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。 2008年3月1; 372（1）：127-35。
doi: 10.1016 / j.virol.2007.09.045。 电子版2007年11月26日。

SARS-CoV的复制原代人肺泡II型细胞培养物而不是在I型样细胞

埃里克·Ç莫塞尔1那 皆如王那 斯科特杰弗斯那 凯伦E Edeen那 双林王那 格雷戈里•P•那 C乔尔恐慌那 Rizwan Manzer那 Tanya A Miura.那 伦纳德·d皮尔逊那 Kathryn V Holmes.那 罗伯特·J·梅森
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SARS-CoV的复制原代人肺泡II型细胞培养物而不是在I型样细胞

埃里克·Ç莫塞尔等等。 病毒学。 。
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严重的急性呼吸综合征（SARS）是一种以弥漫性肺泡损伤为特征的疾病。我们分离出人肺泡II型细胞并以高度分化的状态保持它们。II型细胞培养物支持SARS-COV复制，如RT-PCR检测病毒亚基组织RNA的检测和病毒滴度的增加。病毒滴度最大24小时，并在约10（5）pfu / ml约10（5）。培养物中的两种细胞类型被感染。一种细胞类型是II型细胞，其为SP-A，SP-C，细胞角蛋白，II型细胞特异性单克隆抗体和EP-CAM。其他细胞类型由轴形细胞组成，该细胞对于波形蛋白和胶原III阳性和可能的​​成纤维细胞。在I类细胞或巨噬细胞中未检测到病毒复制。因此，分化的成年人肺泡II型细胞可感染，但肺泡型I形细胞和肺泡巨噬细胞不支持生产性感染。

数据

图。1
图。1
II型细胞培养表达ACE2和表面活性剂蛋白。如在方法部分中所述进行培养II型肺泡细胞或Vero细胞，以及用于免疫印迹，制备提取物。II型细胞与基质胶 - 鼠尾胶原凝胶特定的添加剂中培养6天，I型样细胞在鼠尾胶原包被的孔进行培养。泳道1含有新鲜分离的II型细胞的提取物;泳道2是空白车道;泳道3含有用1％CS-FBS单独细胞的提取物;泳道4 1％CS-FBS + KAID;泳道5个5％FBS;泳道6 5％FBS + KAID;泳道与在胶原包被的孔中（I型表型）电池7个5％FBS; Lane 8 blank lane; and Lane 9 Vero cells. These results are representative of four separate experiments.
图2
图2
病毒在原代人肺泡II型细胞和i型细胞培养中的复制培养7-8天后，在MOI = 2-3时感染细胞单层。在每个时间点，取掉等量的上清液并冷冻以进行空斑实验。II型细胞的结果在A图中显示，i型细胞在b图中显示。每条曲线代表病毒在来自不同供体肺的细胞中生长，并在三个井中测量。实线水平线表示检测限。
图3.
图3.
在感染的Vero E6 SARS冠状病毒基因组和亚基因组RNA，II型和I型样细胞培养。细胞单层在MOI感染= 2-3。总RNA从单层提取24 HPI（的Vero E6）或72 HPI（II型和I型样细胞）。SARS-CoV的基因组和亚基因组RNA和细胞GAPDH RNA如所述同时通过多重RT-PCR扩增。
图4.
图4.
SARS-CoV感染原代人肺泡II型细胞培养物。II型细胞培养物用对SARS-COV核衣壳（SARS-N）蛋白（绿色）的抗体和细胞标记物（红色）染色。每个标记显示在三个框架：标记/ dapi，sars-n / dapi和标记/ sars-n / dapi。小型立方体细胞对于SP-A（A-C），细胞角蛋白（D-F），EP-CAM（G-1）和II型细胞单克隆抗体（J-L）是阳性的。SARS-N阳性的细胞对于SARS-COV受体ACE2（M-O）也是阳性的。较大的主轴形细胞是阳性（P-R）的波动率。
图5.
图5.
表达SARS-N蛋白的多核细胞。II型细胞培养检测SARS-CoV核衣壳蛋白(绿色)的表达。细胞核用DAPI染色。(A)立方体形态的三核细胞，可能是II型细胞起源。(B)双核梭形细胞。滤镜上的细胞进行SP-A染色。细胞形态和SP-A染色的缺失提示该细胞来源于培养的成纤维细胞。
图6.
图6.
成纤维细胞sars冠状病毒感染。评估五种不同的肺成纤维细胞分离物，只有一个是阳性的。这张照片代表了正面实验。小组A是Vimentin染色;面板B是SARS-N蛋白;和面板c是复合材料。
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