甲磺酸伊马替尼抑制profibrogenic鉴定及活性,防止bleomycin-mediated肺纤维化
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- PMID:15520863
- PMCID:PMC524221
- DOI:10.1172 / JCI19603
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甲磺酸伊马替尼抑制profibrogenic鉴定及活性,防止bleomycin-mediated肺纤维化
中国投资。
2004年11月。
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文摘
特发性肺纤维化是一个渐进的和致命的肺纤维化疾病不清楚病因。之前工作的重点治疗特发性肺纤维化,抗炎治疗没有被证明是有效的。最近的见解表明成纤维细胞特异表达的发病机理是通过介导的焦点由profibrotic细胞因子信号驱动的。及和PDGF 2最有力的这些细胞因子。在目前的研究中,我们调查的角色TGF-beta-induced纤维化激活介导的阿贝尔森(Abl)酪氨酸激酶。我们的数据表明,成纤维细胞反应及通过刺激c-Abl独立于Smad2/3磷酸化激酶活性和PDGFR激活。此外,抑制阻止由伊马替尼c-Abl TGF-beta-induced ECM基因表达,形态转换和细胞增殖Smad信号独立于任何影响。进一步,利用bleomycin-induced肺纤维化小鼠模型,我们发现了一个显著的抑制肺纤维化的伊马替尼。因此,Abl家庭成员代表共同目标profibrotic细胞因子信号的调制。
数据
TGF-β2刺激c-Abl激酶活性。(一个)NIH-3T3成纤维细胞生长汇合,放置在0.1%的边后卫DMEM一夜之间,并与10 ng / ml TGF-β2刺激或25 ng / ml PDGF-AB表示。平行板都经过20分钟10μg /毫升伊马替尼之前生长因子。后c-Abl免疫沉淀反应,体外激酶活性决定中描述的方法。AKR-2B成纤维细胞和TGF-β1类似结果(数据没有显示)。下半部分:免疫沉淀反应和激酶试验之前,100μg的蛋白质用于c-Abl西方分析。(B)NIH-3T3细胞,Abl- / -参数- / -mef或Abl- / -参数- / -成纤维细胞稳定表达(+)WT-c-Abl或占主导地位的消极c-Abl镀(DN-c-Abl)是2.0十6细胞每100毫米板的边后卫DMEM一夜之间成长20%。媒介的边后卫DMEM 24小时改为0.5%,和文化不及时治疗(-)或(+)刺激10 ng / ml TGF-β2 30分钟。平行板都经过20分钟10μg /毫升伊马替尼之前生长因子。c-Abl激酶活性(上)和西方分析(底部)测定一个。
TGF-β2激活c-Abl PDGFR信号无关。(一个表示时报)NIH-3T3细胞治疗与TGF-β2 (10 ng / ml)或PDGF-AB (25 ng / ml)。细胞溶解产物和加工准备c-Abl激酶活性(第一面板),总c-Abl蛋白质(第二小组),酪氨酸磷酸化PDGF-β受体(p-PDGFR;第三小组),或总PDGF-β受体(第四小组)中描述的方法。(B)NIH-3T3细胞治疗如图1中所描述的。PDGF-α和-βreceptor-null F细胞被播种在1.5×106细胞每100毫米。后一夜之间成长,中独自替换为无血清DMEM (PDGFR- / -100年)或腺病毒(MOI)表达了I型和II型TGF-β受体(广告。TGF-βRI和广告。分别为TGF-βRII)为24小时。文化不及时治疗(-)或(+)刺激10 ng / ml TGF-β2 30分钟和加工c-Abl激酶活动(第一面板),或全部c-Abl(第二小组),PDGF-β受体(第三小组)、I型TGF-β受体(TGF-βRI;第四小组),或II型TGF-β受体(TGF-βRII;第五小组)的蛋白质。
TGF-β2激活c-Abl信号和TGF-β2激活Smad信号是独立的。(一个)左:Smad3 KO mef (Smad3- / -)转染与Flag-tagged c-Abl (c-Abl-Flag)和负Smad2 (myc-Smad2占统治地位D450E)中所描述的方法。NIH-3T3细胞治疗如图1中所描述的。后30分钟的刺激没有(-)或(+)存在10 ng / ml TGF-β2,转染的激酶活性(c-Abl-Flag活动)或内源性(c-Abl活动)c-Abl蛋白质决定使用anti-Flag或K12的血清分别。相应的总蛋白质是显示在第二和第四板。右:NIH-3T3或Smad2/3 KO细胞处理(+)或没有(-)TGF-β作为左边面板的描述。30分钟的刺激后,溶解产物含有蛋白质被Western-blotted表示蛋白质。(B)左:NIH-3T3细胞治疗(+)或没有(-)TGF-β2和/或伊马替尼如图1中所描述的。30分钟的刺激后,溶解产物含有等效蛋白质被Western-blotted phospho-Smad2 (p-Smad2) phospho-Smad3 (p-Smad3),或相应的总蛋白。正确的:Abl- / -参数- / -mef或Abl- / -参数- / -成纤维细胞稳定表达(+)WT-c-Abl或占主导地位的消极c-Abl服用(+)或没有(-)TGF-β2 30分钟和处理显示Smad蛋白质作为左边面板的描述。
需要c-Abl TGF-β-induced形态学改变和细胞增殖。(一个)AKR-2B细胞,Abl- / -参数- / -mef或Abl- / -参数- / -成纤维细胞稳定表达(+)WT-c-Abl或占主导地位的消极c-Abl (DN-c-Abl)发展到融合中描述的方法。文化与DMEM刺激单独或补充(+)与5μg /毫升伊马替尼和/或10 ng / ml TGF-β2。48小时孵化后,代表地区拍摄20岁阶段。(B)一式三份的盘子一个使胰蛋白酶化,细胞和血细胞计数器计数。
TGF-β刺激c-Abl-dependent信号。(一个)IMR90细胞治疗与单独DMEM(-)或含有10 ng / ml TGF-β2 (+)。30分钟的刺激后,c-Abl激酶活动或Smad2 (p-Smad2)和Smad3 (p-Smad3)磷酸化决心。总c-Abl Smad2, Smad3蛋白质如下所示相应的活动。(B)最高的屁股:IMR90细胞,Abl- / -参数- / -mef,Abl- / -参数- / -成纤维细胞稳定表达(+)WT-c-Abl或占主导地位的消极c-Abl,或PDGF-α-βreceptor-null F细胞(PDGFR- / -)不及时治疗(-)或(+)24小时使用TGF-β2 (10 ng / ml)和/或伊马替尼(10μg /毫升)。伊马替尼是前20分钟TGF-β2,纤连蛋白mRNA积累。底墨迹:溴化乙锭染色28 s和18 s核糖体RNA分析北部之前子单元。左上角图:褶皱纤连蛋白信使rna刺激由TGF-β2表示为不同的细胞类型。结果代表均值±SE 2单独的实验。左下图:细胞系如上所述被转染与纤连蛋白荧光素酶结构。10 ng / ml的褶皱感应TGF-β2有或没有5μg /毫升伊马替尼决心所描述的方法和Penheiter et al . (51)。正确的图:胶原蛋白I(上)和胶原蛋白III(底部)荧光素酶活性测定作为左下图的描述。所有的荧光素酶化验的结果代表均值±SE 2单独的实验,每一式三份完成。
伊马替尼羟脯氨酸含量减少和防止BLM-treated肺组织病理变化。(一个BLM) 28天后气管内的滴剂或生理盐水,老鼠牺牲(控制,n= 12;BLM,n= 15;BLM +伊马替尼,n= 14;伊马替尼,n= 8)。每只动物的左肺是用于羟脯氨酸测定方法和所述之前(52)。*P< 0.05 vs BLM小鼠接受伊马替尼。没有显著差异(P> 0.05)在控制中,BLM +伊马替尼,伊马替尼组。(B老鼠被视为一个。正确的肺被切割和沾)或马森的三色的可视化胶原蛋白。代表图像显示×10的阶段。(C)形态学评分(44)被分配在盲评H&E-stained样本。0表示没有纤维化,1表示偶尔小胸膜下疫源地,2表示牙槽间的小叶间隔增厚和胸膜下疫源地,3表示连续牙槽间的和胸膜下间质纤维化。没有控制之间的显著差异,BLM +伊马替尼,伊马替尼组。(D)老鼠被视为描述一个。之前立即移植气管插管和灌洗共有10毫升0.9生理盐水。收集到的液体离心,细胞差确定。灰色酒吧显示巨噬细胞百分比,而红色和绿色反映多形核细胞和淋巴细胞,分别。之间的测量误差表明SE样品在同一组。
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