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． 2010年3月,120(3):827 - 39。
doi: 10.1172 / JCI36362。 Epub 2010年2月8日。

von Hippel-Lindau Chuvash突变促进小鼠肺动脉高压和纤维化

米歇尔·M·希基1， 特里理查森， 王涛， Matias Mosqueira， Evguenia Arguiri， 余宏伟， Qian-Chun余， Charalambos C Solomides， 爱德华·E·莫里西， Tejvir S Khurana， Melpo Christofidou-Solomidou， 塞莱斯特·西蒙
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von Hippel-Lindau Chuvash突变促进小鼠肺动脉高压和纤维化

米歇尔·M·希基et al。 J临床投资． 2010年3月．
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摘要

von Hippel-Lindau (VHL)肿瘤抑制蛋白在密码子200 (R200W)的突变与一种称为Chuvash红细胞增多症的疾病有关。除了红细胞增多症，Chuvash患者还伴有肺动脉高压和呼吸频率增加，尽管这些症状的病理生理基础尚不清楚。在这里，我们试图通过研究R200W Vhl突变的纯合子小鼠(VhlR/R小鼠)作为楚瓦什病的模型来解决这个问题。这些小鼠出现独立于红细胞增多症的肺动脉高压，并增强了与楚瓦什患者相似的常氧呼吸，进一步验证了VhlR/R小鼠作为楚瓦什病的模型。VhlR/R小鼠的肺表现出肺血管重塑、出血、水肿和巨噬细胞浸润，老年小鼠的肺也表现出纤维化。VhlR/R小鼠的肺中HIF-2alpha活性增加，Hif2a的杂合子性，而非Hif1a，在基因上抑制了VhlR/R小鼠的红细胞增多症和肺动脉高压。此外，在VhlR/R肺中，Hif2a杂合子导致了对血管重塑、出血和水肿的部分保护，但没有炎症，这表明HIF-2alpha在肺病理中具有选择性作用，从而为肺动脉高压的机制提供了见解。这些发现有力地支持了楚瓦什表型对HIF-2alpha的依赖性，并为楚瓦什患者提供了潜在的治疗方法。

数据

图1
图1所示。VhlR / R(R/R)小鼠发生肺动脉高压。
（一个老年红细胞增多者收缩压增加1.5倍VhlR / R7个月大的小鼠与WT对照(n每个基因型= 12-13)。10周大时PA压已经升高VhlR / R小鼠(1.4倍大，n= 20-25)，在红细胞压积(HCT)水平显著升高和红细胞增多症发生之前(**P< 0.001， ***P< 0.0004)。（B）VhlR / R7个月时心脏显示右心室肥厚(箭头)。（C和D)心脏/体重比率(C，n= 18-21)和RV壁厚(D，n= 11-17)均显著增加VhlR / R小鼠(分别大1.2倍和1.5倍**P< 0.009)。（E完全肌肉化血管(F)、部分肌肉化血管(P)和非肌肉化血管(N)的分布发生移位VhlR / R与野生型动物相比，全肌肉化血管比例增加，非肌肉化血管比例减少(n=每个年龄每个基因型4-5个，**P< 0.006)。比例尺:300 μm。
图2
图2。基线呼吸升高VhlR / R老鼠。
（一个- - - - - -C7至8个月大时进行呼吸评估VhlR / R在常氧条件下(21% O2)和不同程度的缺氧(18%，15%或12% O2)．通气率(f，一个)和潮气量(VT，B)大约增加了1.2倍VhlR / R在常氧和低氧条件下的小鼠，对应于1.5倍的分钟通气(VE，C） （n= 42-48， *P< 0.05， **P< 0.001)。在WT和VhlR / R只有在更严重的缺氧(12% O2)．（D)圣2减少了VhlR / R在低氧条件下，18%(1.3倍)和12% O2(2.5倍)，表示摄氧量受损(n=每个基因型4只小鼠，每个O测量3次2水平;＊P< 0.02， **P< 0.005)。
图3
图3。纤维化在老年人中发展VhlR / R肺。
（一个和B)纤维连接蛋白沉积(棕色)失调并增强VhlR / R7个月大时的肺(B)．（C和D),这些VhlR / R肺也显示胶原纤维堆积(蓝色部分)，如马松三色图所示。大量胶原染色常局限于邻近出血区域(D(箭头)和单个核浸润(D箭头)。（E- - - - - -HEM分析还显示，老年人胶原蛋白含量增加VhlR / R肺(F和H，星号)，与WT对照(E和G)．（我)尽管在年轻人中羟脯氨酸水平没有变化VhlR / R肺(10周，n= 4)，老年突变体肺中胶原沉积增加(1.4倍)。n= 5， *P< 0.02)，提示存在纤维化。（J组中tenascin c阳性细胞数量显著增加(2.6倍)VhlR / R这表明与WT小鼠相比，成纤维细胞增加(n= 5， ***P< 0.0008)。比例尺:20 μm (一个- - - - - -D)， 2 μm (E和F)， 0.5 μm (G和H)．
图4
图4。R200W突变导致肺出血和水肿。
（一个和B)有轻度至中度出血区域VhlR / R（B，箭头)与WT肺(一个) 7个月大时的肺。（C- - - - - -E)通过在BAL液细胞旋中标记含铁血黄素阳性细胞来定量出血(C和D星号)。阳性细胞的数量VhlR / R肺在10周时略微增大(1.6倍)，7月龄时明显增大(4.8倍)(E，n= 10 /基因型，*P< 0.05)。（F突变体肺也出现水肿，可见肺泡壁增厚(箭头)。（G- - - - - -J) EM示肺泡壁明显增厚，间质间隙扩张，证实有水肿VhlR / R肺(H和J，箭头)与WT对照(G和我)．此外,VhlR / R内皮细胞有时不规则且不连续(J箭头)。星号在H表明胶原沉积。（K和l)单元格数目(K，为2.1倍)VhlR / R肺部，以及两个年龄的BAL总蛋白浓度(l， 1.2倍)(n= 5 - 10;＊＊＊P< 0.0001;＃ P< 0.08，趋向显著性)。部分一个，B,F被马松三色染色比例尺:20 μm (一个，B,F)， 10 μm (C和D)， 2 μm (G和H)， 0.5 μm (我和J)．
图5
图5。巨噬细胞浸润增加VhlR / R肺。
（一个- - - - - -C)与WT肺相比(一个)，VhlR / R7个月大时，肺部出现巨噬细胞浸润斑块(B和C箭头)。这些细胞有时与淋巴细胞相关(C(箭头)和内含的空泡表明吞噬活跃(C)．（D- - - - - -F) Mac-3染色(D和E，棕色，箭头)显示巨噬细胞增加VhlR / R10周及7个月时的肺(E)，经定量证实(F，分别增长1.4倍和2倍，n= 5 /基因型，*P< 0.02， ***P< 0.001)。（G- - - - - -我)巨噬细胞浸润VhlR / R肺(G和我(箭头)常与纤维连接蛋白沉积增强区(H(棕色)和胶原蛋白积累(我(马松三色蓝染色)。比例尺:50 μm (一个和B)， 20 μm (C- - - - - -E，G,H)， 10 μm (我)．
图6
图6。HIF靶基因表达增加VhlR / R肺。
（一个和B)采用TaqMan real-time PCR检测HIF靶细胞的肺表达。许多HIF靶标基因可能有助于VhlR / R肺表型上调，包括Serpine1，Edn1，Pdgfb,Cxcl12，年龄均大于7-8个月，一个)和更小的(10周，B老鼠)。hif -1α特异性靶标的表达Aldoa和Pgk1在老年人群中没有变化VhlR / R而hif -2α -优先基因的mRNA水平，如Serpine1显著提高了VhlR / R肺(一个和B) (*P< 0.03， **P< 0.007,＃ P< 0.06)。（CET-1蛋白表达在老年人中也有所增加VhlR / RELISA法测定(3.2 fold， ** .P< 0.004)。（DHIF-2α蛋白表达增加VhlR / R肺与WT对照组比较;相比之下，HIF-1α在WT和VhlR / R肺。
图7
图7。红细胞增多和肺动脉高压的表型依赖于HIF-2α活性的增加。
（一个的1个等位基因丢失Hif2a，但不是Hif1a，恢复红细胞压积水平VhlR / R小鼠WT水平(n= 5-8， ***P相比< 0.0001VhlR / R老鼠)。H1 + / -,Hif1a+ / -;H2 + / -,Hif2a+ / -．（B年收缩压部分但显著降低VhlR / RHif2a+ / -老鼠(n= 20-23， ***P相比< 0.0001VhlR / R老鼠)。（C和D右心室肥厚在VhlR / RHif2a+ / -老鼠(C、箭头和D，n= 4-6， *P与WT心脏相比< 0.05)。（E)仅杂合子为Hif2a导致完全肌肉化的肺血管显著减少(1.2倍)，同时非肌肉化血管增加到WT水平(1.6倍)(n= 4-5个基因型，*P相比< 0.03VhlR / R肺)。（F)中HIF靶基因的表达VhlR / R小鼠的杂合性降低到接近WT水平Hif2a，但不是Hif1a（n= 5， *P< 0.03， **P< 0.008VhlR / R肺)。比例尺:300 μm。
图8
图8。有些，但不是全部，VhlR / R肺表型依赖于HIF-2α活性。
（一个)每个基因型的代表性肺图像表明两者都不是Hif1a也不Hif2a杂合子性完全恢复了WT型肺结构(马森三色染色)。（B羟脯氨酸含量均降低VhlR / RHif1a+ / -和VhlR / RHif2a+ / -与肺相比VhlR / R（n= 4-6 /基因型，*P与WT对照相比< 0.02)。（C)两组巨噬细胞浸润均无明显影响VhlR / RHif1a+ / -或VhlR / RHif2a+ / -肺(n= 5， **P与WT相比< 0.007)。（D)相反，只是Hif2a通过含铁血黄素染色定量，杂合子导致出血表型的部分挽救(n= 5-7， *P与WT对照组相比< 0.01)。（E和F)同样地，BAL中的细胞数从VhlR / RHif2a+ / -肺恢复到接近WT水平，提示水肿得到缓解(E，n= 5， *P< 0.05VhlR / R肺)。有降低BAL蛋白浓度的趋势VhlR / RHif2a+ / -肺(F，n= 5， *P< 0.01， **P与WT肺相比< 0.003)。比例尺:20 μm。
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