toll样受体表达的3和4是人类骨骨髓来源间充质干细胞,可以抑制t细胞通过损害Notch信号调节活动gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

骨髓(BM)派生的间充质干细胞(msc)是多功能的,nonhemopoietic祖细胞,还拥有监管活动的免疫效应细胞通过不同的机制。我们证明人类BM-derived msc表达高水平的toll样受体(通常)3和4,功能性,如图所示的能力配体诱导的核因子κB (NF-κB)活动,以及生产的白介素6 (IL),引发,CXCL10。值得注意的是,结扎TLR3和TLR4 msc还抑制这些细胞的能力,抑制T细胞的增殖,而不影响其immunophenotype或分化的潜能。TLR触发效果似乎与MSC信号的损伤切口在T细胞受体。事实上,msc表示缺口配体Jagged-1, TLR3。差别或TLR4结扎导致其强烈的对这些此外,anti-Jagged-1中和抗体gydF4y2BaNgydF4y2Ba(gydF4y2BaNgydF4y2Ba——(3 5-difluorophenacetyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba丙氨酰)-gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba苯基甘氨酸gydF4y2BatgydF4y2Ba丁酯(榫眼),切口信号的抑制剂,阻碍了msc对t细胞增殖的抑制活性。这些数据表明,对msc TLR3和TLR4表达可能提供一个有效的机制来阻止msc的免疫抑制活性,因此恢复一个高效的t细胞反应过程中危险的感染,如持续的双链RNA病毒或革兰氏阴性细菌,分别。gydF4y2Ba

潜在的利益冲突的披露是发现在本文的结尾。gydF4y2Ba

我gydF4y2BantroductiongydF4y2Ba

骨髓(BM)间充质干细胞(msc)多功能nonhematopoietic祖细胞可以分化成BM基质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、tenocytes,骨骼细胞,神经元,内脏中胚层的细胞(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。他们通常不表达造血干细胞(HSC)标记,但他们表达特定模式的分子,如SH2 CD105, SH3, SH4 (CD73)、CD106(血管细胞粘附分子1),CD54(细胞间粘附分子1),CD44, CD90、CD29, STRO-1 [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在过去的几年里,它已成为明显,msc还具有免疫调节特性,已被广泛研究和免疫反应特征的相关性,以及他们在BM移植潜在有用性。鼠标BM-derived msc可以显著下调的反应天真和记忆同源多肽抗原T细胞,这种效应主要是细胞contact-dependent [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。相比之下,人类msc可能影响不同的效应细胞,包括CD4 +和CD8 + T细胞(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),自然杀伤(NK)细胞(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),B细胞(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)、单核细胞和树突细胞(dc) [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),他们的效果似乎主要依赖于可溶性因子的释放,如转化生长因子(TGF) -β1,肝细胞生长因子(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)、前列腺素EgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)、白介素(IL) -10 (gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO) [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba],interferon-γ(IFN-γ)[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。的主要机制参与MSC-mediated免疫效应细胞和抑制活动MSC-derived基质细胞在正常淋巴发展中的作用仍未知部分。然而,它已被证明,MSC注入显著延长MHC-mismatched皮肤移植的生存在狒狒gydF4y2Ba22gydF4y2Ba),降低发病率的同种异体造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GvHD)在人类gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),和治疗严重急性GvHD耐火材料常规免疫抑制治疗(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

通常toll样受体,广泛分布在细胞在免疫系统(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),是最好的免疫传感器研究的入侵微生物,和他们的活动是至关重要的诱导对病原体的免疫应答,增强适应性免疫(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。TLR家族成员也参与自身免疫性的发病机理,慢性炎症,传染性疾病(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。十三TLR1类似物已确定在人类和老鼠13(10),其为病原体识别各种各样的的分子模式在细菌,病毒,真菌,以及某些host-derived分子(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。例如,TLR2识别细菌脂蛋白,肽聚糖,lipoteichoic酸从革兰氏阳性细菌。TLR3承认virus-derived双链RNA、DNA模拟聚(我:C)。TLR4承认从革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)。TLR5识别细菌鞭毛蛋白,TLR9识别识别细菌DNA的CpG图案。TLR7 TLR8,形成一个集群进化和TLR9识别系统相关(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),最近被发现调解识别单链RNA病毒(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),作为小分子合成guanosine-based抗病毒的受体,如loxoribine [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。通常也可以形成配合物的配体,导致更大程度的特异性。例如,形成TLR1/2识别triacetylated细菌lipopeptides,而TLR2/6承认diacetylatedgydF4y2Ba支原体gydF4y2Balipopeptides [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。TLR11 TLR家族的新成员,最近被发现在老鼠身上,专题组uropathogenic细菌(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。的天然配体TLR10尚未确定。最近的研究揭示内生TLR配体的存在,如热休克蛋白和高机动组盒1,释放由坏死细胞(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

通常是I型跨膜糖蛋白包含细胞外域由众多富亮氨酸重复和胞内区域包含一个终端反向重复(行动)同源域(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。TIR域与几个行动domain-containing适配器分子(MyD88、TIRAP TRIF和有轨电车)激活一连串的事件导致诱导转录因子(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。常见的信号特性在所有通常的激活转录因子核因子κB (NF-κB),已涉及控制炎性细胞因子的表达和细胞成熟的分子。的一个子集通常导致I型干扰素的生产(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),调解抗病毒、生长抑制和免疫调节反应。最近,一种新型多发地角色通常被报道,这是相关的维护上皮内稳态通过扩散和组织修复后对上皮细胞的直接损伤(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),刺激成纤维细胞(细胞循环进入和发展的gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。此外,它最近表明,特定的ligand-mediated一些通常的触发,所表达的小鼠和人类msc、可以控制他们的增殖和分化gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

TLR表达式通过msc的发现促使我们调查潜在的TLR信号之间的联系和MSC-mediated免疫调节功能。因此,我们证明了人类BM-derived msc表达高水平的TLR3和TLR4和低水平的TLR1、TLR2 TLR5, TLR6,而他们不表达TLR7 TLR8, TLR9识别,TLR10。因此,有限合伙人和聚(我:C),但不是CpG ODN R848,能够诱导msc NF-κB激活,以及由这些细胞细胞因子和趋化因子的生产。Flow-cytometric msc的分析显示没有CD34的表达差异,CD80、CD86, CD105,和CD106未经处理和有限合伙人或聚(我:C)治疗细胞,也不影响其分化的潜力,因为他们保留向成骨细胞分化的能力,软骨细胞、脂肪细胞。然而,我们表明,除了文化有限合伙人或聚(我:C),但不是CpG ODN或R848,可以显著减少对t细胞增殖的抑制活动msc。这种效应在Jagged-1 msc,差别是由对这些切口受体配体,与t细胞增殖的抑制作用。gydF4y2Ba

米gydF4y2Baaterials和gydF4y2Ba米gydF4y2Ba治疗gydF4y2Ba

试剂和抗体gydF4y2Ba

t细胞使用的媒介文化是RPMI 1640 (Seromed、柏林、gydF4y2Bahttp://www.seromed.comgydF4y2Ba用2毫米),补充gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,1%不重要的氨基酸,1%丙酮酸,2×纯米2-mercaptoethanol (Gibco,宏伟的岛,纽约,gydF4y2Bahttp://www.invitrogen.comgydF4y2Ba)。Anti-CD3、CD4、CD8、CD16 CD19, CD105、CD106, CD90、CD31、CD45、CD14, CD34, CD80、CD86, CD119,人类白细胞抗原(HLA) (I和II类),和鼠标IgG1 IgG2a同形像控制单克隆抗体(mab)购买的BD生物科学(圣地亚哥gydF4y2Bahttp://www.bdbiosciences.comgydF4y2Ba),anti-TLR3 -TLR-4马伯买来亚历克西斯生化(圣地亚哥gydF4y2Bahttp://www.axxora.comgydF4y2Ba)。中和anti-Jagged-1山羊多克隆免疫球蛋白是来自研发系统公司(明尼阿波利斯,gydF4y2Bahttp://www.rndsystems.comgydF4y2Ba)。TO-PRO-3核染料从分子探针(尤金,或者购买gydF4y2Bahttp://probes.invitrogen.comgydF4y2Ba)。从Ancell Anti-CD29马伯购买(Bayport、锰、gydF4y2Bahttp://www.ancell.comgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

代的mscgydF4y2Ba

msc是来自健康的捐赠者BM送气,招募了知情同意后。BM单核细胞密度梯度离心法分离(Lymphoprep;奈科明,奥斯陆,挪威,gydF4y2Bahttp://www.nycomed.comgydF4y2Ba在25厘米)和培养gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba水瓶(BD生物科学)30×10的浓度gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba有核细胞5毫升杜尔贝科的修改鹰的媒介,GlutaMAX我,10% heat-inactivated成年牛血清,100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升(Gibco)。文化在37°C孵化有限公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的气氛。72小时后,不依从细胞被移除。贴壁细胞汇合的70% - -80%时,他们使胰蛋白酶化(0.05%胰蛋白酶在37°C 5分钟;Gibco)、收获和扩大在较大的玻璃瓶。细胞扩大至少6周,> 99%显示均匀immunophenotypic模式,用于实验。gydF4y2Ba

流仪结果gydF4y2Ba

MSC immunophenotypic分析进行了详细的其他地方(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。短暂,msc分离使用EDTA缓冲区,洗,resuspended 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞每毫升。一百毫升的细胞悬液在孵化+ 4°C 10分钟15%胎牛血清(FCS),其次是与特定的马伯孵化+ 4°C 30分钟。细胞被洗磷酸盐(PBS) + 0.5%牛血清白蛋白(BSA)和分析流式细胞术(BDLSR II;BD生物科学)。CD4 + T细胞,获得外周血单核细胞(PBMCs)设计magnetic-activated细胞排序(mac;格拉德巴赫Bergisch Miltenyi研究,德国,gydF4y2Bahttp://www.miltenyibiotec.comgydF4y2Ba),与anti-CD3孵化,CD4、CD8, CD14、CD16,和CD19 + 4°C的马伯15分钟,用PBS加上0.5% BSA洗净,用流式细胞术分析。gydF4y2Ba

MSC分化分析gydF4y2Ba

msc分化潜力的评估测试向脂肪细胞分化的能力,成骨细胞,软骨细胞,如前所述gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。Adipocytic分化后实现了msc与脂肪形成的文化中包含10 2周gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}M地塞米松、10μg /毫升胰岛素和100μg /毫升3-isobutyl-1-methylxantine (Sigma-Aldrich、米兰、意大利、gydF4y2Bahttp://www.sigmaaldrich.comgydF4y2Ba)。与成骨细胞的成骨细胞的分化达到2周后文化中包含10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}地塞米松,50μg /毫升抗坏血酸,10毫米β-glycerophosphate (Sigma-Aldrich)。Chondrocytic分化后实现了帷幕,文化与Chondrocytic介质包含10 (CM)gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}M地塞米松和10 ng / ml TGF-β(Sigma-Aldrich),它被添加到2.5×10的球gydF4y2Ba^5gydF4y2Bamsc在1500转离心10分钟。油红O,冯Kossa,甲苯胺蓝染料被用来识别脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞,分别。gydF4y2Ba

隔离PB的CD4 + T细胞gydF4y2Ba

负选择PB的CD4 + T细胞是由mac (Miltenyi研究),所述其他地方(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。纯洁的消极选择人口持续≥97%。gydF4y2Ba

扩散分析gydF4y2Ba

净化人类CD4 + T细胞(10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞)与10刺激gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba辐照(9000 rad)同种异体T-cell-depleted PBMCs和1μg /毫升anti-CD3马伯(BD生物科学),有或没有不同数量的msc (2×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba,10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba,10gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba每口井的细胞),在没有或存在聚(我:C) (Sigma-Aldrich)有限合伙人(Sigma-Aldrich),或R848 (−Resiquimod, S28463;3 m制药、圣路易斯、gydF4y2Bahttp://www.solutions3m.comgydF4y2Ba)。第四天,文化脉冲与0.5μCi 8小时(0.0185兆贝可)gydF4y2Ba^3gydF4y2BaH-thymidine放射性核素(Amersham生物科学,小都,英国,gydF4y2Bahttp://www.amersham.comgydF4y2Ba)和收获,放射性核素吸收被闪烁计数测量。gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验对细胞因子和趋化因子gydF4y2Ba

大量的il - 10,引发(BD生物科学)、il - 6、il - 4(研发系统),和IFN-γ(单子叶植物,沃本,妈,gydF4y2Bahttp://www.endogen.comgydF4y2Ba)是评价自制的夹心酶联免疫吸附测定(elisa)使用商业双马伯。大量的CXCL10,铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、IL-1βTGF-β1(研发系统),和CXCL4 (PF4 Asserachrom;罗氏诊断,曼海姆,德国,gydF4y2Bahttp://www.roche-applied-science.comgydF4y2Ba被商业elisa)测定。gydF4y2Ba

被罩活动测量gydF4y2Ba

被罩活动是衡量确定犬尿氨酸内容由自制的系统,所述其他地方(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。100年短暂μl细胞的上清液添加到25μl 30%三氯乙酸(卷/卷),涡流,孵化30分钟50°C到水解gydF4y2BaNgydF4y2Ba-formylkynurenine犬尿氨酸。10000年后离心10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba100μl上层清液转移到96好平底的盘子和混合100μl 2%刚做好Earlich试剂(Sigma-Aldrich) (gydF4y2BapgydF4y2Ba在冰醋酸-dimethylbenzaldheide)。gydF4y2Ba

10分钟后的孵化,吸光度是阅读在492 nm波长标。犬尿氨酸浓度使用连续稀释的标准曲线计算gydF4y2BalgydF4y2Ba犬尿氨酸(Sigma-Aldrich),然后通过减去控制水平(完全培养基+ 10% FCS,也接受了同样的治疗样本)。gydF4y2Ba

NF-κB易位的定量分析gydF4y2Ba

核易位转录因子的量化在核提取物高纯度msc利用TransAM ELISA-based包专门针对人体活化NF-κB(活动主题,卡尔斯巴德、钙、gydF4y2Bahttp://www.activemotif.comgydF4y2Ba)。简单地说,3×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba从三个健康的捐赠者msc在six-well培养板1毫升的完全培养基补充heat-inactivated 10% FCS (UT HyClone,洛根,gydF4y2Bahttp://www.hyclone.comgydF4y2Ba)没有或有限合伙人,保利(我:C),或者R848 30分钟。的文化,细胞被广泛用PBS溶液洗净;去除细胞质分数后,核提取物通过使用核提取工具包(活动主题)根据制造商的协议。一微克核提取物在96孔板镀涂上包含激活的固定化寡核苷酸NF-κB共识网站(59-GGGACTTTCC-39),其次是孵化与抗体识别的抗原决定基p50亚基。辣根peroxidase-conjugated二级抗体提供了一种量化通过分光光度法比色读出。Raji核提取物被用作积极控制,按照制造商的建议。监控检测的特异性,野生型共识寡核苷酸作为竞争对手NF-κB绑定。gydF4y2Ba

RNA提取和定量即时逆转录-聚合酶链反应gydF4y2Ba

总RNA提取利用RNeasy工具包和DNase我处理以消除任何基因组DNA污染(试剂盒,希尔登,德国,gydF4y2Bahttp://www1.qiagen.comgydF4y2Ba)。1毫克的互补脱氧核糖核酸合成从每个样本的总RNA TaqMan逆转录试剂(应用生物系统公司,促进城市、钙、gydF4y2Bahttp://www.appliedbiosystems.comgydF4y2Ba),根据制造商的协议。实时聚合酶链反应(PCR)进行ABI棱镜7900 ht序列检测系统(应用生物系统公司),根据制造商的指示。PCR扩增都由微安光学96孔板与TaqMan普遍掌握混合和反应Assay-on-Demand(应用生物系统公司)。每个试验进行了复制,包括没有模板样本作为消极的控制。逆转录(RT)负样本被用来证明是RT-dependent获得的信号。相对mRNA的表达水平是决定通过比较实验水平与标准曲线生成人类PBMCs系列稀释cDNA获得。β-Actin作为标准化的看家基因。gydF4y2Ba

共焦显微镜gydF4y2Ba

人类msc在Lab-Tek二室培养幻灯片(Nalge Nunc国际内伯威尔市,,gydF4y2Bahttp://www.nalgenunc.comgydF4y2Ba为3天);这段时间后,细胞被固定在甲醛(2%在PBS pH值7.2),permeabilized特里同为0.05% (Sigma-Aldrich) 10分钟,在室温下孵化和多克隆兔免疫球蛋白g(1毫克/毫升)阻止不特定网站的抗体(Ab)绑定。15分钟后,细胞被孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭马伯特定TLR3或鼠标IgG1同形像控制(包括20μg /毫升)30分钟;在相同的缓冲区,TO-PRO-3染料添加(0.2μM)核复染色。细胞在PBS 5分钟,然后洗和幻灯片与Vectashield安装安装介质(向量实验室,伯林盖姆、钙、gydF4y2Bahttp://www.vectorlabs.comgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

识别Jagged-1,新鲜的或聚(我:C)进行预处理,附着msc是孵化与Jagged-1-specific山羊免疫球蛋白Ab或控制山羊免疫球蛋白,在一个anti-CD105鼠标IgG1马伯(如控制膜染色)30分钟(所有的Abs用于10μg /毫升)。孵化后,细胞被洗和固定如前所述。细胞培养的Alexa萤石546 -共轭兔抗体Abs和Alexa萤石488 -共轭兔子anti-mouse IgG1 Abs(5μg /毫升);核是沾TO-PRO-3如前所述。gydF4y2Ba

共焦研究是由使用LSM 510元共焦显微镜(德国卡尔蔡司,耶拿gydF4y2Bahttp://www.zeiss.comgydF4y2Ba)。获得的图像×40目的(对应于放大×400)。gydF4y2Ba

单共焦图像细胞获得核赤道水平通过使用1的单元公式调整针孔直径,对应于一个光学片0.7μm (FITC发射图像)。图像获取和分析利用LSM 5软件(卡尔蔡司)。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

扩散的统计比较分析武器进行了根据学生gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。被认为具有统计显著性差异gydF4y2BapgydF4y2Ba< . 05。gydF4y2Ba

RgydF4y2Ba试验结果gydF4y2Ba

人类BM-Derived msc TLR3和TLR4表达高水平的功能活跃gydF4y2Ba

msc显示CD105的组成型表达CD29, CD90、CD106,和HLA类我但不是CD80、CD86、CD45、CD34、CD31 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。相同的细胞显示multilineage分化潜力评估脂肪形成的培养,成骨的或chondrogenic介质(数据没有显示;(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

调查通常的表达在人类BM-derived msc、vitro-expanded msc获得健康受试者评估实时rt - pcr TLR mRNA TLR1-TLR10内容通过使用特定的引物。所示gydF4y2Ba图1 bgydF4y2BaTLR3和TLR4 mrna被msc和高度表达;相比之下,低水平的TLR1、TLR2 TLR5, TLR6和没有TLR7, TLR, 8, TLR9识别或TLR10 mrna在BM-derived发现msc (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。TLR3和TLR4的蛋白表达在人类培养的msc是通过流式细胞术(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。此外,intracytoplasmatic本地化TLR3也评估了共焦显微镜分析(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

众所周知,TLR在免疫细胞活化诱导的易位NF-κB从胞质核,导致NF-κB-dependent基因表达(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。因此我们研究msc NF-κB活动接触TLR3或后TLR4配体。所示gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba保利(我:C) (TLR3配体)和有限合伙人(TLR4配体),但不是R848 (TLR7配体和TLR8),可以诱导NF-κB易位细胞核不到30分钟,证明通常表达的msc功能。TLR在DCs激活也会导致各种细胞因子和趋化因子的分泌gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。因此,提供额外的证据表明表达的tlr msc是活跃的,我们评估ELISA IL-1β,il - 6,引发,TGF-β1,CXCL10,和CXCL4文化上层清液由TLR3 msc刺激,TLR4或TLR7/8配体。在TLR配体测试,只有有限合伙人和聚(我:C)能够诱导il - 6,引发,在文化上层清液CXCL10分泌,而TGF-β没有影响,也没有分泌IL-1β或CXCL4 (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。然后我们问TLR3和TLR4结扎msc可以对他们有一些影响immunophenotype和分化的潜能。增加文化有限合伙人或聚(我:C)没有改变CD34的表达,CD80、CD86, CD105、CD106 BM-derived msc,评估通过流式细胞术(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。此外,5天的msc预处理与有限合伙人或聚(我:C)没有损害向脂肪细胞分化的能力,软骨细胞、成骨细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。这些数据清楚地表明,人类BM-derived MSC TLR3和TLR4表达这些受体的触发特定配体诱导细胞的激活和生产的一些细胞因子和趋化因子,在不影响MSC immunophenotype或分化的潜能。gydF4y2Ba

TLR3和TLR4 BM-Derived msc的刺激抑制抑制CD4 t细胞增殖的能力gydF4y2Ba

在以前的报告中,我们已经表明,人类骨骨髓来源msc可以抑制CD4 + T细胞的增殖与T-cell-depleted刺激同种异体PBMCs [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。因此,我们研究了有限合伙人的影响,保利(我:C)和R848 msc的免疫抑制活性。为此,我们评估纯化CD4 + T细胞的增殖在同种异体刺激,培养后没有出现越来越多的msc没有或有限合伙人,保利(我:C),或者R848。正如预期的那样,msc的加入显著抑制CD4 + T淋巴细胞的增殖激活(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。然而,添加有限合伙人或聚(我:C),但不是R848, 1:10 MSC-CD4 + t细胞比例,几乎完全恢复了CD4 + t细胞增殖所评估的胸苷吸收,细胞计数,CFDA-SE染色(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba;数据未显示)。排除的可能性恢复T细胞增殖是由tlr配体对CD4 + T细胞的影响或T-cell-depleted同种异体PBMCs mscgydF4y2Ba独自一人gydF4y2Ba与保利preincubated 5天(我:C)或R848然后收集,清洗,最后与同种异体PBMC-stimulated cocultured CD4 + T细胞。即使在这些实验条件,我们观察到显著减少的能力msc抑制CD4 + T细胞的增殖所聚(我:C) (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

TLR3和TLR4刺激并不影响语言活动或铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba水平gydF4y2Ba

在先前的研究中,通过使用语言活动的竞争性抑制剂,催化转换从色氨酸犬尿氨酸,我们表明,部分但是大量抑制抑制活动施加的msc的增殖与T-cell-depleted CD4 + T细胞刺激同种异体PBMCs IDO活动有关(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。这一发现的基础上,我们假设可能干扰对LPS、保利(我:C)油活动,导致MSC的抑制免疫抑制功能。支持这种可能性,CD4 + T细胞与T-cell-depleted刺激同种异体PBMCs,缺失或出现越来越多的msc,有或没有有限合伙人或聚(我:C);4天之后,大量的犬尿氨酸在上层清液的体外文化进行评估。此外,这些细胞被收获和t细胞增殖的程度进行评估。所示gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba,保利(我:C)或LPS抑制msc的抑制活性,但犬尿氨酸的含量相同的上层清液中细胞培养并没有变化,因此表明IDO通路是不会受到TLR3和TLR4绑定(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

铂族元素的作用gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在抑制人类msc最近活动施加的证明(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。排除可能影响有限合伙人和聚对铂族元素(我:C)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产由msc,我们测量铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba上层清液的浓度相同的细胞培养。有限合伙人和聚(我:C)对msc的能力表现出任何影响生产铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(数据没有显示)。gydF4y2Ba

Notch信号参与镇压的msc、活动和TLR触发会使诺配体Jagged-1的表达gydF4y2Ba

Notch通路是在进化过程中高度保守的和普遍参与细胞命运决定在分化(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。Notch信号依赖于γ-secretase-mediated乳沟切口受体胞内域的研究所和易位到细胞核,它与阻遏CBF-1 / RBP-Jκassociates,转化为一个激活的转录(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。最近,它也被报道,切口配体之一,Jagged-1,诱发抑制t细胞增殖、活化和细胞因子的生产gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。有趣的是,它也被报道,Jagged-1-overexpressing DCs可以调节辅助T细胞分化,这一现象可以通过孵化抑制DCs TLR配体,Jagged-1的差别而导致一个戏剧性的对这些gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。基于这些发现,我们问Jagged-1是否可以参与msc对t细胞增殖的抑制的活动和它的表达是否可以改变结扎后通常在相同的细胞。为此,我们首先评估量化实时rt - pcr Jagged-1的表达和delta 4(另一个切口配体)在人类msc。所示gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba两个切口的配体检查,只有Jagged-1显著表达。因此,纯化CD4 + T细胞刺激与同种异体细胞培养有或没有越来越多的msc、存在与否的不同浓度的中和anti-Jagged-1多克隆Ab,所示gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba,在文化anti-Jagged-1 Ab的20和10μg /毫升的浓度显著恢复msc的能力,抑制CD4 + T细胞的增殖。为了进一步支持Jagged-1 /等级的参与交互抑制活性的人工msc、γ-secretase抑制剂我们进行更多的实验gydF4y2BaNgydF4y2Ba(gydF4y2BaNgydF4y2Ba——(3 5-difluorophenacetyl -gydF4y2BalgydF4y2Ba丙氨酰)-gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba苯基甘氨酸gydF4y2BatgydF4y2Ba丁酯(榫眼),也被抑制镍镉的释放(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba),被添加到MSC / t细胞cocultures。所示gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba,榫眼显著降低人类msc抑制t细胞增殖的能力。根据这些数据,我们假设结扎TLR3或TLR4 msc等级的差别可能引起对这些配体Jagged-1这些细胞和随之而来的减少他们的抑制能力。证明这一假说,TLR结扎的影响的表达Jagged-1 msc检查。所示gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba,Jagged-1 mRNA表达显著降低刺激msc与保利(我:C)或有限合伙人与R848但不是。证明Jagged-1 mRNA减少也伴随着Jagged-1蛋白表达降低,Jagged-1表达式也评估了共焦显微镜在msc培养没有或存在TLR3配位聚(我:C)。所示gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba基底条件下,Jagged-1表达,及其与CD105的表达有关的膜;相反,和依照mRNA数据,Jagged-1表情似乎存在大幅下调的保利文化(我:C) (gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。综上所述,这些数据提供了强有力的证据表明Jagged-1 /切口交互可能参与msc对t细胞增殖的抑制活动,这种效应引起的差别可以通过Jagged-1恢复对这些TLR3和TLR4结扎。gydF4y2Ba

DgydF4y2BaiscussiongydF4y2Ba

msc具有多种功能,被认为是重要的潜在细胞疗法。理解的因素和机制调节MSC分化、自我更新,抑制持续的免疫反应是至关重要的,可以让我们操纵它们治疗使用。我们这里显示,一些通常,尤其是TLR3和TLR4表达BM-derived MSC和功能,如图所示,其配体的能力,聚(我:C)和有限合伙人,分别诱导MSC NF-κB激活,以及细胞因子的生产,如白介素、或趋化因子,如CXCL10和引发。这些发现与最近报道结果一致华曹et al .,显示高表达的功能性TLR2, TLR3, TLR4和TLR6人类msc隔绝BM和脂肪组织gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。更重要的是,我们证明TLR3和TLR4结扎msc可以调节他们的免疫抑制T淋巴细胞增殖活动。值得注意的是,这些影响发生在不改变MSC immunophenotype或分化的潜能。我们的数据显然是在与那些报道Pevsner-Fischer et al。gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),这表明TLR2配体Pam3Cys不会影响免疫抑制小鼠MSC施加于t细胞增殖活动。一种解释可能是小鼠和人类模型是不同的。另一个更可能的可能性是,在我们的分析我们使用作为目标整体CD4 + T细胞的数量,而这些作者评估了免疫抑制TLR结扎对msc的影响通过使用一个同源抗原激活的T细胞线,这可能是对TLR结扎的影响在msc。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们还提供证据表明MSC TLR结扎的影响不影响至少有一些描述的机制,一直负责MSC在T细胞的免疫抑制活动到目前为止,如语言活动和铂族元素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产。有抑制的活动这一事实总协定msc施加于细胞免疫系统的取决于两种可溶性因素(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)和细胞间contact-dependent机制的分子基础尚未确定(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在这里,我们表明,msc的抑制效应是由一个未知的机制基于缺口在T细胞受体的信号。切口的跨膜受体家族的成员是非常参与控制的区别,增殖和凋亡在多种细胞类型gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。先前的报道表明,缺口配体的超表达Jagged-1 DCs可以调节辅助T淋巴细胞的分化和结扎的TLR在DCs诱发Jagged-1[差别一个戏剧性的对这些gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。这一发现的基础上,我们首先假设Notch信号可以参与msc对t细胞增殖的抑制活性。Notch信号是由镍镉的γ-secretase-mediated乳沟,易位到细胞核,激活CBF-1 / RBP-Jκ[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。与我们的假设一致,免疫抑制效应t细胞增殖抑制了anti-Jagged-1中和Ab和榫眼γ-secretase抑制剂。此外,我们发现msc持续表达Jagged-1而不是其他配体,delta 4,由msc Jagged-1的表达抑制mRNA和蛋白水平TLR3或TLR4的结扎。综上所述,这些数据表明,结扎TLR3或TLR4 msc抑制T细胞增殖抑制的影响,阻碍他们的Jagged-1表达式,因此,削弱其信号等级在T细胞受体表达。因此,我们不仅发现了一个新的机制,负责细胞contact-dependent, msc在T细胞免疫抑制的影响,但我们也提供了第一个证据等TLR参与免疫调节活动。gydF4y2Ba

这项研究的结果提出的问题的存在的病理生理意义的TLR msc和参与的监管效应t细胞反应。众所周知,对病原的T细胞反应需要的有效诱导T细胞受体(TCR)刺激,costimulatory的参与分子,细胞因子受体的表达。此外,免疫调节细胞和电路的时序downmodulation负责免疫耐受有助于支持适用于消除病原体的免疫反应。在这个过程中,通过其分子模式刺激(pamp)通常在DCs已被确认为有效的宿主防御的关键部分(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。事实上,TLR触发警报的先天免疫系统的存在微生物制剂和诱发dc的成熟项目,使这些细胞作为抗原呈递细胞特异性T淋巴细胞在淋巴结,导致自适应免疫反应(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。然而,通常的表达分析和TLR配体的体内应用证明了通常在免疫调节中的作用是更复杂的比简单的直流感应成熟。通常确实是广泛表达的免疫细胞,包括T和B淋巴细胞(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),甚至通过多发地细胞如上皮和内皮细胞(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。有趣的是,自然引起调节性T (Treg)细胞表达通常gydF4y2Ba57gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。众所周知,Treg细胞对自身免疫性疾病的保护至关重要,但他们也可以阻碍免疫反应对癌症和感染。因此,通常在Treg细胞的存在提高了有趣的可能性,TLR触发也可以导致免疫抑制通路的调制,从而允许更强大的免疫反应。最近,它已被证明TLR2触发高纯度Treg细胞,结合加法和TCR - 2结扎,否则会导致的扩散无能Treg细胞在体外和体内gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba]。此外,TLR2结扎暂时废除Treg细胞的抑制表型,从而提高免疫反应在体外和体内急性感染模型(gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba]。因此,人类发现了Treg细胞表达高水平的TLR8,及其对这些细胞的触发阻止他们抑制表型(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba]。因此,TLR配体似乎有能力调节免疫反应甚至通过代理直接在TLR Treg细胞存在。gydF4y2Ba

我们证明人类BM-derived msc还表达通常和他们的触发特定配体不仅能诱导这些细胞促炎细胞因子和趋化因子的产生也抑制t细胞增殖抑制活动是符合所有的差别在微生物感染的概念对这些免疫抑制细胞和电路(包括那些由msc)可能是有用的,让效应响应对入侵代理变得更有效率。gydF4y2Ba

证据表明,msc,完全与那些来自BM,也可以实现从淋巴组织,如脾和胸腺(gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba),表明MSC-derived基质细胞可能起着重要的作用在t细胞启动中小学淋巴组织。一些初步结果,我们已经获得了脾脏,thymus-derived msc符合TLR的广泛参与和等级系统msc的免疫调节效应不同的起源,从而揭示出共同的途径的免疫调节微环境基质舱(数据没有显示)。gydF4y2Ba

最后,TLR结扎的示范pamp msc损害他们的免疫抑制活动可能也有实际意义的细胞干预策略。事实上,同种异体msc,除了使用在再生医学,临床评估治疗移植物抗宿主病,因为初步研究结果表明,这些细胞可能提高移植移植(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba]。演示,msc丢失后引发的免疫抑制活性的tlr TLR3表达表明,传染性病原体表达pamp, TLR4,但也可能为TLR2和TLR6 [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba),应考虑在这种类型的治疗风险特别高。gydF4y2Ba

一个gydF4y2BacknowledgementsgydF4y2Ba

这项工作是支持的意大利大学和科学研究、意大利癌症研究协会,意大利国家研究委员会、基金会Cariverona,卫生部托斯卡纳地区。F.L.和R.A.同样这项工作。gydF4y2Ba

DgydF4y2Baisclosure的gydF4y2BaPgydF4y2Ba这种不gydF4y2BaCgydF4y2Baonflicts的gydF4y2Ba我gydF4y2Ba兴趣的gydF4y2Ba

作者指出任何潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

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