严重肺部疾病患者循环祖细胞减少

摘要

慢性重症肺病患者容易发生肺血管重塑，可能是由于肺内皮功能障碍。循环内皮祖细胞(EPCs)参与维持内皮稳态。本研究的目的是评估阻塞性和限制性肺部疾病是否与外周血EPC数的改变有关。该研究为横断面研究，涉及梗阻性(n= 15)和限制性(n= 15)吸氧治疗的肺部疾病和15个对照组。循环EPCs由CD34、CD133和激酶插入结构域受体的表面表达来定义。肺活量试验、血气分析和血细胞计数的结果与EPC数相关。慢性缺氧和严重肺部疾病患者的所有祖细胞水平均低于对照组。与梗阻性患者相比，限制性患者的EPC进一步降低。在限制性患者中，EPC减少与肺容量减少和肺泡动脉扩散受损有关，而祖细胞水平与红细胞数量直接相关。对于梗阻患者，祖细胞水平与支气管梗阻显著相关，祖细胞水平与动脉氧张力显著相关。这些发现表明慢性肺部疾病和长期缺氧患者的EPCs减少。这种改变在限制性患者中更为明显，并与疾病严重程度相关。在这些疾病中，循环内皮祖细胞耗竭可能与肺循环内皮稳态的改变有关。

我ntroduction

在大多数弥漫性阻塞性和限制性肺病中，可观察到进行性肺血管重塑和新生血管[1- - - - - -4］．其功能后果是继发性肺动脉高压(PH)，可能导致过早死亡和增加发病率[5，6］．在阻塞性和限制性肺病中，继发性PH的发生涉及多种因素，包括缺氧引起的持续性肺血管收缩[7- - - - - -9］．特别是，人们认为缺氧诱导的内皮功能障碍为血管重塑过程奠定了基础[10- - - - - -13]，其部分原因是内皮来源的血管活性分子的产生和释放不平衡[14- - - - - -16］．

内皮祖细胞(EPCs)已被发现参与人类血管新生和血管完整性的维持[17- - - - - -19］．它们被认为是能够分化成成熟内皮细胞的干细胞的一个子集，它们可以根据反映不成熟和内皮细胞承托的表面标记物的表达来定义[20.，21］．许多事件和介质，包括组织缺血和细胞因子，能够从骨髓中动员EPCs [22]，但目前尚不清楚慢性全身性缺氧是否在EPCs的动员中发挥作用。最近，EPC减少已被证明与体循环内皮功能障碍有关[23]，有趣的是，PH患者内皮功能障碍标志物升高[11，24］．

在本研究中，我们验证了肺血管稳态改变可能归因于严重肺部疾病所致慢性低氧血症患者循环EPCs数量减少的假设。

我们的数据不能证实慢性缺氧和组织缺血一样刺激内皮祖细胞的假设。相反，患有阻塞性和限制性肺部疾病的患者外周血中EPCs水平低于对照组。这种改变可能导致这些患者的肺内皮功能障碍、肺部疾病进展和心血管风险增加。

米aterials和米治疗

病人

该研究共纳入30例因肺部疾病引起的慢性缺氧患者和15名健康对照受试者。所有患者均来自Unità地区威尼托17区社会卫生社会服务部，对照组则来自当地社区。获得伦理委员会的批准和所有受试者的知情同意。纳入患者的标准是接受氧疗至少6个月的慢性肺部疾病。慢性阻塞性肺病(n= 15)和限制性肺病(rld) (n= 15)。国际指南已被用于验证诊断。慢性阻塞性肺病的功能性诊断是在有静息性或运动性呼吸困难病史，并在1秒内用力呼气量与用力肺活量(FEV1/FVC)比值降低，并在标准的spyrovolume试验中出现不可逆的气道阻力增加时考虑的。根据美国胸科学会的声明[25]，根据持续咳痰且每年至少3个月、连续至少2年的病史，诊断为慢性支气管炎。当COPD的功能诊断与慢性支气管炎的临床特征无关时，考虑肺气肿的诊断;呼气延长、恶性膨胀和呼吸音降低的证据支持临床诊断，并在标准的spyrovolume测试中存在残余体积/薄层色谱比增加时得到证实;其他提示肺气肿的特征包括:标准的后前胸片上，膈膜呈扁平状，前后胸径大于外侧胸径。

RLD的诊断[26]在肺容量(总肺容量、强迫肺活量和残余容积)一致减少和改变一氧化碳扩散试验的情况下被考虑。对于间质性肺疾病，带体积损失的网状混浊被认为是一种提示性的影像学特征，标准x线片上的发现总是在按照既定指南使用造影剂后，通过高分辨率计算机断层扫描确认，并由具有评估弥漫性肺疾病经验的放射科医生解释:弥漫性网状改变、磨玻璃影和蜂窝状面被认为是暗示性的模式。

对照组没有肺部疾病的临床和仪器证据，平均而言，与患者的年龄和性别相匹配。

排除标准为受试者拒绝、急性疾病、已诊断或高度推测的肿瘤、年龄在80岁以上、近期手术或血管介入、心血管疾病或已确诊的危险因素、透析、急性感染、自身免疫性疾病、器官移植。通过最低标准，如病史评估和基础临床检查，排除心血管疾病和危险因素，除非心脏异常被认为是继发于肺部疾病。

患者接受肺活量测定试验、一氧化碳扩散试验、动脉和静脉血气分析以及心电图的标准评估。有条件时，也记录超声心动图结果。抽取血液样本以测定白细胞和红细胞计数、红细胞压积和血红蛋白。同时记录药理学资料和吸烟习惯。

外周血祖细胞的定量研究

在一夜禁食之后，病人被送入了门诊。在采血前停氧1小时。静脉血样本取自前臂静脉，1-2小时后处理。通过流式细胞仪分析，采用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联、藻红素(PE)偶联和异藻蓝素(APC)偶联单克隆抗体(mab)，对外周血祖细胞进行细胞表面抗原的直接三色分析(FACSCalibur;贝克顿，狄金森公司，富兰克林湖，新泽西州http://www.bd.com)，如先前报道[27，28］．简单地说，在用特异性单克隆抗体染色之前，用胎牛血清处理细胞10分钟，然后用含有磷酸盐缓冲盐水和0.5%牛白蛋白的缓冲液洗涤样品。然后，150 μl外周血与10 μl FITC偶联的抗人CD34单抗(Becton, Dickinson and Company)和5 μl APC偶联的抗人CD133单抗(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)孵育。http://www.miltenyibiotec.com)和10 μl PE偶联抗人KDR单抗(R&D Systems Inc.， Minneapolis，http://www.rndsystems.com)，然后在4°C孵育30分钟。未标记细胞或抗同型抗体作为对照。上述试剂阳性的外周血细胞频率由样本的二维侧面散射荧光点图分析确定，经过适当的门控(图1一个- - - - - -1 c)．在形态学门控排除粒细胞和细胞碎片后，我们对CD34进行门控⁺然后检测结果人群中KDR和CD133的双重和三重表达(图1一个- - - - - -1克)．循环祖细胞定义为CD34⁺或CD133⁺或CD34⁺CD133⁺而内皮祖细胞被定义为CD34⁺或者是CD133⁺KDR⁺和CD133⁺CD34⁺KDR⁺细胞。对于荧光激活细胞分选分析，采集了50万个细胞，并使用FACSCalibur分析仪(Becton, Dickinson and Company)进行评分。数据处理使用麦金塔CELLQuest软件程序(Becton, Dickinson and Company)。通过分析抗CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PECy5/CD45 APC四色组合标记的外周血淋巴细胞表达，每天优化仪器设置。在整个研究过程中，由同一名训练有素的操作员执行所有测试，他对患者的临床状况一无所知。

祖细胞凋亡检测

使用市售Annexin V细胞凋亡检测试剂盒，流式细胞术检测凋亡细胞上Annexin V与外化磷脂酰丝氨酸的结合，从而检测祖细胞的凋亡。http://www.bdbiosciences.com/pharmingen)，按照制造商的指示，如先前报告[29］．简单地说，细胞被Annexin V‐FITC、抗人CD34 PE‐Cy5、或抗人CD133 APC (Miltenyi Biotech)和抗人KDR PE单抗(R&D Systems)标记;在绑定缓冲液中重悬;然后使用FACSCalibur分析仪进行分析。通过适当的前向光散射阈值设置，将细胞碎片从分析中排除。至少5 × 10⁵对每种条件下的细胞进行分析。细胞图的四个象限采用阴性对照。CD34⁺, CD133⁺, CD34⁺KDR⁺， CD133⁺KDR⁺分析细胞Annexin V结合情况。每个象限的细胞比例表示为占总种群的百分比(图1 h)．

统计分析

数据以均数±SEM表示。流式细胞术分析的所有结果均报告为每1,000,000个流式细胞术事件的细胞数。两组或两组以上的比较由未配对的学生组进行t分别进行方差检验和分析。的χ²二分类变量采用检验。临床数据与细胞计数之间的统计学相关性采用线性回归的单变量分析进行检验。如果零假设可以在p≤0。。

R试验结果

病人的特点

患者特征报告于表1．梗阻性和限制性患者之间的显著差异反映了两种疾病的不同病理生物学。COPD患者比RLD患者吸烟更严重。RLD患者有以下诊断:6例(40%)有弥漫性间质性肺疾病(5例特发性肺纤维化，1例结节病);2例(13.3%)患者因结核病而发生纤维胸;7例(46.7%)患者因严重肥胖(4例)、肌萎缩性侧索硬化症(1例)或严重脊柱后凸(2例)而出现机械通气障碍。慢性阻塞性肺病患者有慢性支气管炎(8例)或肺气肿(7例)。

COPD或RLD患者循环祖细胞水平

在整个研究样本中，祖细胞的变化范围如下:CD34⁺(42-2668 / 10⁶细胞),CD133⁺(24-1737 / 10⁶细胞),CD34⁺CD133⁺(19-1353 / 10⁶细胞),CD34⁺KDR⁺(9-337 / 10⁶细胞),CD34⁺CD133⁺(1-245每10⁶细胞)和CD34⁺CD133⁺KDR⁺(0-121每10⁶细胞)。

总的来说，与健康对照组相比，慢性全身性缺氧患者的特点是外周血中所有祖细胞亚型均显著、自愿和显著减少(图2一个)．CD133⁺CD34⁺KDR⁺更符合EPCs定义的细胞差异最大(6.75±1.24 vs. 19.38±5.26;Δ = 65%;p= . 01)。由RLD引起的呼吸衰竭患者的所有循环祖细胞数量最低。此外，RLD的特征是与COPD相关的所有细胞亚型一致减少，尽管只有CD34达到了统计学意义⁺, CD133⁺， CD34⁺CD133⁺细胞。为了确定循环祖细胞的减少是否与细胞死亡增加有关，进行了Annexin V结合试验。CD133细胞凋亡率⁺KDR⁺患者CD34细胞(49.18%±6.61%)明显高于对照组(31.87%±9.09%)⁺KDR⁺与对照组(18.0%±6.85%)和COPD患者(18.61%±3.96%)相比，RLD患者祖细胞选择性增加(34.64%±13.4%)(图2 b)．

祖细胞计数与疾病严重程度的相关性

在COPD患者亚组中，CD133⁺CD34⁺KDR⁺细胞与动脉氧张力相关(r=−。55;p= .03)，加上氧疗的通量(r= =收;p= .002)， CD133⁺KDR⁺与FEV1/FVC比值相关的细胞(r=−点;p= .04点)。（图3)．肺气肿与慢性支气管炎无明显差异。

在RLD患者亚组中，CD133⁺CD34⁺KDR⁺细胞与总肺活量相关(r= .64点;p= .008)，剩余体积(r= .64点;p= .01)，以及一氧化碳扩散(r= .68点;p= .005)，红细胞数(r= 2;p= .003)，血液血红蛋白浓度(r= .90;p< .001)，红细胞压积值(r=点;p< .001) (图4)，而与白细胞计数无显著相关性(未显示)。实质性RLD和机械性RLD之间无差异。

吸烟对祖细胞水平的影响

与不吸烟的COPD患者相比，当前吸烟习惯的COPD患者表现出所有祖细胞进一步一致减少的趋势，这对CD133具有统计学意义⁺CD34⁺KDR⁺细胞(4.67±2.46 vs. 10.33±1.78;Δ = 55%;p= .049)， CD133⁺KDR⁺细胞几乎显著(p= .07)和CD34⁺KDR⁺细胞未受影响(图5)．CD133的百分比⁺KDR⁺Annexin V结合阳性的细胞在吸烟者中高于非吸烟者(70.7%±5.8% vs. 30.5%±2.3%;p= .005) (图5 b)．

在RLD患者中，吸烟者的循环祖细胞水平往往高于非吸烟者，这对CD133有统计学意义⁺(241.2±61.5 vs. 131±18.3;p= .03)， cd34⁺KDR⁺(70.8±15.1 vs. 35.5±9;p= .03)， CD133⁺KDR⁺细胞(24.4±8.8 vs. 8±1.5;p= .02) (图5度)．这些差异与任何祖细胞亚型的凋亡增加无关(图5 d)．

在排除所有吸烟者的情况下，重复进行组间比较，患者的所有祖细胞亚型水平仍显著低于对照组，但CD34的差异⁺CD133⁺KDR⁺COPD患者与健康受试者之间的细胞差异无统计学意义。

Discussion

在这项工作中，我们证明了循环EPCs在严重肺部疾病引起的缺氧患者中减少。一个新出现的概念是肺内皮功能障碍是肺血管系统最早的病理改变[10，11]，因为外周血管内皮功能障碍是系统血管动脉粥样硬化的过程[30.］．术语内皮功能障碍是指一种亚临床状态，其中内皮失去其在维持血管张力、粘连和反应性方面的正常稳态作用，转变为血管收缩和血栓形成前状态。内皮细胞功能障碍，可在缺氧实验模型中诱导[31]，已在患有慢性阻塞性肺病或原发性PH [11，24］．

内皮祖细胞提供了一个循环细胞池，可恢复受损或功能失调的内皮细胞[19，20.］．目前，对EPCs的定义和鉴定方法尚无共识。流式细胞术已广泛用于此目的，并在多项研究中得到验证[27，28］．尽管通过流式细胞术获得500,000个事件被认为足以进行EPC计数[32]，考虑到外周血中阳性细胞数量较少，可能需要更大的分析。我们选择CD133、CD34和KDR三重检测作为外周血EPC计数最具选择性和限制性的标准。添加更多的标记将导致阳性细胞数量的临界减少，接近仪器的灵敏度阈值。另一方面，我们的数据表明KDR是这三种抗原中最不广泛表达的表面抗原，CD34也是⁺KDR⁺细胞和CD133⁺KDR⁺细胞可被认为是内皮祖细胞。CD34和KDR也可以识别成熟的内皮细胞，但据报道，CD146阳性的细胞(这些细胞的特异性标记物)在外周血中极其罕见(每毫升1-10个细胞)，非常小的一部分(1%-2%)表达CD34 [33］．因此，成熟内皮细胞对CD34的贡献⁺KDR⁺细胞计数可以忽略不计。

我们发现，与疾病类型(阻塞性或限制性)无关，缺氧患者的循环EPC水平低于对照组。这一结果可能反映了这些患者心血管风险的增加[34］．所评估的所有祖细胞亚型都显示出类似的减少趋势，并且在RLD患者中看到了共识性的进一步减少。值得注意的是，这些患者有更严重的肺血管改变和更大的PH发展趋势[2］．尽管患者群体有些异质，但将患者细分为RLD和COPD揭示了祖细胞与肺功能之间的关系，这与这些疾病的差异肺病理生理学是一致的。在RLD患者中，EPC下降与疾病严重程度相关，定义为肺容量减少和肺泡动脉扩散受损。Del Papa等人此前在系统性硬化症患者中报道了一氧化碳扩散与类似的相关性[35］．在我们的研究中，EPC计数也与红细胞数量、血红蛋白水平和红细胞压积值密切相关。不幸的是，我们无法确定患者的促红细胞生成素水平，但我们的数据表明促红细胞生成素代偿性增加可能会影响EPC动员[36，37］．相反，当考虑COPD患者时，EPCs与支气管梗阻和动脉氧张力指标的相关性表明，更严重的模式与更高数量的祖细胞相关，这表明缺氧对EPC动员具有有趣的代偿作用。一致地，氧疗强度，反映了缺氧的严重程度，与祖细胞计数直接相关。祖细胞与疾病严重程度相关的这种不同行为部分解释了为什么RLD患者比COPD患者表现出更严重的EPC减少。

与吸烟在慢性阻塞性肺病发病机制中所起的主要作用一致[38]，我们已经表明，在COPD患者中，吸烟者的循环三阳性EPCs水平低于非吸烟者。事实上，COPD组的EPC降低可能主要归因于吸烟患者，因为当吸烟者被排除在分析之外时，CD34的差异⁺CD133⁺KDR⁺细胞不再有意义。吸烟者祖细胞凋亡似乎增加，因为CD133⁺KDR⁺膜联蛋白V⁺细胞数量高于不吸烟者。吸烟对EPC减少的影响已经有报道，这与吸烟诱导的内皮功能障碍有关[27］．证明了EPCs的凋亡在吸烟者中增加，我们为COPD中EPCs水平的降低提供了一个合理的机制解释。令人惊讶的是，吸烟与RLD患者祖细胞增加有关。这一意想不到的结果与先前的报道一致，即吸烟可能对某些间质rld具有有利的保护作用[39］．此外，即使吸烟者和非吸烟者的疾病严重程度没有差异，尽管需要吸氧，但长期吸烟的患者可能表现出较轻的疾病模式和较慢的进展。然而，由于吸烟不影响RLD患者的祖细胞凋亡，吸烟对祖细胞以及气道重塑影响的不同易感性可能是COPD与RLD的特征。

除了骨髓动员减少和外周生存缩短外，我们不能排除患者和对照组之间年龄的微小差异也导致了祖细胞计数的差异，因为以前曾报道过年龄依赖性EPC衰竭[40］．

许多数据表明，肺外祖细胞在以PH为特征的血管病变的发展中起作用[41- - - - - -47］．一个可行的假设是，缺氧刺激EPC从骨髓动员，并定位于受损的肺血管内皮，就像组织缺血一样。从功能的角度来看，有体外数据表明，低氧张力培养的EPCs增殖和分化效率提高[48］．我们的结果与体外实验结果相反。为了解释这一明显的悖论，我们可以假设低水平的循环EPCs反映了骨髓的减少生产或动员。值得注意的是，大多数体外研究都是在从正常受试者中分离的内皮细胞上进行的，而我们已经表明，弥漫性肺部疾病患者中EPCs的凋亡率增加，这可能是疾病慢性的反映。否则，可能是骨髓的持续缺氧刺激导致前体库耗尽。我们的实验室正在进行研究，以评估这一假设。最近的数据表明，EPCs在肺损伤期间被动员，祖细胞动员不良与肺炎后持续的纤维化变化有关[49，50］．此外，骨髓抑制被发现增加对博莱霉素(Blenoxane;布里斯托尔迈尔斯施贵宝公司应承担的;普林斯顿，新泽西州)‐介导的小鼠肺损伤，而通过给予干细胞来预防[51］．因此，正如我们在严重慢性肺病患者中所证明的那样，耗尽的EPC池可能会导致疾病进展和恶化，这是很清楚的。

另外，外周血中EPC的减少可能反映了肺中祖细胞的定位。对阻塞性和限制性疾病患者的肺活检和支气管肺泡灌洗液进行的研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)是EPC动员和募集的最有效刺激之一，其水平升高或降低[52，53］．近年来，COPD患者的肺动脉中发现了越来越多的血管祖细胞[54］．为了澄清这一点，我们正在评估不同肺部疾病患者支气管肺泡灌洗中EPC和VEGF水平是否存在相关性。

Conclusion

我们的研究表明，循环EPCs在终末期慢性肺病中减少，特别是在RLD患者中，这可能表明祖细胞动员缺陷和外周生存缩短。增加EPCs的代偿尝试可能依赖于RLD中的促红细胞生成素和COPD中的缺氧。我们还报告了吸烟对EPC水平和凋亡率的不同影响，这取决于疾病模式。

PH的动物模型表明，EPC给药可预防解剖损伤并提高动物存活率[55- - - - - -57］．为了更好地理解和利用EPC在弥漫性肺部疾病和缺氧患者中的治疗潜力，对参与这些疾病临床管理的研究人员来说是一个重大挑战。

Disclosures

作者指出没有潜在的利益冲突。

References