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研究文章

Tmprss2小鼠流感H1N1病毒的发病机理至关重要

  • 巴斯蒂安·Hatesuer,

    的贡献同样处理:巴斯蒂安·Hatesuer,斯蒂芬妮·伯特伦,诺拉Mehnert

    联系部感染的遗传学、亥姆霍兹感染研究中心兽医汉诺威大学,布伦瑞克,德国,和田纳西州大学健康科学中心,孟菲斯,田纳西州,美利坚合众国

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  • 斯蒂芬妮·伯特伦,

    的贡献同样处理:巴斯蒂安·Hatesuer,斯蒂芬妮·伯特伦,诺拉Mehnert

    联系感染生物单元,德国的灵长类动物研究中心,德国哥廷根

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  • 诺拉Mehnert,

    的贡献同样处理:巴斯蒂安·Hatesuer,斯蒂芬妮·伯特伦,诺拉Mehnert

    联系部感染的遗传学、亥姆霍兹感染研究中心兽医汉诺威大学,布伦瑞克,德国,和田纳西州大学健康科学中心,孟菲斯,田纳西州,美利坚合众国

    ⨯
  • 马哈茂德·m·巴格

    联系部感染的遗传学、亥姆霍兹感染研究中心兽医汉诺威大学,布伦瑞克,德国,和田纳西州大学健康科学中心,孟菲斯,田纳西州,美利坚合众国

    ⨯
  • 彼得·s·纳尔逊

    联系人类生物学和临床研究的联赛之中,弗雷德哈钦森癌症研究中心,西雅图,华盛顿,美国

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  • Stefan Pohlman,

    SP和KS也造成同样的工作。

    联系感染生物单元,德国的灵长类动物研究中心,德国哥廷根

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  • 克劳斯Schughart

    klaus.schughart@helmholtz-hzi.de

    SP和KS也造成同样的工作。

    联系部感染的遗传学、亥姆霍兹感染研究中心兽医汉诺威大学,布伦瑞克,德国,和田纳西州大学健康科学中心,孟菲斯,田纳西州,美利坚合众国

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Tmprss2小鼠流感H1N1病毒的发病机理至关重要

  • 巴斯蒂安·Hatesuer
  • 斯蒂芬妮·伯特伦,
  • 诺拉Mehnert,
  • 马哈茂德·m·巴格
  • 彼得·s·纳尔逊
  • Stefan Pohlman
  • 克劳斯Schughart
公共科学图书馆
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修正

2014年9月10日:PLOS病原体的员工(2014)更正:Tmprss2小鼠流感H1N1病毒的发病机理至关重要。PLOS病原体10 (9):e1004435。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004435观点修正

文摘

偶尔年度流感流行和大流行对人类健康构成严重威胁。宿主细胞因子所需的病毒传播而不是对细胞的生存是有吸引力的新方法抗病毒药物干预的目标。乳沟流感病毒血凝素(HA)的激活宿主细胞蛋白酶对病毒性传染性至关重要。然而,它是未知的蛋白酶激活流感病毒在哺乳动物中。几个候选人已确定在细胞培养的研究中,流感病毒导致的概念,可以使用多个酶以确保其解理激活宿主。在这里,我们表明,单个HA-activating蛋白酶基因的删除,Tmprss2在老鼠身上,抑制mono-basic甲型H1N1流感病毒的传播,包括2009年大流行的猪流感病毒。肺癌病理强烈降低和突变小鼠有一定的减肥,死亡和肺功能的损害。mono-basic H3N2流感病毒感染后,身体减肥和生存并不严重Tmprss2突变体与野生型小鼠相比。正如所料,Tmprss2 -缺乏的老鼠不受感染后病毒传播和病理学multi-basic H7N7甲型流感病毒。总之,这些结果确定TMPRSS2作为病毒传播和宿主细胞因子基本病机mono-basic H1N1和H3N2流感病毒。

作者总结

季节性流感流行和大流行代表人类人口严重的健康威胁。抵抗目前抗病毒药物经常被观察到。因此,抗病毒治疗的新目标的识别是一个紧急的需要。需要宿主蛋白酶处理病毒的血凝素,因此可能代表一个合适的干预的目标。在这里,我们报告一个主机蛋白酶基因的删除,Tmprss2在老鼠身上,保护宿主免受病毒传播感染的肺部。非常轻微的病理观察Tmprss2突变小鼠在感染H1N1病毒后,观察那么严重发病机理H3N2病毒感染。因此,我们的研究结果表明,宿主蛋白酶TMPRSS2可能抗病毒药物干预的主要目标。

引用:Hatesuer B,伯特伦年代,Mehnert N,巴格MM,纳尔逊PS, Pohlman年代,et al。(2013) Tmprss2小鼠流感H1N1病毒的发病机理至关重要。公共科学图书馆Pathog 9 (12): e1003774。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774

编辑器:克里斯托弗·f·巴斯勒,西奈山医学院,美利坚合众国

收到:2013年7月2日;接受:2013年10月3日;发表:2013年12月5日,

版权:©2013 Hateuser et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作由Helmholtz-Association intra-mural赠款支持(程序感染和免疫)和研究资助FluResearchNet (01 ki07137)德国教育部KS和研究。百万桶已经获得一个亚历山大•冯•洪堡奖学金。SP的intra-mural赠款支持莱布尼茨基金会和德国的科研补助金教育部(SARS-Verbund 01 ki1005c)。支持PSN NIH格兰特P01CA085859。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

年度流感流行和不可预知的传染病对人类健康构成严重威胁,以估计30 - 1918年大流感造成的死亡。目前治疗目标病毒蛋白,神经氨酸酶和M2,但受到阻力的发展[1]由于病毒的变异率高。急需新型抗病毒策略和不变的宿主细胞因素必不可少的病毒传播是有吸引力的目标。

流感病毒血凝素(HA)的乳沟,宿主细胞蛋白酶对病毒性传染性至关重要[2],[3]。高致病性禽流感病毒的HA蛋白港多个基本氨基酸裂解位点和由furin激活[4]。相比之下,低致病性禽流感和人流感病毒包含mono-basic HA蛋白的裂解位点。几项研究表明,多个分泌蛋白酶可以激活人类流感病毒感染的细胞系(见[5],[6]为例子,[7]审查)。然而,培养人类呼吸道上皮细胞的分析表明,流感病毒乳沟激活是一个细胞相关的过程,没有证据表明分泌蛋白酶的作用[8]。随后,II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)家庭成员TMPRSS2膜相关蛋白酶,激活不同的人类流感病毒的HA蛋白在细胞培养[9],[10],[11],[12]。此外,TMPRSS2被发现在人类呼吸道上皮细胞阳性表达α2,6-linked唾液酸[13]。然而,TMPRSS2的角色在流感病毒感染宿主传播和发病机理尚未研究。

因此,我们调查如果TMPRSS2有助于流感病毒复制和在实验感染小鼠发病机理。我们集中分析在H1N1病毒(包括2009年大流行流感病毒)和H3N2亚型,因为这些亚型病毒是目前人口中流传。我们的研究显示,删除Tmprss2在淘汰赛老鼠强烈限制病毒的传播和甲型H1N1流感病毒感染后肺部病理。的删除Tmprss2后还会减少体重损失和死亡率H3N2感染但更低的程度比H1N1感染的老鼠。

结果

Tmprss2是必不可少的甲型H1N1流感病毒传播和发病机理的老鼠

评估期间TMPRSS2流感病毒感染的作用在活的有机体内,我们使用老鼠携带的删除Tmprss2基因[14]。未受感染的Tmprss2淘汰赛的老鼠没有显示表型在没有感染的情况下,如前所述[14]和rt - pcr分析肾脏组织缺乏完整的确认Tmprss2记录。在鼻内感染小鼠mouse-adapted PR8M (/ PuertoRico / 8/34 H1N1明斯特的一个变种,[15]),野生型小鼠体重明显感染和50%的感染小鼠死后,而Tmprss2淘汰赛的老鼠没有表现出身体减肥和没有任何疾病的迹象无花果。1;无花果S1。)。相同的结果后感染人类孤立的大流行HA4 (a /汉堡/ 4/2009 H1N1流感病毒(图1 b)。也在感染致命剂量的毒性PR8F病毒隔离(8/34 / PuertoRico / H1N1弗莱堡变体)所有的野生型老鼠死后七日内感染而没有胜过老鼠显示疾病的症状(图1 c)。类似的结果观察血氧饱和度水平提供一个测量肺功能。而野生型小鼠表现出周围血氧饱和度显著下降,在感染后的第8天达到高峰(p)与PR8M病毒,Tmprss2−−/突变小鼠显示只有很轻微的变化(图2)。

缩略图
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图1所示。 Tmprss2对于传播和甲型H1N1流感病毒的发病机理是至关重要的。

8 - 11周大雌性小鼠感染2×105洁净mouse-adapted PR8M (H1N1;),2×105的洁净HA4 (pH1N1, B), 2×103洁净mouse-adapted PR8F (H1N1;C)。体重损失监测到第14天皮。老鼠的体重超过30%的体重开始被实施安乐死,记录为死亡。减肥数据代表平均值+ /−SEM。注意,只有数据提出了老鼠的生存(如。大约50%的感染小鼠感染后死亡PR8M,明白了无花果S1。)。体重损失显著不同野生型和纯合突变小鼠在天6 p。(p < 0.0001 PR8M感染小鼠,p < 0.0001 HA4感染小鼠,用非参数曼Whitney U测试)和杂合的和纯合突变小鼠之间(PR8M感染小鼠,使用曼Whitney U检验p < 0.0001)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g001

缩略图
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图2。 Tmprss2−−/突变小鼠血氧饱和度没有表现出明显下降。

Tmprss2−−/和野生型小鼠感染2×105洁净PR8M病毒和外周血中血氧饱和度测量直到第14天皮。Tmprss2−−/老鼠只有很轻微的血氧饱和度下降,而野生型小鼠表现出明显降低,达到第八天皮。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g002

组织学分析受感染的肺部发现了类似的流感感染的发病在感染后的1天Tmprss2−−/和野生型小鼠感染细支气管上皮细胞(图3 a, B, E, F)。然而,在第三天pi病毒蔓延到野生型小鼠肺泡地区而只是发现在细支气管Tmprss2−−/老鼠(图3 c、D、G H分别)。此外,感染了野生型小鼠表现出强烈的肺部浸润和同样数量的增加而在感染细胞Tmprss2淘汰赛的老鼠更低渗透细胞,观察感染细胞(图3 K, L和O, P分别)。因此,缺乏TMPRSS2很大程度上保护动物免受病毒和病毒传播诱导发病机理。

缩略图
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图3。轻度肺部病理学和减少病毒传播中观察到Tmprss2−−/突变的老鼠。

8 - 12周大的老鼠感染intra-nasally 2×105洁净PR8M病毒。串行肺部分在第一天和第三天pi染色抗流感抗体和苏木精和苏木精和伊红(a)或(i p)。整个肺组织更密集的合并与大量的免疫细胞浸润在野生型相比,(我)Tmprss2−−/老鼠(mp)。此外,航空公司的Tmprss2+ / +老鼠被更高的中性粒细胞和巨噬细胞(我)而航空公司Tmprss2−−/老鼠表现出较低的免疫细胞的渗透数字(mp)。感染病毒的细胞在第一天pi观察主要在小鼠的肺细支气管地区(A, B, E, F)。野生型和突变小鼠显示influenza-positive细胞在第三天皮。(C、G)。然而,感染细胞的总数是较低的Tmprss2−−/与野生型小鼠相比。此外,感染细胞大多局限于细支气管的地区Tmprss2−−/而在野生型小鼠病毒也大大扩展进入肺泡地区(D, H)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g003

接下来,我们评估如果保护从发病机理是由于减少病毒的传播。感染PR8M之后,我们可以发现肺部感染性病毒颗粒在两种纯合子Tmprss2−−/和野生型小鼠。然而,传染性微粒的数量接近背景在第一天piTmprss2−−/老鼠和私家侦探在天明显下降2和3比野生型小鼠(图4)。流感特定抗体是随时可检测的血清Tmprss2淘汰赛老鼠(图S2)与PR8M和PR8F病毒感染后,示范接种病毒能够感染肺细胞,引起体液免疫反应。总之,这些结果表明,TMPRSS2是至关重要的有效的传播和流行和大流行的甲型H1N1流感病毒的发病机理在活的有机体内。

缩略图
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图4。病毒载量的肺Tmprss2−−/小鼠在感染H1N1甲型流感病毒(PR8M)。

8 - 11周大雌性小鼠感染2×105洁净的PR8M病毒。感染性病毒颗粒在肺匀浆测定。高病毒载量是感染了野生型小鼠相比,感染小鼠突变纯合子在天1、2和3 p。单个值,均值和SEM。检出限的测定是80每肺部感染性粒子蓝线所示。第一天pi n = 9Tmprss2−−/,n = 11Tmprss2+ / +私家侦探,一天2 n = 6Tmprss2−−/,n = 5Tmprss2+ / +第三天,pi n = 7Tmprss2−−/,n = 7Tmprss2+ / +。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g004

需要Tmprss2 HA乳沟在小鼠肺

接下来,我们试图获得的直接证据缺乏的HA蛋白水解乳沟Tmprss2有缺陷的老鼠。为此,broncho-alveolar灌洗(BAL)被感染的老鼠收集和HA前体蛋白的蛋白水解处理HA0进行了分析。高剂量的PR8M感染病毒后,HA1以及未经加工处理HA0蛋白质被发现感染了野生型小鼠而只在纯合子HA0蛋白被发现Tmprss2突变小鼠(图5)。这些结果说明TMPRSS2是必不可少的有效的HA乳沟激活小鼠。

缩略图
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图5。PR8M H1N1流感病毒的血凝素是不处理Tmprss2淘汰赛老鼠。

从被感染的野生型和落下帷幕Tmprss2−−/雄性小鼠在感染后第一天收获2×105洁净PR8M和病毒粒子通过蔗糖垫被离心浓缩。控制,从未受感染的野生型和落下帷幕Tmprss2−−/进行了分析。每个样本加载稀释(第一车道),并在两个稀释(二巷1∶1.33,三巷1∶2)。HA乳沟的颗粒被“(分泌物)分析西方的污点。加载控制,剥膜孵化与抗流感病毒抗体确认等量的蛋白质被加载相应稀释,稀释样品。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g005

Tmprss2缺乏的老鼠也受感染后的发病机理与H3N2病毒但程度不一样

目前,流感病毒的HA H1和H3亚型在人间传播。因此,我们调查了如果一个H3病毒也依赖的表达功能Tmprss2基因。感染后低剂量(101集中形成单位(洁净)mouse-adapted H3N2病毒(/香港/ 01/68[16]),体重损失不严重,生存是增加Tmprss2淘汰赛比野生型小鼠(图6 a, B)。感染后高剂量(2×103洁净的H3N2病毒死亡率显著降低Tmprss2−−/小鼠与野生型小鼠(图7)。然而,没有观察到显著差异在感染性粒子的数量一天1到3 p。(图7 b)。因此,TMPRSS2活动所需的处理H1N1和H3N2但是H3N2病毒可能由其他蛋白酶除了TMPRSS2裂解。

缩略图
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图6。 Tmprss2淘汰赛小鼠感染后显示减少体重损失和死亡率低剂量H3N2流感病毒感染。

8 - 11周大雌性老鼠感染了101洁净mouse-adapted H3N2流感病毒通过intra-nasal应用程序生存和体重(A)和(B)监测到第14天皮。除了被发现死老鼠,老鼠的体重超过30%的体重开始被实施安乐死,记录为死亡。纯合子的Tmprss2淘汰赛老鼠失去体重明显低于野生型(如。在第七天p = 0, 0006, p = 0, 0006年第8天,使用MWU测试)小鼠的死亡率也下降与野生型小鼠相比,尽管这种差异不显著(使用日志等级测试)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g006

缩略图
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图7。 Tmprss2淘汰赛小鼠感染后显示减少死亡率高剂量H3N2流感病毒感染。

8 - 11周大雌性小鼠感染2×103洁净mouse-adapted H3N2流感病毒由intra-nasal程序和生存(A)监测到第14天皮。除了被发现死老鼠,老鼠的体重超过30%的体重开始被实施安乐死,记录为死亡。感染性病毒颗粒测定肺匀浆(B),个人价值,提出了均值和SEM。检出限的测定是80每肺部感染性粒子蓝线所示。纯合子的Tmprss2淘汰赛的老鼠显示显著降低死亡率比野生型和杂合子小鼠(p < 0.0001和p = 0.0032,分别使用日志等级测试)。病毒载量在感染没有明显不同野生型小鼠相比,感染小鼠突变纯合子天1到3 p。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g007

Tmprss2不需要传播和病毒的发病机理multi-basic裂解位点

在细胞培养中,TMPRSS2可有可无的乳沟激活的病毒multi-basic裂解位点[10]。因此,如果阻力Tmprss2淘汰赛H1N1感染的老鼠确实是由于缺乏HA加工、病毒与multi-basic裂解位点应该有效地传播并引起疾病。研究这个问题,我们被感染的老鼠SC35M (mouse-adapted马萨诸塞州/密封/ / 1/80,H7N7)流感病毒包含multi-basic HA裂解位点。在感染的死亡率和体重损失Tmprss2−−/小鼠和野生型相比没有显著差异Tmprss2+ /−受感染的老鼠(图8),这表明存在multi-basic裂解位点呈现病毒传播和发病机理TMPRSS2独立的表达式。

缩略图
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图8。鼠不需要Tmprss2 H7N7甲型流感病毒的传播。

8 - 11周大雌性小鼠感染2×104洁净mouse-adapted SC35M intra-nasal应用程序(H7N7)流感病毒的生存和体重(A)和(B)监测到第14天皮。除了被发现死老鼠,老鼠的体重超过30%的体重开始被实施安乐死,记录为死亡。没有观察到显著差异在生存与杂合的纯合突变小鼠H7N7感染(使用日志等级测试)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g008

Cleavage-activation不同流感病毒的小鼠Tmprss2体外

最后,我们研究了小鼠Tmprss2是否能够激活的H1N1和H3N2病毒HA蛋白。蛋白酶和各自的HA蛋白的co-expression PR8M, HA4和H3N2病毒转染细胞促进所有病毒的HA劈理(图S3A)。此外,表达TMPRSS2的细胞培养系统允许PR8M和HA4病毒的传播在trypsin-independent时尚(图S3B)。相比之下,传播mouse-adapted SC35M病毒,包含multi-basic裂解位点不取决于TMPRSS2表达式[10]。因此,小鼠Tmprss2,喜欢它的人类同系物[11],[17]可以激活公顷。

讨论

流感病毒HA的乳沟激活宿主细胞蛋白酶对病毒性传染性至关重要[2],[3]。然而,蛋白酶的性质所需的乳沟mono-basic公顷裂解位点的激活的病毒感染宿主机体仍不清楚。至少八个候选人来自不同蛋白酶酶家庭已经提出基于细胞培养研究[18]的概念,导致多余的蛋白水解酶激活流感病毒在宿主体内。这里,我们首次展示的删除一个蛋白酶,TMPRSS2,老鼠很大程度上废除病毒传播和保护动物甲型H1N1流感严重病理和死亡后,在一个较低的程度上,H3N2流感病毒感染。

在感染后的Tmprss2−−/小鼠H1N1病毒,没有处理的HA前体蛋白HA0落下帷幕。然而,最初增加病毒滴度测定从第一天到第二天pi而在稍后时间pi病毒滴度迅速下降。这个最初的病毒滴度的增加预计因为使用的病毒感染鸡胚生产的鸡蛋。因此有一个激活HA允许它进入细胞和复制[19],[20]。此外,可想而知,其他蛋白酶除了TMPRSS2可能促进低水平的H1乳沟,让有限的病毒传播,迅速清除一旦抗病毒免疫反应被激活。然而,乳沟激活等替代酶必须很低效,因为H1N1感染的病毒滴度Tmprss2−−/老鼠明显减少与野生型相比,动物和没有观察到减肥。

令人惊讶的是,H3N2病毒也带有mono-basic裂解位点的哈,可以复制Tmprss2−−/老鼠。然而,身体减肥和死亡率显著降低小鼠与野生型相比,老鼠剂量依赖性的方式。另一方面,病毒载量在突变小鼠没有明显降低感染2×103洁净。的氨基酸序列哈循环由蛋白酶识别不同哈亚型H1和H3 (图9)。最近的一项研究表明,不同的蛋白酶,包括TMPRSS2 TMPRSS11d(帽子)甚至胰蛋白酶,打通公顷不同亚型变异和不同的效率[21]。此外,ST14 (matriptase)有能力坚持HA的H1亚型毒株,但只对H2和H3观察最少的乳沟[22]。此外,KLK5和12(激肽释放酶related-peptidase 5和12)已经被描述为宿主蛋白酶能够劈理的激活的病毒H1, H2, H3公顷在体外[23]。因此,H3N2似乎被TMPRSS2加工在某种程度上,导致减少病理Tmprss2淘汰赛老鼠还其他蛋白酶能够打通H3血凝素在活的有机体内。最后,值得注意的是Tmprss2−−/突变小鼠没有受感染的H7N7病毒包含multi-basic HA裂解位点,可以被广泛表达蛋白酶激活[4]。

缩略图
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图9。对齐蛋白酶的氨基酸序列循环从H1N1和H3N2流感病毒。

病理学是强烈减少Tmprss2−−/小鼠在感染H1N1病毒后,减少感染H3N2病毒。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.g009

我们的发现可能有潜在的未来的流感病毒疗法的发展。广谱蛋白酶抑制剂可以抑制流感病毒在细胞培养在活的有机体内[24],[25],[26],[27],[28]但是不必要的副作用是一个需要关注的问题。研究结果表明,针对一个蛋白酶,TMPRSS2,可能足以实现显著的疗效对甲型H1N1流感病毒和其他亚型。阻塞TMPRSS2不得与严重的意外副作用,因为Tmprss2−−/老鼠很健康,没有表现出任何表型改变没有感染[14]。此外,TMPRSS2抑制剂可能发挥活动针对不同的呼吸道感染。例如,人类metapneumovirus[29],新兴MERS-coronavirus[30],[31]和发热[32],[33],[34]也可以激活TMPRSS2在细胞培养和可能使用这个蛋白酶来支持他们的传播感染的宿主。然而,应该注意到,我们的发现在小鼠模型系统需要验证。

材料和方法

道德声明

所有实验老鼠通过外部委员会根据国家指导方针的动物福利法律在德国(“Tierschutzgesetz der Fassung der Bekanntmachung 18日生效。麦2006 (BGBl。我美国1206年,1313年),das zuletzt军队Artikel 20 des Gesetzes 9日生效。Dezember 2010 (BGBl。我美国1934)geandert沃顿是。”)。这些实验中使用的协议已经由伦理委员会审查和批准的“Niedersachsisches Landesamt Verbraucherschutz Lebensmittelsicherheit,和德国奥尔登堡,德国”(许可证号码:33.9.42502-04-051/09)。

病毒,老鼠和质粒

原始股票的病毒从斯特凡•路德维希,明斯特大学(PR8M PuertoRico / 8/34 H1N1,明斯特变种),从彼得Staheli,弗莱堡大学(PR8F PuertoRico / 8/34 H1N1,弗莱堡变体和SC35M[35]),从奥托•哈勒弗莱堡大学(H3N2,[16])和托尔斯滕沃尔夫,罗伯特•科赫研究所报告称,柏林(HA4)。不同毒力的PR8M PR8F病毒隔离被描述[15]。SC35M (H7N7)最初源自于密封,适应鼠标鼠标串行通道的肺[35],这里使用的实验室菌株产生的反向遗传学用质粒救援体系[36]。感染病毒的股票PR8准备的10天大的鸡胚蛋和HA4 MDCK细胞的描述[37]。突变体Tmprss2−−/老鼠在一个混合C57BL / 6 j - 129背景[14]。动物是维持在特定病原体自由条件下的动物设施HZI在布伦瑞克。杂合的变异老鼠杂交和野生型、杂合的和纯合突变小鼠基因PCR分析,然后用于感染。基因分型的Tmprss2等位基因进行了使用三个入门策略(P15′TGTGCCCTTGGACAGATGACTC3′,P25′GGACTACAGATATGAGGTGTTC3′,P35′AGGCCAGAGGCCACTTGTGTAG3′),允许区分野生型(产生540个基点的产品)和淘汰赛(收益率产品400个基点)等位基因,分别。表达质粒编码人类和小鼠蛋白酶TMPRSS2早些时候发表的[10],[13]。PR8M前所述表达质粒[38]被用作模板放大本编码区域使用的寡核苷酸PR8-HA-5Acc:GGGGGTACCACCATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGPR8-HA-3Nhe:GGGCGCTAGCTCAGATGCATATTCTGCACTG。结果PCR产品插入质粒pCAGGS使用Acc65I和新人道我的网站。HA4 HA蛋白的克隆,表达质粒请由·可兰克教授提供[39]作为模板的扩增编码区利用寡核苷酸swi09-HA-5Eco:GGGAATTCACCATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGC和swi09-HA-3Xho:GGGCTCGAGTTAAATACATATTCTACACTGTAGAG。结果PCR产品插入质粒pCAGGS使用EcoRI和XhoI。

感染的老鼠和测量体重损失和生存

感染实验,雌性老鼠8 - 11岁的周被intra-peritoneal麻醉注射Ketamin-Xylazine解决方案在无菌生理盐水(50毫克/毫升氯胺酮,Invesa Arzneimittel GmbH,弗莱堡;2%甲苯噻嗪、拜耳医疗,勒沃库森)与个人剂量调整后体重。病毒感染是由鼻内的应用解决方案在20µl无菌磷酸盐。随后生存和身体体重监控到第14天皮。除了被发现死老鼠,老鼠的体重超过30%的体重开始被实施安乐死,记录为死亡。

确定感染性病毒颗粒

在确定肺部感染病毒载量MDCK II (Madin-Darby犬肾脏II)细胞使用描述的洁净工程试验[15]。检出限的测定是在80感染性粒子/肺。没有检测到病毒,因此,对于样本数据点被设置为80洁净/肺。

分析处理感染肺部的哈

分析病毒的HA粒子,Broncho-alveolar灌洗(巴尔斯)的野生型Tmprss2小鼠感染2×105洁净PR8M在第一天皮收获。,centrifuged at full speed and supernatant were loaded on a 20% sucrose cushion for concentration of viral particles for 2–3 h at full speed and 4°C. The pelleted viral particles were lysed in 2×SDS loading buffer. For immuno-blotting, the lysates were separated by SDS gel electrophoresis, blotted on a nitrocellulose membrane and HA was detected by staining with a rabbit anti-PR8HA antibody (Sino biological) at a dilution of 1∶500, followed by incubation with a horseradish peroxidase (HRP)-coupled anti-rabbit antibody (Dianova) at a dilution of 1∶10.000. As loading control, membranes were stripped (Stripping Buffer: 1M Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 100 mM ß-Mercaptoethanol) for 30 min at 50°C, washed 1 h with dH2O和彩色NA通过使用一个抗流感病毒山羊血清(微孔)的稀释1∶500紧随其后孵化辣根过氧化物酶(合)耦合的抗体抗体(Dianova)的稀释1∶10.000。乐队被使用商用可视化工具包ECL '免疫印迹检测试剂(Amersham)。

Pulsoxymetric测定血氧饱和度

8 - 12周大的老鼠感染鼻内和2×105洁净PR8M和氧饱和度的数量取决于MouseOx®系统(斯塔尔生命科学公司)在一段时间内的14天。对氧测量小鼠麻醉使用异氟烷吸入器。

组织学和免疫组织化学分析

肺是准备和immersion-fixed 24小时4%缓冲甲醛溶液pH值(7.4),脱水在一系列的分级乙醇和嵌入石蜡。部分(0.5µm)被削减从五个均匀分布的石蜡块和与苏木精和伊红染色。免疫组织化学研究,部分染色主要多克隆抗体(抗甲型流感H1N1病毒粒子;Virostat)一夜之间在4°C和随后组织部分孵化为30分钟二次抗体(兔子anti-goat-biotin;KPL;盖瑟斯堡,麦迪逊,美国),用苏木精复染色。

流感病毒裂解TMPRSS2激活的细胞培养

293 t细胞是暂时性的转染和表达质粒编码人类或鼠标TMPRSS2或控制与空质粒转染。在24 h后转染,细胞被感染的流感病毒PR8M, HA4或SC35M感染复数(MOI) 1。在37°C 1 h孵化后,病毒被删除和新鲜MEM培养基(补充0.2% BSA和1µg /毫升TPCK-trypsin或PBS)被添加到细胞中。在48 h p。,supernatants were harvested, cleared from debris by centrifugation for 5 min at 3.500 rpm and stored at −80°C until quantification of infectious virus particles by focus formation assay (FFU) as described previously[15]。

支持信息

图S1。

Tmprss2对甲型H1N1流感病毒的发病机理至关重要。8 - 11周大雌性小鼠感染2×105洁净mouse-adapted PR8M (H1N1)。生存是监控到第14天皮。除了被发现死老鼠,老鼠的体重超过30%的体重开始被实施安乐死,记录为死亡。所有Tmprss2小鼠在感染而约50%的野生型或Tmprss2杂合的老鼠死了。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.s001

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图S2。

幸存的Tmprss2−−/老鼠山抗体病毒蛋白在感染H1N1流感病毒。从幸存的小鼠感染后,血液由心脏穿刺收集。血清稀释1∶1000和一个使用盘子ELISA进行涂以1.6×105洁净PR8M病毒。检测病毒特异性免疫球蛋白,peroxidase-labeled anti-mouse免疫球蛋白(KPL盖瑟斯堡,麦迪逊,美国)被用作二次反应的抗体和可视化进行了使用过氧化物酶特定的底物。吸光度在490海里。控制,未受感染的小鼠的血清进行了分析。血清从幸存的野生型和纯合子Tmprss2突变小鼠感染PR8M (A)或PR8F (B)分析了14天后感染流感特定的抗体免疫球蛋白。个人价值观,提出了均值和SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.s002

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图S3。

小鼠Tmprss2激活不同的H1N1流感病毒血凝素的乳沟。表明HA蛋白(PR8M HA4和H3N2)和蛋白酶(人类或鼠标TMPRSS2)在293年瞬变中的t细胞,细胞治疗与PBS或胰蛋白酶,HA乳沟被免疫印迹检测(A)。蛋白酶转染293 t细胞被感染了病毒在感染复数表示1胰蛋白酶的存在与否。在48 h p。,viral spread was quantified by focus formation assay (B). Virus release into the medium is presented as means ± SD and was confirmed in at least two independent experiments.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003774.s003

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确认

我们要感谢动物看护人在中央动物设施维护HZI的老鼠在这项研究中,卡琳拉默特,卢卡斯Gusdek和贾里德·卢卡斯优秀的技术援助,迈克尔·温克勒HA4和PR8F HA表达质粒,彼得Staheli,斯特凡•路德维希和托尔斯滕沃尔夫提供原始股票的A型流感病毒。

作者的贡献

构思和设计实验:SP KS PSN黑洞。进行实验:BH NM某人分析数据:SP KS NM某人黑洞。造成试剂/材料/分析工具:PSN。该报写道:SP KS。建立的ELISA检测抗流感免疫球蛋白:百万桶。

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