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。 118年5月,2008 (5):1846 - 57。
doi: 10.1172 / JCI32503。

一个抗增殖BMP-2 / PPARgamma apoE轴在人类和小鼠smc及其在肺动脉高压中的作用

Georg汉斯曼1, 维尼乔·德·耶稣佩雷斯, Tero-Pekka Alastalo, 克里斯蒂娜•M Alvira, 克利斯朵夫Guignabert, 珍妮M Bekker, Stefan Schellong, 隆Urashima, 菱王, 尼古拉斯·W莫雷尔, 玛琳因
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一个抗增殖BMP-2 / PPARgamma apoE轴在人类和小鼠smc及其在肺动脉高压中的作用

Georg汉斯曼et al。 中国投资。 2008年5月。
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文摘

丧失突变在骨形态形成蛋白受体2 (BMP-RII)与肺动脉高血压(PAH);BMP-2 BMP-RII的配体,是负的SMC增长的监管机构。在这里,我们报告PPARgamma之间的相互作用及其转录目标apoE BMP-2下游信号。BMP-2 / BMP-RII信号阻止PDGF-BB-induced扩散人类和鼠肺动脉smc (PASMCs)通过减少核phospho-ERK和诱导的DNA结合PPARgamma Smad1/5/8无关的磷酸化。BMP-2和PPARgamma受体激动剂刺激生产和分泌的apoE smc。使用各种方法,包括短发夹RNAi人力PASMCs PAH patient-derived BMP-RII突变PASMCs, PPARgamma拮抗剂,和PASMCs隔绝PPARgamma apoE-deficient老鼠,我们证明了抗增殖效果BMP-2 BMP-RII, PPARgamma, apoE的依赖。此外,我们创建了小鼠目标删除PPARgamma smc和PAH发展表明,他们自发的房车收缩压升高,房车肥大,增加muscularization远端肺动脉。因此,PPARgamma-mediated事件可以防止PAH, PPARgamma受体激动剂可能扭转PAH患者或无BMP-RII功能障碍。

数据

图1
图1所示。抗增殖效果BMP-2 (一个,C,D,F),PPARγ受体激动剂罗格列酮(Rosi;B)、载脂蛋白e (E)PDGF-BB-induced扩散的人类(一个,B,C,E)和小鼠(D和F)PASMCs。
PASMCs被播种在2.5×104细胞每口井500年24-well板μl生长介质和一夜之间可以遵循。PBS的细胞被洗前的饥饿媒体(0.1%的边后卫)和孵化24小时(小鼠PASMCs)或48小时(HPASMCs)然后用PDGF-BB刺激(20 ng / ml)为72小时。BMP-2 (10 ng / ml),罗格列酮(1μM)和重组人类的载脂蛋白e(1 - 10μM)添加到静止细胞PDGF-BB刺激前30分钟。PPARγ拮抗剂GW9662(千瓦;1μM)添加添加BMP-2前24小时。细胞与PBS终于洗两次,使胰蛋白酶化,并计入血细胞计数器(4项)。细胞数量控制在时间点0 (CON)和72小时没有显著不同。一个:shLacZi HPASMCs转染与短发夹LacZi pLentivirus 6(控制);shBMP-RIIi, HPASMCs转染与短发夹pLentivirus 6 BMP-RIIi(即。,BMP-RII-deficient PASMCs)。D:同窝出生的,同窝出生仔畜控制PASMCs;SMC PPARγ- / -,PASMCs隔绝SM22αCre PPARγ液氧/液氧老鼠。F:C57BL / 6小鼠PASMCs控制;apoE- / -,PASMCs隔绝apoE-deficient老鼠。酒吧代表均值±SEM (n= 3一个,D,F;n= 4B和C;n= 6E;n= 12的控制一个)。*P< 0.05;* *P< 0.01;* * *P< 0.001表示;方差分析与Bonferroni多重比较检验。
图2
图2。PDGF-BB (一个和C)和BMP-2 (B和D)反对在HPASMCs影响蛋白质含量phospho-ERK /总ERK (一个和B在核提取物(上),PPARγDNA结合板C和D),PPARγ蛋白在核和胞质提取物(较低的面板C和D)。
细胞被刺激与PDGF-BB (20 ng / ml)或BMP-2 (10 ng / ml)中描述图1的传奇。在不同的实验中,我们确定溶剂(DMSO,无菌水;1:10,000)结果的影响。介绍了西方免疫印迹和PPARγDNA结合化验方法。PPARγDNA结合分析,酒吧代表一式三份的±SEM中值测量1代表实验2 (C)和3 (D)独立实验相似的结果。蛋白质水平细胞分数、酒吧代表均值±SEM (n= 3 - 4)。*P< 0.05;* *P< 0.01和控制;方差分析与Dunnett因果检验。
图3
图3。BMP-2和罗格列酮抑制PDGF-BB-mediated ERK的磷酸化(一个和C),并伴随BMP-2和PDGF-BB刺激增加PPARγDNA结合(B在HPASMCs)。
细胞与BMP-2 preincubated (10 ng / ml) 30分钟(一个和B)或罗格列酮(1μM) 24小时(C),其次是PDGF-BB (20 ng / ml)刺激10分钟(一个和B)或5-60分钟。(C)西方免疫印迹和PPARγDNA结合化验方法和描述图2。在细胞分数(蛋白质含量一个)或细胞溶解产物(C)、酒吧代表均值±SEM (n= 3)。在C与DMSO溶液相比,所有的样品都是控制。PPARγDNA结合试验(B),一式三份酒吧代表±SEM中值的测量1代表实验3独立实验相似的结果。*P< 0.05;* *P< 0.01和控制;方差分析与Dunnett因果检验。
图4
图4。抗增殖效果BMP-2和PPARγ受体激动剂罗格列酮PDGF-BB-induced人类野生型和突变PASMCs BMP-RII扩散。
控制PASMCs隔绝手术切除标本来源于病人接受全肺切除术治疗或疑似肺叶切除肿瘤。附加外围肺动脉(< 1 - 2毫米外径)获得一个病人接受心肺移植FPAH和已知港BMP-RII突变(W9X)。BMP-RII突变的性质,细胞分离、培养技术,和细胞计数方法,如图1所示。HPASMCs孵化了48小时饥饿媒体(0.1%的边后卫)然后用PDGF-BB刺激(20 ng / ml)为72小时。BMP-2 (10 ng / ml)或罗格列酮(1μM)被添加到静止细胞PDGF-BB刺激前30分钟。酒吧代表均值±SEM (n= 3)。* *P< 0.01;* * *P< 0.001表示;方差分析与Bonferroni多重比较检验。PDGF-BB-stimulated细胞的数量明显高于未经处理的控制细胞(P< 0.001)。
图5
图5。BMP-2 PASMCs PPARγ受体激动剂罗格列酮诱导的载脂蛋白e。
(一个)的载脂蛋白e蛋白表达在细胞溶解产物(左)和载脂蛋白e蛋白分泌在上层清液(右)引起BMP-2 (10 ng / ml, 24小时)和罗格列酮(1μM, 24小时)检测到免疫印迹中描述的方法(对于细胞溶解产物,光密度值修正为平等加载使用α-tubulin)。apoE分泌,3 - 4细胞培养瓶/条件的媒体集中和集中的印迹显示(代表2独立实验相似的结果)。(B)BMP-2-induced (10 ng / ml, 24小时)的apoE upregulation鼠控制PASMCs PASMCs收获从减少一半SM22αCre PPARγ液氧/液氧老鼠。PASMCs分离得到5同窝出生仔畜控制和5SM22αCre PPARγ液氧/液氧小鼠中描述的方法。PASMCs从每个基因型被汇集和亚文化与BMP-2刺激之前。2独立实验的污点代表类似的结果。在细胞溶解产物(apoE蛋白质含量一个)、酒吧代表均值±SEM (n= 3)。*P< 0.05;* *P< 0.01和控制;未配对2-tailedt测试。
图6
图6。老鼠的目标删除PPARγsmc维持BMP-2-induced pSmad1/5/8信号。
(一个和B)与目标基因的老鼠删除PPARγsmc。(一个300 - bp) PCR反应显示获得的基因敲除成绩单和几乎完全丧失的700 - bp在PASMCs野生型成绩单和主动脉SM22αCre PPARγ液氧/液氧老鼠。在肺,其中包含smc也是许多其他细胞类型,记录中发现SM22αCre PPARγ液氧/液氧只老鼠,而野生型记录检测同窝出生仔畜控制老鼠。(B)西部免疫印迹PASMC溶解产物同窝出生仔畜和孤立SM22αCre PPARγ液氧/液氧(SMC PPARγ- / -)小鼠(n= 2)显示没有检测到PPARγ蛋白表达与控制细胞相比。(C)同窝出生仔畜控制和SMC PPARγ- / -PASMCs刺激了BMP-2 (10 ng / ml) 5-60分钟为图1中,传说中描述和phospho-Smad 1/5/8蛋白表达被免疫印迹检测中所描述的方法(光密度值修正为平等在装货使用α-tubulin)。1的2代表实验数据显示了类似的结果。
图7
图7。多环芳烃与目标删除老鼠PPARγsmc。
13——导管插入术15-week-old老鼠进行了房车,紧随其后的是器官收获。(一个)RVSP测量,如描述的方法。(B右心室肥大(RVH),测量的重量比房车的LV +隔(RV / LV + S)中描述的方法。(C)Muscularization肺泡壁动脉(音乐。动脉Alv。墙),描述的方法。(D)代表肺组织的显微照片(彩色Movat pentachrome) 15-week-old小鼠显示一个典型的nonmuscular外围肺泡动脉同窝出生仔畜控制鼠标。(E一个类似的部分SM22αCre PPARγ液氧/液氧(SMC PPARγ- / -)鼠标显示了肺泡壁动脉周围肌肉的边缘。(F- - - - - -我)在串行肺组织免疫组织化学部分同窝出生仔畜控制(CON)和SMC PPARγ- / -老鼠α-SMA染色(F和G)和增殖细胞核抗原(PCNA);H和我)。箭在我表明增强PASMCs PCNA染色。参见表1。酒吧代表均值±SEM (n= 5)。* * *P< 0.001和控制;未配对2-tailedt测试。
图8
图8。模型:一种新型抗增殖BMP-2 / PPARγapoE轴对多环芳烃的保护。
这个模式包含描述的发现我们的文章和文学作为讨论的日期。(一个通过PPARγ和apoE) BMP-2抑制SMC增殖。apoE损害PDGF-BB / MAPK信号通过绑定到低密度脂蛋白受体相关蛋白(单体),从而启动内吞作用和退化的单体/ PDGFR-βPDGF-B复杂。PPARγ引发单体和其他growth-inhibitory / smc proapoptotic基因和抑制细胞循环和其他刺激基因如端粒酶,细胞周期蛋白D1和视网膜母细胞瘤蛋白。此外,PPARγ诱发可以直接灭活phospho-ERK磷酸酶。(B)BMP-RII障碍促进PAH SMC增殖和生存。加强PDGF-BB信号导致PAH的SMC增殖是一个关键的临床特征。缺乏apoE和提高部队的促有丝分裂的PDGF-BB / MAPK信号。丧失BMP-RII基因的突变会减少内源性PPARγ活动,导致无对手的MAPK信号、SMC增殖和生存,最终PAH的发展。TF,转录因子。(C)PPARγ受体激动剂可以拯救BMP-RII障碍和反向多环芳烃。PPARγ受体激动剂如罗格列酮和吡格列酮可能会扭转SMC增殖和血管重建的PAH患者或无BMP-RII障碍通过诱导apoE基因和其他growth-inhibitory / proapoptotic(表示),通过刺激基因的镇压(没有显示)。
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