纤维细胞在肺纤维化:改变表型检测到流式细胞术
查尔斯•里斯1,
理查德。m .银
埃琳娜Tourkina
斯坦利·霍夫曼- 1风湿病学与免疫学、医学、南卡罗来纳医科大学的查尔斯顿,美国SC
- 2再生医学和细胞生物学,南卡罗来纳医科大学的查尔斯顿,美国SC
纤维细胞是骨髓hematopoietic-derived细胞也表达间充质细胞标记(通常胶原蛋白I)和参与多个器官的纤维化疾病。考虑到他们的起源,他们或其前驱物必须循环细胞在招聘之前的目标组织。虽然大多数以前的研究集中在循环纤维细胞,在这里,我们专注于纤维组织的纤维细胞表型。研究人类疾病的相关性是加剧了博来霉素使用模型交付系统,概括人类硬皮病的几个特性包括多器官纤维化不观察到当博来霉素直接进入肺部。使用流式细胞仪,我们发现在CD45的肺纤维化的人口多高纤维细胞(称为地区我)很少发现vehicle-treated控制老鼠。第二人口CD45 +纤维细胞(称为地区II)在控制和肺纤维化。CD45的水平循环纤维细胞要么地区远远低于I或II肺纤维细胞。趋化因子受体CXCR4与CCR5表达水平较高地区我比地区二世和出现在非常低的水平在所有其他肺细胞包括CD45 + /胶原蛋白I -白细胞。胶原蛋白伴侣HSP47出席类似这两个地区的高水平I和II,但在更高的级别上比控制肺纤维化肺。还有一个主要HSP47人口高/ CD45 -细胞肺纤维化肺不存在控制。CD44存在上级区域我比地区二世和以低得多的水平在所有其他细胞包括CD45 + /胶原蛋白I -白细胞。当肺纤维化被恢复使用caveolin-1 caveolin-1活动脚手架域肽(CSD),很强的相关性之间观察到的纤维细胞数量和纤维化评分。总之,独特的纤维化肺纤维细胞的表型表明纤维细胞分化主要发生在靶器官。
介绍
纤维细胞被定义为骨髓hematopoietic-derived细胞似乎过渡等,他们表达白细胞标记CD45 +间充质细胞标记,如胶原蛋白I (基利et al ., 2009;抗起球et al ., 2009;赫尔佐格和布克拉,2010年)。纤维细胞出现在靶组织高水平(s)在多种纤维化疾病包括硬皮病(系统性硬化症,SSc) (菲利普斯et al ., 2004;福克2006;Haudek et al ., 2006;Kisseleva et al ., 2006;王et al ., 2008;Mehrad et al ., 2009;Niedermeier et al ., 2009;Vakil et al ., 2009;马塔伊et al ., 2010;穆雷et al ., 2011;Nikam et al ., 2011)。鉴于骨髓来源,很明显,纤维细胞必须通过循环流量是招募目标组织通过在纤维细胞细胞表面趋化因子受体的作用。一旦纤维细胞进入靶组织,他们参与肝纤维化的进展通过区分为成纤维细胞和/或通过分泌细胞因子激活成纤维细胞。
大多数以前的研究纤维细胞执行使用人类血液,因为获得缓解的患者这种材料从对照组和各种不同的疾病。例如,一个高水平的循环纤维细胞是患者预后不良的指标特发性肺纤维化(IPF) (Moeller et al ., 2009)。很少有研究已经进行量化和纤维细胞表型的目标组织如肺。尽管在文献中关注循环纤维细胞,似乎有更多的纤维细胞在肺纤维化的循环(菲利普斯et al ., 2004;石田et al ., 2007)。此外,小的工作已经完成了肺纤维细胞的表型特征超出了他们的CD45的表达,胶原蛋白I,趋化因子受体CXCR4。这是特别值得注意的,因为虽然它似乎已经指出,有太少的循环纤维细胞占大量的纤维细胞在肺纤维化(菲利普斯et al ., 2004),可能还没有检查,这可能发生,因为纤维细胞分化主要发生在肺部(或其他纤维靶器官)。
两个最近的技术进步在允许我们执行研究量化和肺纤维细胞的表型出现。最常见的方法诱导小鼠肺纤维化是交付博来霉素直接进入肺部,通常通过气管内的管理。然而,我们最近发现系统性管理博来霉素使用渗透微型真空泵产生疾病,更像人类SSc比博来霉素进入肺部的直接管理(李et al ., 2014)。泵功能常见模型和SSc,但不是直接的模型,包括:(1)纤维化肺胸膜下的部分是有限的;(2)炎症是相对有限;(3)肥厚性II型肺泡上皮细胞存在高水平;(4)肺纤维化是伴随着皮肤纤维化和其他内部器官的纤维化。我们已经解决的第二个问题是,之前的纤维细胞的研究表明,很难确定明确的流式细胞术CD45 +细胞胶原蛋白I +。这种区别是困难的,因为在现实中,胶原蛋白我表达水平不分类(即。正面或负面的),而是一个连续的胶原蛋白表达水平存在。此外,因为大多数anti-collagen我兔多克隆抗体抗体用于流式细胞术,同形像控制是无免疫力兔免疫球蛋白可不同程度的非特异性标记,可能由于内在异质性的准备。我们已经解决了这个问题通过对人类胶原蛋白多肽的多克隆抗体Iα1 c端前肽。使用这种抗体,我们可以确保我们标记细胞表达胶原Iα1而不是细胞,结合成熟的胶原蛋白(缺乏这个前肽),我们可以区分特定的抗体绑定和使用免疫原性非特异性结合肽竞争实验。
在最近的研究中,通过流式细胞仪比较小鼠肺纤维细胞的数量和表型的博来霉素或生理盐水处理车辆利用我们的泵模型允许我们做出了惊人,小说关于CD45的水平,观察胶原蛋白I, CD14, CD34,趋化因子受体CXCR4, CCR5, HSP47, CD44在肺纤维细胞和证明高纤维细胞数量之间的相关性和纤维化肺组织纤维化程度。这些观察结果表明,纤维细胞分化主要发生在肺纤维细胞,治疗目标招聘和分化(特别是caveolin-1脚手架管理域肽(CSD)]可能是有效的治疗肺纤维化疾病和其他器官。
材料和方法
博来霉素治疗的老鼠和收获的组织
以下程序批准的音乐机构动物保健和使用委员会。十周大,男性CD1小鼠(查尔斯河实验室,波士顿,MA)是在无菌条件下维护。渗透微型真空泵(ALZET 1007 d;DURECT公司库比蒂诺,CA)包含100μl盐水车或博来霉素(100 U /公斤)旨在提供其内容为0.5μl / h为7天isofluorane麻醉下松散皮肤下植入老鼠的背面略尾肩胛骨。泵被移除在10 - 12天。
在图所示的实验10同时,泵包含博来霉素或生理盐水被移除,第二个泵(ALZET 2002年,旨在提供其内容0.5 200μlμl / h为14天)插入包含CSD肽(5毫克/毫升10% DMSO在水)或车辆。
老鼠的牺牲表示。深麻醉下,胸腔开放让肺部。小鼠灌注系统通过左心室与PBS。左肺捆住,删除流式细胞仪实验。剩下的对肺灌注进一步与缓冲福尔马林固定的锌(Z-Fix Anatech,巴特尔克里克,MI)。固定的肺组织和嵌入在石蜡。部分(4μm)与苏木精和伊红染色())或马森的三色的。
流式细胞术
肺组织准备如上所述在冷洗DMEM并使用好手术剪碎成小块。每个老鼠的组织在5毫升resuspended胶原酶(1毫克/毫升,罗氏# 10103578001)和低速震动了45分钟37°C。消化是停在10毫升的DMEM / 10%的边后卫。样品经过40μm细胞过滤器准备单分散的细胞悬液。由离心收集细胞(1200转10分钟4°C,贝克曼GS-6R离心机)和细胞颗粒resuspended 1毫升ACK赖氨酸缓冲区(LONZA # 10 - 548 e) 5分钟去除红细胞。肺细胞,大约一千万/鼠标,然后通过离心收集,清洗与PBS、收集、固定和permeabilized 20分钟在4°C 1毫升Cytofix / Cytoperm (BD # 554722)。最后,细胞被洗的流式细胞仪缓冲区(BD烫/洗缓冲区554723)和resuspended 4×106在流式细胞仪的缓冲/ Fc块每毫升(BD 1μg每1×106细胞)。
抗体用于immunolabeling总结在表1。所有与抗体孵化项目30分钟在4°C低速摇臂,洗都是用流式细胞仪缓冲区,再悬浮都与流式细胞仪缓冲/ Fc块。之前使用,指定的抗体Pro或Telo preincubated与特定或非特异性肽(30分钟,RT,每毫升10μg免疫球蛋白在流式细胞仪缓冲+ 20μg每毫升肽)。(肽已经减少和烷基化如下所述)。抗体/肽混合物(50μl)与0.25毫升肺细胞培养。洗后,这些细胞被第二个孵化anti-rabbit二级抗体。洗后,细胞同时第三孵化directly-labeled anti-CD45和directly-labeled抗体CD14、CD34,罗克兰anti-collagen我,趋化因子受体CXCR4, CCR5, HSP47或CD44。分析了洗涤后,immunolabeled细胞悬液流式细胞仪使用MoFlo Astrios(贝克曼库尔特)。至少每样20000事件记录。
表1
表1。抗体用于流式细胞仪实验。
在实验中涉及immunolabeling CD45、职业和MAB1912或MAB1913,因为MAB1912 MAB1913没有直接可用的标记,不能直接标记在我们的实验室,同时有必要先用Pro和MAB1912或MAB1913标签,然后用适当的二次抗体同时第二标签。如上所述,在第三个孵化细胞收到directly-labeled anti-CD45。
在循环纤维细胞实验,收集的血液(通常约1毫升)是心脏插入管已经含有肝素(500 USP单位)作为抗凝血剂。PBMC被孤立的常规方法和immunolabeled如上所述。
胶原蛋白肽抗体
19-amino酸肽从人类胶原蛋白Iα1 c端前肽和c端端肽合成n端与一个额外的半胱氨酸残基。这残留是用来连接肽KLH免疫兔子,Sulfolink珠子(热费希尔科学Inc .,罗克福德,IL)。总从兔血清免疫球蛋白是纯化。特定的免疫球蛋白g然后使用免疫原性肽亲和纯化总免疫球蛋白Sulfolink珠子。洗脱后,affinity-purified免疫球蛋白spin-concentrated和脱盐PBS。
减少/烷基化的多肽
10毫克的免疫原性肽Pro和Telo溶解在1毫升TE(50毫米三,pH值8.5/5毫米EDTA)。接下来,50μl 1 M德勤在TE添加和孵化30分钟,37°C。解决方案的澄清后,肽被添加烷基化225μl 0.67 iodoacetimide TE和孵化为30分钟,37°C。最后,肽是由凝胶过滤脱盐在PBS 10毫升交联葡聚糖G-15列。分数是汇集和峰值与同等体积的100%甘油混合存储解决方案在−20°C。
纤维化评分
纤维化是由轻量化微观评价的组织部分。短暂,对于每个鼠标马森的Trichrome-stained幻灯片和一个H & E-stained得分盲目使用任意规模的正常形态= 0;几乎正常= 1;稍微改变形态= 2;适度改变形态= 3;,严重改变形态= 4。炫目的代码被打破后,最后得分为每个鼠标决心通过添加其马森的三色的分数H & E得分。
EGFP的老鼠
10 - 14周男性C57BL6 / Ly5.1老鼠准备骨髓移植使用单一全身辐照的剂量(9.0 Gy)。10到12个女EGFP / Ly5.2老鼠作为捐助者(维斯孔蒂et al ., 2006)。简单地说,供体老鼠被公司人道地牺牲了2吸入。骨髓细胞从股骨和胫骨,洗在Ca+ +- - - Mg+ +包含0.1% BSA无磷酸盐。单分散的悬架是由温柔的粉状通过40-μm过滤器和过滤。单核细胞是由密度梯度离心法分离使用Lympholyte-M (Cedarlane实验室,伯林盖姆,NC)。2.0×105这些EGFP +捐献骨髓细胞移植到辐照接受者通过尾静脉注射。如前所述(维斯孔蒂et al ., 2006),外周血嵌合在30天post-transplantation化验,multi-lineage造血重建化验在60天。老鼠表现出高水平的调整被用于后续的研究。
统计分析
所有数值数据表示为平均值±标准平均误差(s.e.m)并使用学生的进行了分析t以及评估统计学意义。在所有数据,统计学意义表示为*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.002。
结果
CD45的识别高肺/ Pro +细胞发现,只有在博来霉素
兔多克隆抗体人类胶原蛋白Iα1 c端前肽和c端端肽准备中描述的方法。我们把前肽抗体Telo Pro和端肽抗体。在本文中,我们只显示流式细胞仪获得的数据与Pro,虽然与Telo也获得了类似的数据。描述职业,我们首先证明了西方墨点法,它的活动可以几乎完全阻止了由其特定的免疫原性肽剂量依赖性的方式,但不是由非特异性免疫原性肽Telo(图1)。
图1
图1所示。描述职业的免疫印迹和流式细胞术中使用。(一)人肺成纤维细胞文化上层清液是西方涂抹使用Pro(0.2μg /毫升)与非特异性肽(免疫原性肽Telo, 0.4μg /毫升= 142倍摩尔过剩),与特定的肽(免疫原性肽Pro, 0.4μg /毫升= 142倍摩尔过剩),或连续5倍稀释的特定的肽。著名的多肽检测全身180 kD胶原Iα1。小,略小的多肽缺乏氨基前肽。(B)总肺细胞从bleomycin-treated鼠标牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45,表示,没有额外的抗体,与职业竞争与特定的肽(142倍摩尔过剩),并与专业与非特异性肽(142倍摩尔过剩)。散点图与CD45荧光强度提出了轴和职业(或标记)荧光强度x设在。(C)总肺细胞从saline-treated鼠标和bleomycin-treated鼠标牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45和职业。散点图与CD45荧光强度提出了轴和Pro荧光强度轴。区命名区域I-IV显示和使用。(D)CD45 I-IV地区或专业水平,我+二所示的平均值±s.e.m.每18平均荧光强度的生理盐水和26博来霉素小鼠牺牲后28天开始治疗。年代,盐水;B,博来霉素。误差和没有显示t以及并不适用于这些数据,因为CD45和Pro荧光强度的标准用于定义I-IV区域。
进一步描述Pro和Telo,这些抗体检测胶原蛋白的能力我在西方滴老鼠组织提取决心。皮肤是用于这些实验,因为它包含了一个更高级别的我比肺胶原蛋白。皮肤均质顺序与中性缓冲(提取可溶性胶原蛋白我尚未纳入细胞外基质)之后,sds - page样品缓冲提取颗粒(提取胶原蛋白我已经开始被交联到细胞外基质,但并不是完全不溶性)。像预期的那样(图2),专业检测到完整的180 kD胶原I和略小的电脑(原骨胶原我缺乏氨基前肽)的可溶性部分但我并不认识任何形式的胶原蛋白存在于颗粒分数因为前肽从胶原蛋白我之前它的并入细胞外基质。鲜明的对比(图2),正如所料,Telo公认的主要成熟(即140 kD。,lacking propeptides) collagen I monomers and some dimers in the soluble fraction but recognized a higher level of collagen I in the pellet fraction, most of which was covalently crosslinked into dimers, trimers, and tetramers. While 180 kD procollagen I and pC are not shown to be detected by Telo in Figure2在长时间曝光,他们观察到的相同的蛋白质印迹。总之,图2表明胶原我几乎完全在胶原蛋白的可溶性部分,绝大多数我在组织成熟的分子或多聚体的成熟的分子和存在于颗粒分数。图2进一步表明,职业和Telo预期,似乎明显的特异性,不承认任何蛋白质以外的其他形式的胶原蛋白。
图2
图2。特异性免疫印迹的正面和Telo组织提取物。溶组织提取剃老鼠的皮肤准备使用不用洗涤剂的肺组织中性缓冲(如前所述)(李et al ., 2014)。离心后,小球被沸腾3分钟在sds - page示例re-extracted缓冲区。整除的可溶性提取(Sol)和颗粒提取(Plt)代表等量的组织被解决通过sds - page和西方涂抹使用Pro和Telo表示。各种形式的胶原蛋白的身份我被这些抗体在文本描述和表示图。
我们接下来进行竞争实验通过流式细胞术。总肺细胞从老鼠接受博来霉素使用泵模型(李et al ., 2014在28天)和牺牲double-labeled CD45和职业与职业或竞争Telo免疫原性肽(图1 b)。特定的竞争没有CD45 +细胞荧光强度> 9×102尽管与非特异性竞争有一个庞大的人口CD45 + / Pro +细胞使用这个截止。实验细胞immunolabeled只为CD45确认9×102是一个合适的截止特定的标签。建立专业标准+标签,我们比较总泵模型小鼠的肺细胞治疗与博来霉素或盐水车(图1 c)。检查的数据从18 saline-treated和26 bleomycin-treated老鼠已经允许我们CD45 / Pro散点图划分为四个区域:区域我,CD45高/ Pro + (CD45高=荧光强度> 8×103);地区二、CD45 + / Pro + (CD45 + =荧光强度> 5×102);地区三世,CD45 + / Pro -;和地区四世CD45 -。引人注目的是,大量的细胞存在于地区我只在老鼠身上博来霉素治疗。地区平均荧光强度CD45和Pro I-IV从盐水和博来霉素小鼠(图1 d)是符合这些区域的位置在散点图,如图1 c。
当时间的积累细胞I和II地区(图检查3),在地区我老鼠细胞的数量接收盐水车总是低bleomycin-treated老鼠数量急剧上升28天3天。有趣的是,尽管地区II天真的老鼠细胞的比例不超过4%(未显示),这个数字增加到超过10%生理盐水和bleomycin-treated老鼠泵植入后3天几乎回到基线水平在10天前,表明3天的增加是由于泵泵的植入,而不是内容。盐水的老鼠在28天,水平保持在10天的水平,而在博来霉素小鼠略有增加,在统计学上显著不同的盐水老鼠。总之,这些研究表明,总有人口CD45 +专业+(区域2)细胞在小鼠肺,但有一个相当大的CD45人口高/ Pro +(地区)细胞只出现在bleomycin-treated老鼠和花时间去积累。
图3
图3。时间的细胞数量的地区I和II。肺细胞在地区总量的百分比(一)或二世(B)在盐水或bleomycin-treated老鼠3 10或启动后28天的治疗。萨尔,盐水;Bleo,博来霉素。这些数据代表平均值±s.e.m.以下数量的老鼠在每个类别:为期3天的盐水,3;三天博来霉素3;为期10天的盐水,3;十天博来霉素,3;28天盐水,18;28天博来霉素,26岁。因为没有区别的百分比在盐水和博来霉素肺细胞区域二第三天第十天,生理盐水和博来霉素数据池之前确定统计学意义在细胞的百分比减少地区之间的二天3和10。 **p< 0.01,* * *p< 0.002。
确认身份的地区和地区二细胞骨骨髓来源的细胞,进行了类似的实验小鼠的重组与骨髓表达EGFP(没有显示)。在盐水bleomycin-treated老鼠,符合他们的表达造血细胞CD45标记,细胞》EGFP + 100%的地区,而细胞EGFP +第四地区只有10%。
CD14和CD34
不同作者认为CD14和CD34表达的状态是重要的循环纤维细胞的特征。总肺细胞,因此,我们做了个实验,从盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲后28天治疗immunolabeled CD45, Pro, CD14或CD34(图4)。与CD45的双峰immunolabeling分布是明显的生理盐水和博来霉素肺(图1 c),CD14和CD34显示双峰分布(图4)。CD14和CD34细胞地区I-IV盐水,bleomycin-treated老鼠也相比(图4 b)。数据汇集了地区I和II,因为这些区域之间没有区别。CD14,基本上没有细胞区域III是积极的,而相似比例的细胞生理盐水和bleomycin-treated老鼠积极地区I + 2 (17.5%)。再次CD34,基本上没有细胞区域III是积极的。CD14相比,CD34 +细胞的比例比生理盐水在博来霉素肺肺I +地区II (40% vs 69)。
图4
图4。CD14和CD34 I-IV地区。(一)总肺细胞从bleomycin-treated鼠标牺牲治疗开始后的28天immunolabeled Pro和CD14或CD34。散点图的荧光强度提出了CD14和CD34在轴和Pro轴。注意,与CD45(见图1),CD14和CD34清理出双峰分布的荧光强度。(B)总肺细胞从盐水,bleomycin-treated鼠标牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45, Pro, CD14或CD34。细胞从指定的区域(CD34下指示适用于CD14)从CD45-Pro散点图是选择和CD14、CD34在这些细胞的荧光强度绘制与细胞计数。1×10的酒吧2标志着荧光强度的最大值(99)检测到标记细胞。每个地区的不同细胞计数天平。也观察到类似的结果三个独立的实验。
我比较专业与其他胶原蛋白抗体
来验证我们的职业抗体和比较细胞被各种胶原蛋白抗体,我们进行实验从bleomycin-treated老鼠牺牲总肺细胞在治疗后28天immunolabeled CD45, Pro, EMD的微孔MAB1913(鼠标单克隆反胶原Iα1 c端前肽),EMD微孔MAB1912(鼠单克隆反胶原Iα1 n端前肽),或大兔多克隆反人类和牛胶原蛋白我(这是最常用的抗体通过流式细胞仪检测纤维细胞,特别是在实验中使用鼠标样品)。表示细胞散点图地区I和II的CD45和Pro是绿色,然后这些细胞局部CD45和MAB1913散点图,MAB1912,罗克兰(图5)。在所有情况下,绿色标记细胞表现出类似的人口分布散点图表明这CD45 +细胞也被这些四anti-collagen抗体。相比之下,这四种抗体CD45 -细胞识别能力的差异。最专业+ CD45 -细胞荧光强度相似的绿色标记细胞,最MAB1913 + CD45 -细胞已经不如绿色荧光标记细胞,最罗克兰+ CD45 -细胞比绿色荧光标记细胞,和最MAB1912 + CD45 -细胞已经远比绿色荧光标记细胞(图5)。这些差异是否由于公认的抗原表位的差异表达或被不同由于独特的亚细胞定位模式,屏蔽,或者出现在不同分子形式的胶原蛋白我(例如,碎片或纤维)是一个开放的问题。同样值得注意的是:我们取得积极成果使用MAB1912和MAB1913鼠标样品通过流式细胞术和免疫组织化学(投稿),因为这些抗体以前以为不识别鼠标胶原蛋白。
图5
图5。比较专业的其他胶原蛋白抗体。总肺细胞从bleomycin-treated鼠标牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45, Pro, MAB1913之一,MAB1912或大利好。左上角的面板,散点图显示与CD45轴,Pro-on x轴,和一盒包含地区I和II与盒内的细胞选择和标记为绿色。在其他三个面板,散点图显示与CD45轴,显示,MAB1913, MAB1912或大轴。相同的细胞标记绿色的由于他们的立场在CD45-Pro散点图里,对这些情节是绿色的。注意绿色的细胞在相同的位置在所有面板显示相同的细胞被Pro, MAB1913 MAB1912,罗克兰。与相似度在所有四个面板CD45 +细胞,注意,正如在文本中所描述的,差异是在CD45 -细胞的位置。也观察到类似的结果三个独立的实验。
趋化因子受体CXCR4与CCR5
为了使纤维细胞在肝纤维化中发挥作用,有必要对他们或他们的祖细胞被招募到目标组织。在这个过程中趋化因子分泌细胞在目标组织促进招聘到组织通过绑定到特定的受体细胞循环。的两个最突出的这些趋化因子受体CXCR4与CCR5。在这些实验中,肺总细胞生理盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲后28天治疗immunolabeled CD45,亲,趋化因子受体CXCR4或CCR5。趋化因子受体CXCR4与CCR5、荧光强度高水平地区I和II,最多当地区III和IV标记或者几乎没有积极的(图6)。例如,趋化因子受体CXCR4与CCR5,博来霉素地区的平均荧光强度在博来霉素> 10倍高于地区III或IV。对趋化因子受体CXCR4与CCR5,之间的荧光强度有显著差异博来霉素区域我和博来霉素区域二世。虽然趋化因子受体CXCR4的荧光强度水平明显高于我,我+博来霉素地区II相比分别盐碱地区我我+二世,这不是CCR5。也很值得注意的最高水平的细胞的趋化因子受体CXCR4是不一样的细胞CCR5(图的最高水平6 b)。绿色标记细胞趋化因子受体CXCR4的最高水平倾向于CD45和专业的最高水平,而绿色标记细胞与CCR5的最高水平倾向于任意边界地区I和II和III和地区在许多情况下略有越过边境。
图6
图6。趋化因子趋化因子受体CXCR4与CCR5 I-IV地区。(一)肺总细胞生理盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45, Pro,趋化因子受体CXCR4或CCR5。趋化因子受体CXCR4 I-IV地区或CCR5的水平,我+二所示的平均值±s.e.m.的平均荧光强度以下的老鼠数量:趋化因子受体CXCR4, 15盐水和18博来霉素;CCR5 9盐水和12博来霉素。年代,盐水;B,博来霉素。(B)肺细胞总数的2%的最高水平的趋化因子受体CXCR4和CCR5选择标记为绿色。散点图CD45的轴与Pro在x轴上显示这些选择,绿色标记细胞。作为文本,指出的位置green-marked细胞趋化因子受体CXCR4与CCR5是不同的。也观察到类似的结果三个独立的实验。*p< 0.05,* * *p< 0.002。
胶原蛋白伴侣HSP47
HSP47调节在一个高的比例的细胞纤维化的老鼠和人类肺组织(李et al ., 2014),因此作为细胞相关,代理胶原表达的标志。在这些实验中,肺总细胞生理盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲后28天治疗immunolabeled CD45, Pro, HSP47(图7)。趋化因子受体CXCR4与CCR5,只有第三地区很少,如果有的话,HSP47 immunolabeling。地区I, II,第四我+二世,所有显示更高级别的immunolabeling bleomycin-treated老鼠比saline-treated老鼠(图7一个)。特别是,博来霉素的主要族群地区四世(即。,CD45 -细胞)与荧光强度> 1×103(图7 b)是观察到,在博来霉素地区不存在我+第二或第四盐碱地区。细胞与这个高荧光强度代表第四博来霉素地区4.5%的细胞,但只有1.5%的细胞在盐碱地区四世(p= 0.03)。也与趋化因子受体CXCR4与CCR5,博来霉素地区之间没有统计上的显著差异,我和博来霉素地区二世。
图7
图7。胶原蛋白伴侣HSP47 I-IV地区。(一)肺总细胞生理盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45, Pro, HSP47。HSP47水平地区I-IV,我+二所示的平均值±s.e.m.每个11盐水的平均荧光强度和17博来霉素老鼠。年代,盐水;B,博来霉素。(B)在一些实验组成(一),细胞从显示区域分散图CD45-Pro选择HSP47在这些细胞的荧光强度绘制与细胞计数。1×10的酒吧2标志着荧光强度的最大值(99)检测到标记细胞。每个地区的不同细胞计数天平。注意在博来霉素地区大量的细胞荧光强度> 1×10 IV3在其他地区,为观察。类似的结果在四个独立的实验。* *p< 0.01,* * *p< 0.002。
CD44
因为CD44被认为是一个重要的功能标记在间充质干细胞,我们确定是否CD44也可能出现在纤维细胞。在这些实验中,肺总细胞生理盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45, Pro和CD44(图8)。虽然没有统计上的显著差异是观察之间的任何地区盐bleomycin-treated小鼠,观察地区之间巨大的差异。CD44 immunolabeling只是标记背景水平的地区第四。荧光强度的水平高出20倍在地区三世,400倍高地区二世和800倍高地区。I和II区域之间的差异具有统计学意义,特别是当数据从盐水和bleomycin-treated老鼠池(p< 0.002)。总之,这两个地区的CD44 I和II的水平非常高,可能是功能重要的人口众多的地区我在博来霉素发现肺细胞。
图8
图8。CD44 I-IV地区。肺总细胞生理盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45, Pro和CD44。CD44含量I-IV地区,我+二所示的平均值±s.e.m.每个9平均荧光强度的生理盐水和11博来霉素老鼠。年代,盐水;B,博来霉素。*p< 0.05。
血纤维细胞
开始地址是否区域我和区域二细胞进入肺的循环已经拥有自己专门的表型或他们是否开发这一表型在肺,我们immunolabeled PBMC从老鼠牺牲后28天博来霉素治疗CD45和职业(图9)。基本上没有循环PBMC CD45高我的细胞表型的区域。甚至一些PBMC属于区域二世从肺细胞在不同区域二世因为肺细胞几乎完全的上半部分地区二世(CD45的水平),而PBMC中几乎完全下半部分(图9)。这些观察结果强烈支持的纤维细胞表型(以高水平的Pro上CD45 +细胞)发展的主要前体或未成熟纤维细胞进入肺。这种观点得到初步研究(图中未显示)表明28天博来霉素PBMC从未表现出高水平的HSP47和CCR5 28天博来霉素肺I和II区域。
图9
图9。循环纤维细胞。(一)从bleomycin-treated PBMC鼠标牺牲治疗开始后的28天immunolabeled CD45和职业。散点图与CD45提出了轴和Pro轴显示几乎没有细胞区域,一些细胞在第二区域中,而且,甚至在一些细胞存在于地区二世,几乎没有在第二的上半部分地区几乎所有的肺细胞在第二区域。该分布的细胞中观察到所有PBMC检查从盐水,bleomycin-treated老鼠牺牲3,10日,或在治疗后28天。(B)百分比PBMC的地区我+二世在盐水或bleomycin-treated老鼠3,10,或启动后28天的治疗。这些数据代表平均值±s.e.m. 3老鼠在每个类别。萨尔,盐水;Bleo,博来霉素。*p< 0.05。
确定区域的积累我博来霉素肺细胞可能导致高水平的类似细胞循环在更早的时间点,我们还量化地区我从盐水+二世在PBMC细胞bleomycin-treated老鼠3,10,泵植入术(图后28天9 b)。虽然没有区别生理盐水和博来霉素在任何单个时间点,有时间点之间的巨大差异。正如有相似的地区大量的细胞二世在盐水和博来霉素肺在第三天(图1),最高水平的循环地区第二I +细胞在第三天。这个观察强烈表明,这些细胞从骨髓动员,以应对手术/泵植入术。从手术恢复后,循环地区第二I +细胞的数量在10天、28天的评分相对较低。这减少一天10时尤为重要的生理盐水和博来霉素数据池(p< 0.002)。这些观察强烈建议由博来霉素的细胞区域我要么迅速招募的循环(因此不会积累)或细胞不能分化成地区我表型,直到他们被招募到肺。
纤维细胞数量和纤维化评分是高度相关的
我们先前证明CSD肽提供了预防肺纤维化引起的直接进入肺部博来霉素(Tourkina et al ., 2008)。正如我们最近表明,泵模型,其中包括系统性博来霉素治疗,更紧密地模仿几个SSc的特点(李et al ., 2014),这里我们有确定CSD泵模型中还提供了预防肺纤维化。此外,我们才开始CSD治疗开始后的12天博来霉素治疗,而在我们之前的研究CSD治疗开始前1天博来霉素治疗(Tourkina et al ., 2008)。尽管推迟治疗,五,九老鼠明显改善组织形态和纤维化评分相比,老鼠接受博来霉素和CSD车辆(图10)。纤维细胞数量的纤维化评分时,观察到显著的相关性。我地区纤维细胞相关r= + 0.80,p= 0.01;地区我+二纤维细胞,相关性r= + 0.95,p< 0.0001。这些结果强烈支持的想法,纤维细胞在肺纤维化的发展发挥重要作用,针对纤维细胞可能涉及肺纤维化的治疗疾病的一种有效方式。
图10
图10。纤维细胞数量和纤维化评分之间的相关性。老鼠接受生理盐水或博来霉素之后12天,治疗CSD或车辆2周。老鼠被牺牲在26天细胞的组织学评估和量化区域I和II。上图:图片所示为老鼠用生理盐水治疗(纤维化评分0),博来霉素+ CSD(纤维化评分2到3、5 9老鼠以这种方式回应),和博来霉素+车辆(纤维化评分5 - 7)。底:9小鼠接受博来霉素+ CSD,纤维化评分分别绘制与总肺细胞的百分比地区我地区和肺细胞总数的百分比+二世。从图供参考,数据1 d关于地区总肺细胞的百分比我和地区+二世从盐水- bleomycin-treated老鼠没有收到进一步治疗和CSD或车辆提出了在轴轮符号。萨尔,盐水;Bleo,博来霉素。
讨论
这里我们使用流式细胞术研究水平和immune-phenotype纤维化肺纤维细胞的使用一个模型系统中,博来霉素交付使用渗透微型泵系统。该泵模型(李et al ., 2014)产生的一种疾病,更类似于人类SSc博来霉素的更常见的模型是直接进入肺部。我们的研究也受益于使用一个anti-collagen我抗体,我们开发了针对胶原蛋白Iα1 c端前肽(称为Pro)。的关键优势这个抗体的特异性标记可以使用免疫原性肽经竞争。我们的主要发现是,纤维化肺纤维细胞可分为两个群体:CD45高/ Pro +细胞,我们称之为区域我和CD45 + / Pro +细胞,我们称之为区域二世。虽然地区二纤维细胞出现在控制和纤维化肺、地区我只在纤维化肺纤维细胞存在本质上。剩余的细胞肺癌可分为白细胞,CD45 + / Pro - III(地区)和所有其他细胞(CD45,称为地区IV)。
研究的细胞区域的时间进程我协会证实这些细胞与肺纤维化。这些细胞出现在saline-treated一样的低水平,控制老鼠开始后3天博来霉素治疗。即使在10天博来霉素肺的水平只有30%的水平并最终达到28天。截然不同结果达到第二区域中大量的细胞治疗开始后3天博来霉素或盐水。这个水平下降到接近基线水平附近的第十天,这个水平通过28天,尽管此时博来霉素肺的水平略高(显著)博来霉素的肺。有趣的是,细胞的数量的峰值地区II中观察到肺的第三天血液中也观察到在第三天,正如随后的减少。这些观察强烈支持这个想法,增加细胞区域二世在第三天观察到肺和血液是由于植入泵和泵的内容。
虽然大多数实验在本研究进行为期10周的老男CD1小鼠,确认细胞存在于地区》(即,all CD45+ cells) are bone marrow-derived, some experiments were performed with 24-week old C57/BL6 that had been irradiated, then reconstituted with bone marrow from mice expressing EGFP in all of their cells. Not only did these studies confirm that Regions I–III cells are all bone marrow-derived, they confirmed that the existence of Region I cells in fibrotic mice is not simply an unusual outcome that occurs only in CD1 mice or that occurs only in relatively young mice. It is also of interest that we observed that the level of EGFP is much higher in Regions I and II than in Region III (not shown) because the existence of GFP高和GFP +细胞纤维化肺最近报道(中岛美嘉et al ., 2013)。目前,这些“绿色荧光蛋白”之间的关系高我们的绿色荧光蛋白细胞和高细胞是一种猜测,因为我们的GFP高细胞是所有职业+(即。,我+)而GFP坳高中岛美嘉的细胞等人被报道<坳I + 8% (中岛美嘉et al ., 2013)。
中央研究发现肺纤维细胞的表型和白细胞在表中做了总结2。符合地区》定义的方式,CD45的平均荧光强度和Pro高出数倍的盐控制纤维细胞比盐水控制白细胞。CD45的水平和职业immunolabeling稍高纤维纤维细胞比控制纤维细胞,大概是因为CD45和Pro immunolabeling都在地区的最高水平我是只出现在纤维化小鼠纤维细胞的数量。同样值得注意的是:CD45在循环纤维细胞的水平也远低于肺纤维细胞从区域或地区。
表2
表2。在纤维细胞和纤维细胞和白细胞之间的表型差异。
结果与趋化因子受体CXCR4与CCR5提高有趣的可能性,这两种趋化因子受体具有不同的角色在纤维细胞生物学。虽然都是在多方面的高水平表达盐控制纤维细胞比盐水白细胞,CCR5的增加是趋化因子受体CXCR4的三倍多。趋化因子受体CXCR4与CCR5 immunolabeling的水平有点高纤维比控制纤维细胞和纤维细胞在地区的最高水平。有趣的是,初步研究(图中未显示)表明,趋化因子受体CXCR4在肺纤维细胞的水平比循环纤维细胞的水平,而CCR5在肺纤维细胞的水平远远高于循环纤维细胞。此外,我们表明,CD45 / Pro的分布散点图是不同的纤维细胞水平最高的CCR5比最高的纤维细胞趋化因子受体CXCR4的水平,证明这些细胞是不一样的。需要做额外的工作来解决这些观察和确定的功能意义趋化因子受体CXCR4与CCR5可能不同调节纤维细胞生物学和纤维细胞的作用在各种器官的纤维化。
分泌的胶原蛋白伴侣HSP47扮演着关键的角色,处理,形成原纤维胶原蛋白在体外和纤维化在活的有机体内(石田et al ., 2006;Hagiwara et al ., 2007)。我们发现大量增加HSP47表达式相比,纤维细胞白细胞(表2)。有一个进一步的、高度显著增加HSP47表达式相比,博来霉素纤维细胞控制纤维细胞;然而,博来霉素地区HSP47我纤维细胞的水平不是远高于在博来霉素地区II纤维细胞。与其他蛋白质检查在这项研究(CD45, Pro,趋化因子受体CXCR4 CCR5, CD44),有一个HSP47人口高细胞CD45——(即。,in Region IV) that are present at a high level in the bleomycin lung but not in the control lung. Given that we previously observed double-positive cells that are Prosurfactant C+/HSP47+ in the fibrotic, Pump Model lung and in the lungs of SSc patients (李et al ., 2014),我们发现Prosurfactant C +细胞GFP -重组小鼠(未显示),我们建议第四HSP47 +细胞的许多地区将会发现来自II型pneumocytes Prosurfactant C +细胞。
蛋白质研究中,最大的提高我们观察纤维细胞和白细胞之间的表达CD44(表2)。这都是白细胞水平的更引人注目,因为第三(地区)仍然远高于CD45 -(地区IV)细胞。这也是值得注意的,因为CD44及其配体透明质酸调节纤维细胞分化(已报告Maharjan et al ., 2011),虽然很多细节仍需进一步的研究。CD44没有更高的水平在博来霉素比盐水纤维细胞、纤维细胞CD44的水平要高得多在博来霉素地区我在博来霉素地区比二世。
为了解决纤维细胞在肺纤维化的重要性,我们对待老鼠收到博来霉素通过渗透微型泵从天0到12 CSD通过渗透微型泵从12到26天。这种治疗阻止骨髓细胞的迁移孤立这些老鼠对几种趋化因子包括CXCL12 MCP-1, MCP-3, MIP1α,MIP1β(没有显示)在体外分析,表明骨骨髓来源的细胞为影响组织的招聘应该同样的抑制在活的有机体内。尽管CSD治疗纤维化后才开始已经开始建立,这种治疗也抑制纤维细胞数量在组织和纤维化评分高度显著相关。在一起,这些观察强烈支持这一概念,CSD块纤维化的进展通过阻断招聘骨骨髓来源纤维细胞的趋化因子或其前驱物到受影响的组织。
总之,这项研究的结果表明,纤维细胞分化发生在目标组织在很大程度上,在这种情况下,肺。除了突出显示纤维细胞招聘和分化作为潜在的治疗靶点(使用CSD或其他代理)治疗纤维化疾病,这项研究也强调了CD45, CD44, CCR5,趋化因子受体CXCR4和HSP47潜在的治疗靶点。
作者的贡献
查尔斯·里斯参与研究设计,执行实验,数据解释和手稿准备。丽贝卡·李,贝丝·佩里,乔纳森·海伍德参与执行实验。在编辑迈克尔·邦纳参与执行实验和手稿。理查德。m .银和理查德·p·维斯孔蒂参与编辑稿件。埃琳娜Tourkina参与研究设计。斯坦利·霍夫曼参与研究设计、数据解释和编辑的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
金融支持
这项工作是支持的资助:USARMY / USAMRAA w81xwh - 11 - 1 - 0508(斯坦利·霍夫曼);NIH NIAMS R01 AR062078和硬皮病的资助基金会(Elena Tourkina);NIH NIAMS P60 AR049459(多学科临床研究中心)(Richard m .银);和一个NIH NCRR建设格兰特C06 RR015455。埃琳娜Tourkina也收到了玛尔塔马克斯硬皮病基金会奖。
利益冲突声明
虽然作者都没有收到任何金融受益于这项工作,Drs。斯坦利·霍夫曼和艾琳娜Tourkina使用专利的发明者(# 8058227)发给caveolin-1脚手架上的南卡罗来纳医科大学的域肽用于治疗纤维化疾病。Drs。斯坦利·霍夫曼和艾琳娜Tourkina也是一个公司的创始人,FibroTherapeutics, Inc .)的目的是开发一个基于caveolin-1脚手架域肽的药物。作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
确认
我们要感谢j·克里斯托弗·福克斯协助细胞再生医学在音乐分析执行流式细胞仪设备支持的图由美国国立卫生研究院(e GM103342)和一个RII格兰特从NSF (eps - 0903795)。我们要感谢Paul j . Nietert博士和南卡罗来纳的临床及相关研究所(SCTR)帮助统计数据。支持SCTR奖UL1TR000062从全国医学转化中心。完全的责任作者和内容并不一定代表官方观点的国家医学转化中心和美国国立卫生研究院。
引用
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引用:瑞茜·C,李R,邦纳M,佩里B,海伍德J,银RM Tourkina E,维斯孔蒂RP和霍夫曼年代(2014)纤维化肺纤维细胞:改变表型检测到流式细胞术。前面。杂志。5:141。doi: 10.3389 / fphar.2014.00141
收到:2014年4月16日;纸等待发表:5月14日2014;
接受:2014年5月27日;网上发表:2014年6月16日。
编辑:
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*通信:斯坦利·霍夫曼,风湿病学和免疫学、医学、南卡罗来纳医科大学的乔纳森·卢卡斯街96号,816套房,MSC 637年,查尔斯顿SC 29425年美国电子邮件:hoffmas@musc.edu
