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。 2011年9月; 45（3）：582-91。
doi: 10.1165 / rcmb.2010 - 0108摄氏度。 Epub 2011年1月14日。

分化的人肺泡II型细胞对甲型流感病毒的先天免疫反应

吉尔尤王1那 尼拉尼·尼克拉德先生那 Tzulip Phang那 比夫高那 泰勒阿尔福德那 洋子Ito那 凯伦eDEEN那 艾米丽一个Travanty那 Beata Kosmider.那 Kevan Hartshorn.那 罗伯特梅森
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分化的人肺泡II型细胞对甲型流感病毒的先天免疫反应

吉尔尤王等等。 Am J Respir Cell Mol Biol。 。
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肺泡II型(ATII)细胞是季节性和大流行性流感的重要靶点。为了研究这些细胞中流感诱导的固有免疫反应，我们测量了高分化的ATII细胞在接种流感病毒4小时和24小时后感染的多重倍数为0.5时的整体基因表达谱。流感感染刺激了许多宿主防御相关基因的mRNA浓度显著增加，包括模式/病原体识别受体、IFN和IFN诱导基因、趋化因子和细胞因子信号抑制因子。我们通过实时荧光定量RT-PCR验证了这些变化。在蛋白水平上，根据ELISA方法，我们检测到病毒诱导的三种谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)阴性趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11分泌旺盛。紫外线灭活病毒可消除趋化因子和细胞因子反应。病毒感染并没有改变ATII细胞的分化，通过细胞mRNA和表面活性蛋白的浓度来测量。而病毒感染显著降低了表面活性蛋白(SP)-A和SP- d的分泌。此外，甲型流感病毒触发了ATII细胞中磷脂酰肌醇3-激酶信号的时间依赖性激活。这一途径的抑制显著降低了感染性病毒的释放和趋化因子反应，但没有改变病毒诱导的细胞死亡。 This study provides insights into influenza-induced innate immunity in differentiated human ATII cells, and demonstrates that the alveolar epithelium is a critical part of the initial innate immune response to influenza.

数字

图1。
图1。
原代培养的人肺泡II型（ATII）细胞具有分化表型体外将ATII细胞悬浮在含有10%FBS和抗生素的Dulbecco最低基本培养基中，在涂有20%Matrigel和80%鼠尾胶原的插入物上放置2天，并与角质形成细胞生长因子（K）一起培养2天，再与KIAD一起培养2天。对细胞进行相位显微镜检查(一种用表面活性剂蛋白（SP）-A（SP）-A（×4），×20）和免疫荧光染色（b，红色，×40），proSP-B(C,绿色和E-钙粘蛋白(D、红，×40）。（E.）通过蛋白质印迹评估ATII细胞分化蛋白的表达，并与新鲜分离的ATII细胞和用1％炭汽提（CS）-FBS培养的细胞进行比较。泳道1，新鲜孤立的ATI细胞;巷21% CS-FBS培养细胞;巷3， K培养2天，KIAD再培养2天。SP-B在非还原条件下运行。将蛋白负荷归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
图2。
图2。
来自微阵列实验的人类ATII细胞中流感诱导的细胞因子和IFN相关基因的热图。从三名患者的肺部分离的ATII细胞进行培养，并感染流感A/PR/8/34（PR/8）病毒。从接种后4小时和24小时（PI）的病毒感染和非感染细胞中提取RNA，并进行Affymetrix HG-U133 Plus 2.0基因芯片分析。使用R统计软件（R基金会，维也纳，奥地利）的“热图”函数对先天免疫基因的反应进行聚类。(一种)细胞因子相关基因。（B.)24小时PI时的细胞因子相关基因(C）IFN相关基因在4小时的PI。（D.)干扰素相关基因。
图3。
图3。
验证甲型流感病毒（IAV）-在mRNA和蛋白质水平上诱导ATII细胞的先天性免疫反应。培养ATII细胞并感染PR/8病毒或不感染PR/8病毒。在4小时和24小时PI时收集细胞，通过实时RT-PCR评估先天免疫应答基因的mRNA表达，并通过ELISA评估24小时PI时ELR阴性趋化因子的分泌。(安妮实时rt - pcr)。（一种)ELR阴性CXC趋化因子(B.)细胞因子信号抑制剂（SOCSs）(C)病原体识别受体（PRR）(D.）IFN基因。（E.) IFN-stimulated基因。数据显示了每个基因相对于组成探针36B4的表达水平(5)。F) CXCL9-11蛋白的ELISA分泌。开酒吧，无感染细胞;固体酒吧病毒感染细胞。*P.< 0.05和**P.< 0.01与未感染细胞比较;N= 8。
图4。
图4。
紫外（UV）病毒的灭活消除了ATII细胞中的IAV诱导的反应。用活性Pr / 8或UV灭活的PR / 8感染ATII细胞，并在实时RT-PCR和24小时内收获用于在4小时和24小时的先天免疫应答相关基因的mRNA变化。通过ELISA的24小时评价IL-29和CXCL10的分泌。（一种实时rt - pcr)。开酒吧，无感染细胞;固体酒吧，活病毒感染细胞;条纹栏，紫外线灭活病毒感染细胞(B.) ELISA。*P.< 0.05, * *P.<0.01，和***P.<0.001，与无感染细胞;N= 4.
图5。
图5。
用IAV感染刺激AKT和ERK在人ATII细胞中的磷酸化（P）。培养的人类II型细胞在MOI的PU / 8病毒中感染5.在指定的时间点，收获细胞蛋白质，并通过Western印迹表达磷酸化和总Akt和ERK信号传导。（一种)来自四名患者中的一名的代表性结果。泳道1、模拟（无病毒）或时间0；巷2，加入病毒后15分钟;巷3，加入病毒后30分钟;巷4，加入病毒后1小时;巷5，加入病毒后4小时;6巷，加入病毒24小时后。（B.)信号蛋白在病毒感染的ATII细胞中相对表达的定量分析。**P.<0.01，与无感染细胞;***P.<0.001，与无感染细胞;N= 4.
图6。
图6。
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的抑制降低了流感病毒颗粒的释放和病毒诱导的趋化因子反应，但在ATII细胞中不会损害病毒感染。用PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂PD98059处理培养的人类II细胞，在接种PR / 8病毒接种前1小时。感染后，细胞不断用抑制剂培养。在24小时，用IAV的鼠抗核蛋白固定，将细胞固定为荧光染色。评价细胞上清液通过标准斑块测定和CXCL9，CXCL10，CXCL11和IL-29的分泌物通过ELISA释放传染性病毒。（一种）分泌趋化因子。数据表示为单独的病毒分泌的百分比。（B.）释放传染性病毒。（C）免疫荧光染色与流感核蛋白。*P.<0.05，与单纯病毒治疗相比***P.<0.001，与单纯病毒治疗相比。
图7。
图7。
紫外线灭活病毒，而不是PI3k抑制剂，可消除IAV诱导的caspase-3和聚ADP核糖聚合酶（PARP）的激活用活的和紫外线灭活的PR/8病毒感染培养的人II型细胞。从同一孔的附着和分离细胞中收集细胞蛋白，并评估病毒核蛋白（NP）、半胱氨酸蛋白酶-3（Casp3）的表达一些细胞在接种前1小时用PI3k抑制剂LY294002处理，并在整个感染过程中与抑制剂一起孵育(一种)来自三名患者之一的代表性结果。泳道1,控制细胞;巷2，Live Pr / 8病毒感染细胞;巷3，紫外线灭活PR/8病毒感染细胞;巷4、PI3k抑制剂和PR/8病毒处理的活细胞。（B.）在每个条件下归一化蛋白质的相对表达的定量（N= 3).
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