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． 2010年7月22日；6（7）：e1001014。
内政部：10.1371/journal.ppat.1001014。

来自H5N1和20世纪大流行性流感病毒的PB1-F2蛋白引起免疫病理

朱莉L McAuley1., 杰里e chipuk., 凯利L博伊德, Nick Van de Velde, 道格拉斯·R绿色, 乔纳森一个麦卡斯
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来自H5N1和20世纪大流行性流感病毒的PB1-F2蛋白引起免疫病理

朱莉L McAuley等 公共科学图书馆Pathog． ．
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摘要

由于最近出现了一种新的大流行毒株，目前人们对了解流感病毒毒性的分子特征有浓厚的兴趣。研究了流行病学上重要的甲型流感病毒株的PB1-F2蛋白，以确定其功能和对毒力的贡献。利用源自PB1-F2 c端序列的27个肽段和在共同背景下工程的嵌合病毒，我们证明了通过PB1-F2诱导细胞死亡依赖于BAK/BAX介导的细胞色素c从线粒体释放。这一功能对A/Puerto Rico/8/34的PB1-F2蛋白特异，未见使用过去大流行菌株衍生的PB1-F2肽。然而，来自20世纪三种大流行毒株和H5N1亚型高致病性毒株的PB1-F2蛋白显示增强肺部炎症反应，导致病理增加。最近流行的季节性流感A株不具备这种促炎功能，在人类适应过程中通过截断或突变失去了PB1-F2蛋白的免疫刺激活性。这些数据表明，当PB1基因片段最近来自禽类宿主时，PB1- f2蛋白有助于大流行毒株的毒力。

利益冲突陈述

作者宣称不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1所示。本研究使用的病毒PB1-F2序列。
提出了几种流行病学性重要菌株的PB1-F2蛋白的预测氨基酸序列的比较。图底部的彩色线代表了预测螺旋区（蓝色）的氨基酸组成，本研究中使用的27-MEL肽（绿色），以及预测的线粒体靶向序列（红色）。蓝色阴影突出了季节性（1995）和大流行（1968）H3N2菌株之间预测氨基酸序列的差异。黄色阴影表明预测氨基酸涉及PR8的细胞死亡表型（见讨论）。绿色着色突出了N66S突变，是1918年大流行菌株的预测毒力决定因素。
图2
图2. PB1-F2导致细胞死亡。
通过检测膜联蛋白，在人上皮A549和小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系中确定了细胞死亡的诱导+PI.+A和B）暴露于源自PB1-F2蛋白质C端区域的27-肽组（定义见图1）、源自PR8的N-端27-肽组（每个肽的最终浓度为50µM）或无肽组1小时后的事件；以及在感染后12小时和8小时，以1.0的感染倍数感染一组重组病毒（参见病毒定义方法；H3N2 PB1来自a/武汉/359/95）。星号（*）表示与a）所有其他肽和对照组相比存在显著差异，B）除PR8和1918外的所有肽和对照组，C&D）所有具有源自H1N1病毒的PB1基因片段的病毒和无病毒对照组（ANOVA）（p<0.05）。
图3
图3。PB1-F2介导的细胞死亡是病毒株特异性的。
A & B)细胞色素检测MOMP分析C从鸡、鸭、雪貂和小鼠肝脏中提取的重膜组分(线粒体)的多肽(定义见图1)暴露于western blot后释放伯灵顿- / bak - / -老鼠）。a）暴露于1,10,100和1000μmpr8肽的线粒体1小时显示细胞色素的释放C颗粒(p)含有完整的线粒体，其中含有未释放的细胞色素C．b）暴露于肽板的线粒体，分析上清液以进行细胞色素C释放。C8-BID被用作哺乳动物线粒体的阳性对照。CHAPS溶解线粒体膜，使释放释放总细胞色素C．C)野生型和D)细胞死亡的诱导伯灵顿- / bak - / -鼠胚胎成纤维细胞（MEFS）在1小时内暴露于肽面板（终浓度为50μm）。星号（*）表示与ANOVA的所有其他肽和对照相比的显着差异（P <0.05）。
图4
图4。PB1-F2肽可增强肺部炎症。
各组小鼠暴露于肽组(最终浓度100mm，定义见图1)，并在24小时后实施安乐死。用流式细胞术检测动物BAL液中A)巨噬细胞和B)中性粒细胞的平均数量，与未暴露小鼠或暴露于n端对照肽的小鼠进行比较。星号(*)表示通过方差分析与1995年H3N2肽和对照组相比有显著差异(p<0.05)。双星号(**)表示与对照组相比有显著差异。误差柱表示与平均值的标准差。C)在一组单独的实验中，对暴露于肽的小鼠进行监测，以观察其明显的疾病迹象和初始体重的百分比变化。为清晰起见，肽按A和B中确定的炎症电位分组。
图5
图5。PB1-F2可增强病毒介导的肺部炎症。
用病毒组感染小鼠组（参见定义方法），并在感染后安乐死72小时。与缺乏表达PB1-F2的病毒感染的未感染的小鼠或小鼠相比，通过流动 - 细胞术测定来自动物的平均数量，B）巨噬细胞和C）中性粒细胞的BAL流体测定。星号（*）表示与感染ΔPB1-F2 / PR8或BEIJ PB1-F2 / PR8病毒和通过ANOVA的未感染的对照动物的动物相比的显着差异（P <0.05）。双星号（**）表示与感染Beij PB1-F2 / PR8病毒和未感染的对照动物感染的动物相比的显着差异。与感染H5N1ΔPB1-F2 / PR8病毒和未感染的对照动物感染的动物相比，三颗星号（***）表示显着差异。误差条表示与平均值的标准偏差。
图6
图6。PB1-F2衍生肽可引起炎症和肺病理。
各组小鼠暴露于肽组(最终浓度100mm，定义见图1)，72小时后安乐死。肺被切除，通气，切片，苏木精和伊红染色以进行组织病理学评估。具有代表性的40×切片显示了暴露于A) PR8, B) H1N1 1918, C) H2N2 1957, D) H5N1 2004, E) H3N2 1995，或F)无肽对照的PB1-F2蛋白的多肽的小鼠。
图7
图7。PB1-F2参与流感病毒介导的免疫病理学。
如所示，将一组小鼠感染一组病毒(见定义方法)，并在感染72小时后对其实施安乐死。在A)苏木精和伊红染色或B)应用MPO特异性抗体、马萝卜过氧化物酶偶联二抗、DAB染色和苏木精反染色后，将肺切除、通气、切片并检查组织病理学。
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参考文献

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