗体信号的合并。D.在指定的DPI上定量每次KRT5 +细胞区域的KRT5 + 11b6 +细胞。小鼠数n = 4。误差条表示平均值的标准偏差。秤条，50μm。E.用PDPN（红色）（左面板）的抗体染色正常肺。中间伙计，受损肺部区域的染色缺少与PDPN（红色）和P63（绿色）抗体的KRT5荚表显示不存在信号。右侧小组，PDPN的共定位受损的肺有KRT5豆荚集群的区域（红色）和p63（绿色）。秤条，50μm。F.的KRT5荚有关具有KRT5表达细胞（红色星）和不存在周围缺乏KRT5表达细胞（绿色星）细支气管KRT5荚果的细支气管肺12dpi表示集群组。比例尺，100微米。直方图报告细支气管周围簇的直接计数的KRT5豆荚邻近用（93.8％）和不KRT5表达细胞细支气管。部分N = 32的数。误差线，均值SD。
图7.
图7.区域不同感染肺的基因表达谱
A. 25dpi肺部染色抗体，krt5（绿色），spc（红色），并用dapi（蓝色）染色。四个区域用盒子作为激光捕获微量碎裂靶1）SPC +细胞在密集渗透的区域，2）KRT5荚，3）SPC-/ KRT5区，具有致密浸润的SPC / KRT5区，4）SPC +细胞正常肺部。插图显示了与区域1-4相对应的三个独立LCM样本的PCA。比例尺，200微米。B. 2205差异表达基因的热线图具有p值<0.05的区域1-4的LCM样品。基因集群广告表示。C.基因集群基因本体学分析广告在Heatmap中向相关的P值表示。D.指示与区域集合在10-4的数据集中连接到肺泡中的个体基因的相对表达的热图。
图8
图8. KRT5细胞对流感感染的谱系序列跟踪和响应的示意图
A.在表明DPI下流感感染肺癌中KRT14表达的定位。布尔，支气管。秤杆，20μm。B.通过KRT14-CRE重组酶活化的β-半乳糖苷酶的条件表达等位基因示意图。C. Lacz染色（蓝色）和KRT5免疫化学（棕色）在25dpi小鼠肺中。秤杆，20μm。D.描绘两种支气管的原理图（布尔）在基底膜上具有罕见的KRT5表达细胞，其响应于感染（顶部）或被感染（底部）杀死。早期的KRT5豆荚由11dpi显而易见，并在第25天的腔内形成成熟。它们如何链接到肺泡毛细血管的主要问题（AV.）表示床和支气管。
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  • 肺再生呼吸新鲜空气。
    Beronja S，福斯E. Beronja S等人。 细胞。2011年10月28; 147（3）：485-7。DOI：10.1016 / j.cell.2011.10.008。 细胞。2011年。 PMID：22036554 免费PMC文章。

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