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研究文章

Macrophage-expressed IFN-β导致凋亡肺泡上皮细胞损伤严重的流感病毒肺炎

Macrophage-expressed IFN-β导致凋亡肺泡上皮细胞损伤严重的流感病毒肺炎

  • 凯特琳Hogner,
  • 托尔斯滕沃尔夫,
  • Stephan Pleschka,
  • 斯蒂芬妮·帕洛格,
  • 阿齐姆·d·格鲁伯,
  • 乌尔里希Kalinke,
  • Hans-Dieter Walmrath,
  • 约翰内斯。博得纳,
  • Stefan Gattenlohner
  • 彼得Lewe-Schlosser
公共科学图书馆
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修正

2016年6月15日:Hogner K,沃尔夫T, Pleschka年代,帕洛格,格鲁伯广告,et al . (2016)更正:Macrophage-expressed IFN-β导致凋亡肺泡上皮细胞损伤严重的流感病毒肺炎。PLOS病原体12 (6):e1005716。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005716观点修正

文摘

流感病毒(IV)引起肺炎与发展人类肺衰竭和致命的结果。提供释放的细胞因子,包括I型干扰素(ifn)被认为至关重要的作用在严重的静脉感染免疫介导的肺损伤。使用体外和在活的有机体内静脉感染模型,我们表明,肺泡巨噬细胞(AM)表示IFN-β大大有助于IV-induced肺泡上皮细胞自分泌感应(AEC)损伤的pro-apoptotic因素TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL)。值得注意的是,小道高度调节和释放我的H1N1大流行性流感患者IV-induced急性肺损伤。阐明的特异性信号通路显示静脉感染诱导IFN-β释放在我的蛋白激酶R - (PKR)和NF-κB-dependent方式。骨髓嵌合小鼠缺乏这些信号介质在居民和lung-recruited我和老鼠受到肺泡中和IFN-β和轨迹显示肺泡上皮细胞凋亡减少,减毒在第四严重肺炎肺损伤。在一起,我们证明macrophage-released I型干扰素,除了著名的抗病毒性能,有助于IV-induced原子能委员会自分泌诱导损伤和肺损伤的痕迹pro-apoptotic因素。我们的数据表明,巨噬细胞的治疗目标IFN-β-TRAIL轴可能代表一个有前途的战略减弱IV-induced急性肺损伤。

作者总结

流感病毒引起的急性肺损伤(IV)感染与不平衡释放促炎细胞因子包括I型干扰素(IFN)导致免疫介导的器官损伤。使用体外和在活的有机体内静脉感染模型,我们表明,肺泡macrophage-expressed IFN-β诱导肺泡上皮细胞自分泌伤诱导的pro-apoptotic TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL)。阐明的特异性信号通路显示IV-induced IFN-β释放肺泡巨噬细胞(AM)严格依赖蛋白激酶R - (PKR)和NF-κB-signalling。通过巨噬细胞自分泌激活I型干扰素受体(IFNAR)导致增加TRAIL的表达和释放导致IV-infected和非受感染的肺泡上皮细胞的凋亡,促进肺泡屏障功能障碍中演示体外培养和骨髓嵌合小鼠模型在活的有机体内。重要的是,我们发现高度调节和释放流行H1N1-induced住院患者的肺衰竭。巨噬细胞的治疗目标IFN-β-TRAIL轴可能因此代表一个有前途的战略,以减弱IV-induced急性肺损伤。

引用:Hogner K,沃尔夫T, Pleschka年代,帕洛格,格鲁伯广告,Kalinke U, et al。(2013) Macrophage-expressed IFN-β导致凋亡肺泡上皮细胞损伤严重的流感病毒肺炎。公共科学图书馆Pathog 9 (2): e1003188。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188

编辑器:克里斯托弗·f·巴斯勒,西奈山医学院,美利坚合众国

收到:2012年4月13日;接受:2012年12月27日;发表:2013年2月28日

版权:©2013 Hogner et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是支持的德国研究基金会(SFB / TR84“肺的先天免疫”格兰特B2,格兰特LO271/4-1,卓越和集群心肺系统[ECCPS]),德国联邦部门的研究和教育(“FluResearchNet”拨款1006 01 KI和01 KI 1006 c和临床研究小组“传染病”格兰特01 KI 0770)和冯Behring-Rontgen吉森&马尔堡大学的的基础。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

流感病毒(IV)可引起原发性病毒性肺炎与迅速发展人类肺衰竭和致命的结果[1]。IV-induced肺损伤的病理和临床特点人类与其他形式的ARDS(急性呼吸窘迫综合征),以凋亡和坏死为特征的肺泡上皮细胞(AEC)破坏,肺泡屏障功能的受损和严重的低氧血症[1]- - - - - -[3]。肺内的表达pro-apoptotic Fas等配体配位体(FasL)或小道最近被赋予一个关键的角色在诱导上皮损伤发展为ARDS[4]- - - - - -[6]。一旦感染蔓延从上到下呼吸道,原子能委员会和居民成为静脉感染的主要目标[3],[7],[8]。第四严重肺炎的特点是夸张肺泡炎症介质的表达和dysbalance支持和抗炎细胞因子导致的肺损伤,我一直认为一个重要的作用[9]- - - - - -[11]。然而,的关键球员和分子机制诱导过程中细胞相声第四上皮损伤严重肺炎和炎症介质参与定义仍然不佳。这些通路的治疗调制提供了发挥的潜在优势转学至病毒人群的压力比建立抗病毒药物,详细了解的特异性炎症反应和随后诱导途径中上皮损伤静脉感染是特别重要的。

I型干扰素迅速表达各种骨髓和实质细胞病毒感染后的肺[12],[13]。他们与一个独特的heterodimeric IFN-α受体(IFNAR)以自分泌或旁分泌的方式诱导不同干扰素刺激基因的转录,如双链(ds)依赖rna的蛋白激酶R (PKR)通过Jak / STAT通路限制病毒传播[14],[15]。此外,I型干扰素信号最近被赋予一个角色功能分化的骨髓细胞子集在静脉感染,包括单核细胞、CD8+T细胞,中性粒细胞和树突细胞[16]- - - - - -[18]。除了这些众所周知的抗病毒效果,证据也暗示了在病毒感染致病I型干扰素的角色。大量的促炎细胞因子和趋化因子的诱导下游IFNAR第四信号可能导致发病,发病和疾病的关联直接与当地呼吸道IFN-α在人类的生产[19]。因此,I型干扰素可能在病毒间隙和tissue-damaging炎症扮演双重角色。

在目前的研究中我们阐明先前定义的角色AM-expressed IFN-β在诱导凋亡原子能委员会表达和释放pro-apoptotic因素的的影响体外和在活的有机体内静脉感染。详细研究信号通路参与这种细胞的相声显示巨噬细胞IFN-β被释放在静脉感染PKR和NF-κB-dependent和诱导自分泌方式,IFNAR-dependent感应的线索。Macrophage-specific封锁这些信号的步骤的任何废除轨迹表达式在居民和lung-recruited,原子能委员会凋亡减少,减毒IV-induced肺损伤。这些发现强调I型干扰素IV-induced发病机制中的关键球员和炎症的机制提供新的视角macrophage-epithelial相声在IV-induced与潜在治疗肺损伤的影响。

结果

IV-induced macrophage-derived IFN-β促进原子能委员会细胞凋亡体外和在活的有机体内

评估I型干扰素的作用IV-induced原子能委员会损伤和肺损伤,我们第一次量化I型干扰素水平支气管肺泡灌洗液(BALF)期间的/ PR8感染野生型小鼠(wt)。所示图1一个(左),IFN-α和-β都释放到空气空间响应/ PR8感染。提供相应/ PR8 BALF中浓度(图1一个,对吧)。测试是否内生I型干扰素导致的严重肺损伤观察IV-infected老鼠我们分析原子能委员会损伤肺泡后沉积的中和anti-IFN抗体(Ab)。证明了在图1 b,原子能委员会细胞凋亡显著降低类似水平当IFN-α或IFN-β或被封锁在d5π。反过来,肺泡损伤在重组IFN-βd7π进一步增加应用的航空公司/ PR8-infected老鼠d5π,如图所示图1 c(左;原子能委员会凋亡量化AnnexinV绑定原子能委员会;肺泡蛋白质泄漏)。值得注意的是,肺病毒载量在d7π保持不变无论内生IFN-β受阻或重组IFN-β应用气管内的d5π(数据未显示)。良好,原子能委员会第四初级目标,不同菌株在肺的肺泡间隔[20]。确定IV-induced肺泡IFN-β的主要来源,我们接下来主要感染小鼠原子能委员会和我体外/ PR8和量化IFN-β峰值水平浮在表面的文化。值得注意的是,原子能委员会和我都感染/ PR8不同的月体外由immunolabelling病毒核蛋白(图S1A)。原子能委员会相比,A / PR8感染我发现失败我们不能检测到传染性病毒粒子的上层清液的文化。证明了在图1 d,不过鼠是发布在24 h IFN-β水平要明显高于在应对感染小鼠原子能委员会生活,但不是heat-inactivated / PR8,这是同样的发现当我们相比人类是和原子能委员会(图印地)。IFN-β表达发生在体外IV-infected小鼠以剂量- IV strain-dependent方式(图1 e,S2A),同样在人类是(图开通)。进一步分析巨噬细胞的机制IFN-β原子能委员会细胞凋亡增加,我们用IFN-β治疗未受感染的原子能委员会体外和原子能委员会决定细胞凋亡诱导。有趣的是,重组IFN-β没有增加凋亡损伤感染mono-cultured AEC,然而,原子能委员会凋亡高度增加在IFN-β治疗当原子能委员会被我培养(图1 f)。在一起,这些数据表明,巨噬细胞IFN-β诱发凋亡原子能委员会损伤静脉感染,建议第二,IFN-β-inducible pro-apoptotic巨噬细胞中介参与。

缩略图
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图1所示。IV-induced IFN-β主要macrophage-derived和细胞凋亡原子能委员会体外和在活的有机体内。

(A) C57BL / 6 wt小鼠感染了500微升/ PR8和IFN-αIFN-β水平面板(左)以及感染性病毒颗粒的数量(右面板)是从BALF量化表示时间点。原子能委员会(B)细胞凋亡在模拟量化或后在d7π/ PR8感染小鼠气管内的免疫球蛋白治疗同形像Ab,反IFN-αAb, anti-IFN-βAb或两者(d5π)。原子能委员会(C)细胞凋亡(左面板)和肺泡蛋白质泄漏(右面板)测定在气管内的治疗后d7πrIFN-β或车辆(d5π)。(D)小鼠原子能委员会还是模拟——或/ PR8-infected(活病毒或heat-inactivated)体外(MOI = 0.1)和IFN-β释放量化在上层清液在24 hπ。(E)鼠点体外感染住或heat-inactivated / PR8表示莫伊和IFN-βmRNA表达量化在给定的时间和被描绘成褶皱mock-infected控制的感应。(F)感染小鼠原子能委员会mono -或未受感染的培养体外的存在与否IFN-β(180 U /毫升)24 h,原子能委员会和细胞凋亡率量化。(G)小鼠体外感染住或heat-inactivated / PR8给定莫伊和小道mRNA表达量化,被描绘成褶皱mock-infected控制的感应。(H)小鼠原子能委员会还是体外感染A / PR8表示莫伊和小道mRNA表达量化在给定的时间和被描绘成褶皱mock-infected控制的感应。酒吧图表代表意味着±SD (A) 4动物/集团(B, C) 5动物/组或4 (D, E, G)和3 (F、H)独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;ctrl,控制;mAEC小鼠肺泡上皮细胞;嗨,热灭活;Ab抗体,老妈,小鼠;莫伊,感染复数; pi, post infection; n.s., not significant; iso, isotype; rIFN-β, recombinant IFN-β.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g001

巨噬细胞IFN-βpro-apoptotic因素的诱发表达TRAIL在静脉感染肺泡巨噬细胞

原子能委员会几个pro-apoptotic因素已知诱导细胞凋亡在pathogen-related急性肺损伤,其中小道和FasL参与报道[4],[5],[21]。因此,我们决定是否或FasL调节在小鼠身上体外/ PR8感染。而FasL基因和蛋白质表达诱导较低(S3无花果。),小道mRNA高度调节剂量和时间的方式/ PR8感染后,与峰值跟踪表达发现16 hπ的莫伊1 (图1克)。此外,信使rna后被诱导体外第四感染不同菌株在小鼠(图S2C),同样的,人类是(图S2D)。重要的是,增加在肺泡巨噬细胞的H1N1大流行性流感(pH1N1)住院患者的全身ARDS相比病毒性ARDS患者或健康控制个人,信使rna和表面表达水平(图2 a, B)。此外,可溶性TRAIL (sTRAIL)水平明显高于pH1N1-ARDS BALF的病人相比,患有细菌性肺炎(图2 c),显示激活的小道感应途径特定病毒感染。值得注意的是,原子能委员会没有增加TRAIL基因表达在回答/ PR8感染水平观察到小鼠是(图1 h和无花果。S4)。

缩略图
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图2。小道pro-apoptotic因素是调节第四严重肺炎患者的肺泡巨噬细胞。

是被隔绝的患者BALF pH1N1-induced ARDS或病毒性(即细菌性肺炎或sepsis-associated) ARDS和小道mRNA (A)和mTRAIL表达式(B)被存在量化和流式细胞仪,分别比是控制病人的支气管镜检查由于诊断原因但显示正常细胞数和微分项(“健康”控制)。C描述sTRAIL水平的患者BALF pH1N1-induced ARDS或细菌性肺炎(BP)确认。图表显示意味着±SD。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;n。,not significant; mTRAIL, membrane bound TRAIL; sTRAIL, soluble TRAIL.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g002

鉴于发现峰轨迹表达式恰逢峰IFN-β表达式在小鼠是16 hπ(图1 e, G第四),追踪和IFN-β显示类似的毒株特异性诱导模式在小鼠和人类是(无花果S2。),我们推测,巨噬细胞自分泌IFN-β-induced表达依赖于信号。事实上,当我们与重组IFN-β刺激未受感染的小鼠是,我们发现,小道mRNA的增加存在剂量依赖的相关性(图3)和显著增强细胞表面TRAIL表达后24 h IFN-β刺激,这是与A / PR8-induced表达式(图3 b)。最后,封锁IFN-β-induced信号通过I型干扰素受体(IFNAR)近废除/ PR8-induced mRNA upregulation在我不管我,作为演示了通过添加中和anti-IFN-βAb培养基,利用ifnar−−/点,或应用程序的抑制剂IFNAR下游介质、木菠萝、统计(图3 c)。总的来说,这些数据表明macrophage-released IFN-β小道pro-apoptotic因素的诱导表达我在静脉感染以自分泌的方式。

缩略图
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图3。IV-induced巨噬细胞IFN-β上调巨噬细胞。

(一)小鼠治疗体外rIFN-β在给定的浓度和小道mRNA表达量化和如果被描绘成褶皱感应控制。(B)小鼠我是/ PR8-infected (MOI = 0.1)或180 U /毫升rIFN-β对待体外蛋白酶抑制剂存在的鸡尾酒,防止脱落和mTRAIL丰富后,流式细胞仪分析显示24 h。直方图代表实验(上面板)或平均荧光强度(MFI,下半部分)。(C)小鼠wt我/ PR8感染在给定的莫伊和对待anti-IFN-βAb, Jak / STAT抑制剂,或DMSO /同形像免疫球蛋白Ab作为控制。小鼠ifnar−−/我是一个/ PR8感染和不及时治疗。小道mRNA表达量化,被描绘成褶皱mock-infected细胞的诱导。酒吧图表表示意味着±SD (A) 6;4 (B)和(C) 5个独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;莫伊,感染复数;免疫球蛋白、免疫球蛋白同形像控制;rIFN-βIFN-β重组; mTRAIL, membrane bound TRAIL; Ab, antibody.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g003

IV-induced IFN-β释放和随后的轨迹表达式依赖PKR和NF-κB肺泡巨噬细胞的活化

一些模式识别受体和下游信号事件以前是参与IV-infected I型干扰素诱导上皮细胞[22],[23]。然而,静脉识别的特异性机制和后续IFN-β释放主要是定义要少得多。鉴于我们之前的结果蛋白激酶R (PKR)作为重要的炎症信号传感器NF-κB-mediated转录活动主要肺泡老鼠巨噬细胞[24]我们质疑IV-induced I型干扰素反应同样取决于PKR,直接与病毒RNA在IV-infected上皮细胞[25]。的确,体外/ PR8感染的小鼠是导致PKR的磷酸化,在2 - 4 hπ(最突出的图4)。此外,p65 NF-κB亚基在4 - 8 h大大激活π在回答/ wt但不是PR8感染pkr−−/点(图4 b)。值得注意的是,infection-triggered激活或表达的转录因子IRF3 IRF7,分别被诱导IV-dependent I型干扰素在上皮细胞的反应[23],[26]没有差别,/ PR8-infected wtpkr−−/点(图4摄氏度)。测试是否IV-induced I型干扰素反应取决于PKR-NF-κB轴,我们量化IFN-β释放/ PR8-infected wt vs。pkr−−/我还是在wt NF-κB后抑制。所示图4 dPKR-deficiency和治疗选择性IκB激酶(IKK)磷酸化抑制剂废除IFN-β释放/ PR8-infected点,表明IV-induced巨噬细胞IFN-β表达式需要通过PKR和NF-κB信号转导。最后,为了解决这一信号通路的重要性IV-induced TRAIL表达,我们wt或刺激pkr−−/与重组IFN-β或感染他们/ PR8 IKK抑制剂的存在与否有或没有中和anti-IFN-βAb。正如所料,TRAIL基因表达显著诱导IFN-βwt和刺激pkr−−/是,不管NF-κB抑制(图4 e,留下灰色的图表)。然而,当我是/ PR8-infected TRAIL基因诱导取决于NF-κB PKR和激活。除了NF-κB抑制巨噬细胞IFN-β封锁并没有进一步减少轨迹表达式显著(图4 e,对黑图)。总之,这些数据表明IV-infection PKR-NF-κB-dependent是诱发的自分泌IFN-β信号循环导致的表达在IV-infected pro-apoptotic配体痕迹。

缩略图
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图4。IV-induced IFN-β释放和随后的轨迹表达式依赖PKR和NF-κB肺泡巨噬细胞的活化。

(一)小鼠是A / PR8感染体外和表达的磷酸化PKR (p-PKR)和总PKR评估免疫印迹。Wt或pkr−/−我是一个/ PR8-infected吗体外和NF-κB p65激活被TransAM比较分析化验(量化p65绑定consensus-binding站点益生元比色法)和描绘成褶皱激活mock-infected控制(B)或磷酸化IRF-3与总IRF-3蛋白质表达或总IRF-7表达免疫印迹在给定的时间点测定π和微数据被描述为相对表达式(C), (D) Wt vs。pkr−/−我或IKK抑制剂——与DMSO-treated wt我是/ PR8-infected吗体外和IFN-β浓度在上层清液进行分析24 hπ。Wt或(E)pkr−/−我与180 U / PR8-infected或刺激/毫升rIFN-β,分别,而且对待IKK抑制剂和DMSO溶液或anti-IFN-β和同形像Ab和小道mRNA表达量化16 hπ。免疫印迹(A)展示了一个代表三个独立的实验。酒吧图表代表意味着±SD 3 (B, C)或4 (D, E)独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.005;ctrl,控制;iso,同形像;π,后感染;Ab抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g004

TRAIL受体DR5在原子能委员会在调节静脉感染IFN-β-independent地

另外确定IV-induced AM-expressed IFN-β可能促进TRAIL-induced信号受体水平,我们下一个量化原子能委员会TRAIL受体(DR5,死亡受体5)表达mono-cultured原子能委员会。所示图5,DR5 MOI-dependently调节小鼠和人类原子能委员会体外/ PR8感染基因表达水平(图5)。值得注意的是,一个/ PR8-infected(四核蛋白质+,NP+)原子能委员会显示显著增加表面DR5表达到健康人相比(NP−在相同的文化()原子能委员会图5 b)。有趣的是,原子能委员会的刺激与DR5 IFN-β不影响基因表达(图5度),和表面DR5表达原子能委员会和wt之间没有什么差别ifnar−−/小鼠体内(图5 d),这表明巨噬细胞IFN-β诱导靶细胞凋亡,而通过增加巨噬细胞死亡受体配体比影响DR5的表达水平在原子能委员会。尽管如此,IV-infection糖分会让原子能委员会通过IFN-β-independent TRAIL-mediated杀死DR5 upregulation。

缩略图
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图5。DR5在原子能委员会在调节静脉感染IFN-β-independent方式。

(A)主要鼠或人工模拟-或/ PR8-infected原子能委员会体外和DR5 mRNA表达量化48 hπ。(B)小鼠模拟-或/ PR8-infected原子能委员会体外在感染和表面DR5丰富(NP+)与健康人(NP−)原子能委员会从相同的文化被流式细胞仪分析48 hπ(代表左面板中提供的直方图)和被描绘成褶皱MFI(平均荧光强度)mock-infected文化(右面板)。(C)小鼠原子能委员会与rIFN-β刺激或vehicle-treated (ctrl)和DR5 mRNA表达量化后6 h和12 h和被描述为ΔCT值。(D)表面DR5表达的原子能委员会/ PR8-infected wtifnar−−/老鼠被流式细胞仪分析。酒吧图表代表意味着±SD 4 (A)和5 (B, C)独立的实验。酒吧图表在D代表动物意味着±SD /组。* p < 0, 05年;* * p < 0, 01;* * * p < 0001;莫伊,感染复数;hAEC,人类原子能委员会;mAEC小鼠原子能委员会;NP,核蛋白质; iso, isotype Ab; rIFN-β, recombinant IFN-β.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g005

IV-infected肺泡巨噬细胞促进细胞凋亡在未受感染和IV-infected原子能委员会在PKR和I型干扰素依赖sTRAIL释放的方式

解决巨噬细胞上皮IV-infection是否需要TRAIL-induced凋亡诱导,模拟-或/ PR8-infected原子能委员会被感染是在培养anti-TRAIL或控制免疫球蛋白同形像Ab,原子能委员会凋亡诱导模拟-和A / PR8-infected培养AEC,然而,细胞凋亡水平感染AEC, DR5的表达水平增加(图5 a和B)超过mock-infected原子能委员会。添加中和anti-TRAIL Ab显著降低原子能委员会凋亡诱导两种模拟-或/ PR8-infected原子能委员会(图6)。地址是否macrophage-specific信号事件的确促进了原子能委员会调解IV-induced小道表达细胞凋亡,我们模拟-或/ PR8-infected wt,pkr−−/,ifnar−−/,或小道−−/我24 h,用原子能委员会进一步培养48 h,然后分析AnnexinV的比例+原子能委员会。原子能委员会在共培养细胞凋亡率没有增加与mock-infected wt,pkr−−/,ifnar−−/,或小道−−/点,与未感染相比,mono-cultured原子能委员会(8.3±1.8%,数据未显示)。然而,培养与受感染wt强烈诱导细胞凋亡在原子能委员会,这是原子能委员会被感染培养时显著降低pkr−−/,ifnar−−/,或小道−−/点(图6 b)。时也获得了类似的数据表达裂解caspase-3被免疫印迹分析培养原子能委员会(图6 c)。相应地,水平sTRAIL wt在上层清液对感染显著增加,但不是pkr−−/,ifnar−−/,或小道−−/点(图6 d)。最后,使用阻塞DR5 Ab和原子能委员会源自DR5-deficient老鼠培养显示AM-mediated原子能委员会凋亡诱导是依赖于上皮TRAIL受体DR5 (图6 e)。总的来说,这些数据表明PKR-IFN-β/ IFNAR-dependent巨噬细胞小道——诱发凋亡细胞死亡通过DR5在未受感染和IV-infected原子能委员会体外。

缩略图
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图6。巨噬细胞细胞凋亡原子能委员会在我IFN-dependent PKR和类型体外。

(A) 48小时培养小鼠原子能委员会(模拟或/ PR8-infected)和我(一个/ PR8-infected)治疗与anti-TRAIL或同形像Ab和原子能委员会凋亡的量化是通过流式细胞术(膜联蛋白V染色)。(B, C)模拟-或/ PR8-infected wt,pkr−−/,ifnar−/−或小道−−/我(MOI = 0.1)被原子能委员会培养48 h,直到原子能委员会凋亡由流式细胞仪(下半部分)中提供代表流式细胞仪情节或免疫印迹使用anti-cleaved caspase-3 Ab和溶菌产物staurosporin-treated原子能委员会积极控制。(D) Wt或gene-deficient是模拟-或/ PR8-infected (MOI = 0.1)体外和小道浓度测定在48 hπ。(E)模拟或wt / PR8感染巨噬细胞被wt原子能委员会和培养中和anti-DR5抗体或同形像控制添加到培养基中。此外,wt模拟或/ PR8感染巨噬细胞培养dr5−−/原子能委员会48 h,直到原子能委员会凋亡是由流式细胞仪。免疫印迹(C)显示了一个代表三个独立的实验。酒吧图表显示意味着±SD (A) 3、5 (B, D)和(E) 3个独立的实验。* p < 0, 05年;* * p < 0, 01;* * * p < 0001;点,肺泡巨噬细胞;原子能委员会,肺泡上皮细胞;嗨,热灭活;ns,不重要; iso, isotype; sTRAIL, soluble TRAIL.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g006

自分泌的封锁骨髓IFN-β信号变弱上皮损伤/ PR8感染在活的有机体内

调查是否IFN-β诱导pro-apoptotic AM-AEC相声还在运行在活的有机体内IV感染A / PR8-infected wt小鼠气管内的处理在d5 IFN-βπ。所示图7,sTRAIL浓度在BALF d7πvehicle-treated相比显著增加或mock-infected老鼠。IFN-β-induced(内源性和体内应用IFN-β)原子能委员会在气管内的细胞凋亡和肺泡蛋白质漏减毒治疗anti-TRAIL Ab (图7 b, C)。解决的角色PKR在巨噬细胞激活和随后的I型干扰素释放TRAIL-induced上皮细胞损伤,我们下一个创建了骨髓移植嵌合体小鼠的wt收件人表型wt,pkr−−/,ifnar−−/,或小道−−/BM细胞。嵌合小鼠显示> 90%的循环和tissue-resident捐赠者的巨噬细胞表型在12 w BMT后(无花果S5。),受到/ PR8-infection中概述图8。量化的sTRAIL BALF显示感应/ PR8-infected wt BM移植小鼠,而sTRAIL浓度显著降低在嵌合小鼠感染pkr−−/,ifnar−−/或小道−−/点(图8 b)。同样,mTRAIL表达肺泡居民的比例(AM)和招募渗出物(ExMac)巨噬细胞范围在wt BM移植小鼠∼15%,和被广泛当居民或渗出物减少巨噬细胞PKR、或IFNAR-deficient (图8 c、流量仪控制策略和ExMac描绘无花果S6。)。值得注意的是,mTRAIL没有明显表达了进一步mock-infected小鼠巨噬细胞或骨髓lung-recruited BALF中白细胞的数量(中性粒细胞;数据未显示)或肺匀浆(CD11b+树突细胞,CD103+树突状细胞;在不同组的数据没有显示)/ PR8感染后嵌合体小鼠。相应地,凋亡原子能委员会的分数,在增加/ PR8-infected相比mock-infected wt BM移植小鼠,减少小鼠的移植pkr−−/,ifnar−−/或小道−−/证明BM AnnexinV流仪量化+原子能委员会或水平的裂解caspase-3原子能委员会独立于模拟-或/ PR8-infected嵌合小鼠(图8 d, E分别)。AnnexinV之间的细微差异,裂解半胱天冬酶3-based原子能委员会凋亡量化可能从不同信号的分析结果在凋亡级联事件。值得注意的是,病毒间隙不影响小鼠缺乏白细胞小道或IFNAR,然而,PKR表达在白细胞所需有效抗病毒宿主防御的证明了量化/ PR8浓度在BALF d7π(图S7)。最后,巨噬细胞跟踪缺陷与减毒IV-induced肺损伤和减少发病率由肺泡白蛋白泄漏d7π(如图所示图8 f)和身体减肥时间进程π(图8 g)。在一起,这些数据显示,小道中诱导表达PKR和类型我IFN-dependent方式/ PR8感染在活的有机体内大大有助于IV-induced肺损伤。

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图7。封锁独立开展IFN-β诱导痕迹变弱上皮损伤静脉感染在活的有机体内。

(A) A / wt PR8感染小鼠的空斑形成单位(500)气管内的处理rIFN-β(10.000 IU)或车辆(0.1% BSA在PBS)在d5π和sTRAIL从BALF量化。(B, C) / wt PR8感染小鼠的空斑形成单位(500)气管内的处理rIFN-β或车辆(0.1% BSA在PBS)和anti-TRAIL Ab或同形像Ab腹腔内和原子能委员会细胞凋亡(B)和肺泡蛋白质泄漏(C)测定在d7π。酒吧图表显示意味着±SD /组(A) 6的动物和动物/组(B, C) 8。* p < 0, 05年;* * p < 0, 01;* * * p < 0001。Iso,同形像;sTRAIL可溶性TRAIL;Ab抗体;π,后感染。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g007

缩略图
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图8。封锁自分泌髓IFN-β信号影响巨噬细胞表达和变弱上皮损伤/ PR8感染在活的有机体内。

(一)治疗协议:CD45.1+wt老鼠致命辐照(6 Gy)和移植1×106CD45.2+wt,pkr−−/,ifnar−−/或小道−−/BM细胞嵌合体小鼠。12 w后,当> 90%的捐赠(wt,pkr−−/,ifnar−−/或小道−−/)表型,嵌合小鼠模拟-或/ PR8-infected和被分析在2 d或7 dπ。(B, C)描述IV-induced sTRAIL浓度BALF (B)和比例的mTRAIL-expressing是ExMac(渗出物巨噬细胞)在嵌合小鼠BALF d2π(C)。(D, E)原子能委员会细胞凋亡在模拟量化——或者在d7π/ PR8-infected嵌合小鼠通过流式细胞仪(D,描绘成膜联蛋白V+CD31的比例−CD45−EpCam+肺细胞,左面板;代表流式细胞仪情节,右面板)或通过免疫印迹使用原子能委员会的溶解产物分离模拟或/ PR8-infected嵌合小鼠和裂解caspase-3-specific Ab (E,上面板,免疫印迹3独立实验;底部面板中,量化的免疫印迹微数据)。(F)分析了肺泡白蛋白漏在模拟-或/ PR8-infected wt小道−/−在d7π嵌合小鼠静脉注射FITC-labelled白蛋白和被描绘成比例的血清和BALF FITC-fluorescence在任意单元(AU)。(G) wt和体重小道−/−嵌合小鼠决定发布/ PR8感染(ld50 350微升/∼30%)。酒吧图表显示意味着±SD (B, C, D, E, F) 5动物/组,(G) 8动物/组。* p < 0, 05年;* * p < 0, 01;* * * p < 0001;无日期。不确定;BMT,骨髓移植;dpi,几天后感染;π,后感染; sTRAIL, soluble TRAIL; mTRAIL, membrane bound TRAIL; Ab, antibody.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g008

讨论

静脉感染肺炎的特点是远端肺上皮细胞和常驻巨噬细胞和频繁的进展为急性肺损伤/ ARDS较差的结果。快速的有效的宿主防御战略因此IV-induced肺损伤的康复的关键。另一方面,一个夸张的炎症反应会增加大量的组织损伤细胞病理损伤。本研究阐明了一种以前未被认识的途径cytokine-mediated上皮损伤和凸显了IV-infected肺泡巨噬细胞作为关键球员在这个场景中。我们证明IFN-β,诱导IV-infected通过PKR-NF-κB-dependent通路,诱导表达和释放pro-apoptotic配体的自分泌IFNAR激活,从而大大有利于IV-induced凋亡组织损伤(图9)。

缩略图
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图9。提出的模型IFN-β介导pro-apoptotic AM-AEC相声IV-induced肺损伤。

IFN-β释放从IV-infected点PKR和NF-κB-dependent方式和诱导表达和释放的巨噬细胞跟踪通过自分泌IFNAR激活。巨噬细胞中细胞凋亡原子能委员会通过其受体DR5表达既定在未受感染和调节IV-infected原子能委员会。通过这个信号级联,IFN-β大大加剧了原子能委员会第四损伤和肺损伤严重肺炎。第四,流感病毒。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.g009

尽管它变得越来越明显,流感病毒5′-triphosphate-linked RNA在上皮细胞主要是被rig - i (RNA解旋维甲酸诱导基因)[22],IV-dependent I型干扰素诱导的途径主要是在这方面还没有被解决。鉴于RIG-I-like解旋酶信号通过下游适配器小牛(线粒体抗病毒信号,也称为IPS-1)在上皮静脉感染,介导IRF3/7-dependent I型干扰素的生产[23],我们分析这些转录效应物是否IFN-β生产所需主要是。不过,我们没有发现增加IRF7的表达式或激活或IRF3分别/ wt PR8感染或pkr−−/点。事实上,第一次我们的数据表明,在上午,PKR NF-κB信号和随后的转录活动是不可或缺的I型干扰素释放在静脉感染,建议macrophage-specific的信号转导和增加的一项研究强调NF-κB细胞I型干扰素反应的关键调节器对第四高致病性[27]。巨噬细胞的重要性PKR静脉感染中所反映出的事实是骨髓PKR-deficiency导致无效的病毒清除d7π(图S7)。双链(ds)依赖rna的激酶PKR抗病毒反应的是一个良好的组件存在于non-stimulated细胞在基底的水平,并进一步由I型干扰素调节[15],[28]。PKR自身磷酸化激活在绑定病毒RNP(核糖核蛋白)复合物和磷酸化蛋白质合成真核起始因子2 (eIF-2a),导致快速抑制翻译限制病毒粒子生产[25],[29]。最近,PKR显示控制转录的激活NF-κB通路,独立的激酶活性,在小鼠和其他细胞[24],[30]。是否绑定所需的病毒rnp NF-κB激活还是PKR而能传感IV-induced上游信号是在我们目前的调查。

主机的I型干扰素是至关重要的组件的天生的抗病毒反应[31]化合物,引起这种反应在临床上用于治疗不同的病毒感染。越来越多的证据表明,订婚的I型干扰素反应之前感染可能是一个治疗策略控制静脉感染不同的动物模型[32],[33]。此外,老鼠基因缺陷在I型干扰素信号低效率的静脉间隙[16],[34],ifnar−−/老鼠显示死亡率增加50%相比wt窝在回答/ PR8感染(数据未显示)。与我们的数据获得的ifnar−−/BM嵌合小鼠模型,这些发现表明骨髓的次要角色而不是肺实质IFNAR信号在抗病毒宿主防御ifnar−−/嵌合小鼠明显IV相似程度作为控制老鼠(图S7)。我们的数据表明我是IFN-βIV-infected肺的一个重要来源。中和肺泡IFN-β和/或-α在d5π减毒原子能委员会损伤d7π表明封锁IFNAR受体I型干扰素的足够强烈原子能委员会减少细胞凋亡。与此同时,肺泡沉积的重组IFN-βd5π增加凋亡原子能委员会在IV-infected肺损伤,而IFN-β预处理小鼠感染前24小时显著降低病毒传播和伴随肺泡蛋白质泄漏(数据未显示)。这些数据添加到上述研究证明有效的抗病毒效应IFN-β之前或在感染的早期应用,表明长期或夸张的I型干扰素反应在后期,当几乎从肺部清除病毒,可能是有害的炎症反应的一个重要的放大器IV肺炎。

这种干扰素诱导有害的宿主反应的主要决定因素被发现的凋亡诱导配体。小路是一个良好的组件的宿主抗肿瘤免疫反应被认为发挥pro-apoptotic效应只对恶性肿瘤细胞[35]。直到最近,我们和其他人证明TRAIL-mediated凋亡的作用在上皮损伤小鼠病毒性肺炎和人类[5],[6]。然而调节TRAIL的表达的特异性信号事件仍然难以捉摸。先前的报道表明,IFN-β-stimulated树突细胞进行跟踪调节肿瘤细胞的死亡[36]并建议小道IFN-dependent外周血单核细胞中表达[37]。符合这些研究,我们的数据显示,小道干扰素诱导的基因表达是通过自分泌IFNAR信号在我体外和在活的有机体内静脉感染。第四重要的是,不同的致病性菌株诱导基因表达在小鼠不同的区段。mouse-adapted / PR8,已知在小鼠高致病性,引起了∼800倍,和高致病性禽流感H5N1 IV /泰国/ KAN-1/04,导致严重的肺炎小鼠[38]峰值增加,诱导∼200倍轨迹表达式,而感染低致病性×31刺激只有∼8倍。同样,小道mRNA感应模式与IFN-β基因表达。这些发现表明关系的程度TRAIL-mediated凋亡原子能委员会第四损伤和各自的潜在致病菌株。因此,诱导我IFN-TRAIL轴可能被视为小说类型的行列式IV致病性。值得注意的,因为我们的研究结果也显示不同程度的第四permisseveness不同菌株(流产感染H1N1的第四,第四高复制率高致病性,图中未显示),这个途径导致肺损伤的程度上感染IV / PR8有待定义。TRAIL表达多种免疫细胞如T细胞、NK细胞、居民组织巨噬细胞、树突细胞和循环单核细胞[39]。先前的研究表明,抗体介入跟踪信号的抑制导致减少病毒清除小鼠模型的IV肺炎[40],CD8+T细胞利用小径杀死IV-infected肺泡上皮细胞在活的有机体内[41],表明IV-induced小道执行人一样重要的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。虽然我们的数据来自大英博物馆嵌合小鼠模型表明leukocyte-expressed小道的次要角色静脉间隙,小鼠移植小道−−/BM完全清除IV d7π(图S7),我们的研究结果不排除,除了FasL或穿孔素抗原特异ctl进行专门第四杀死被感染的靶细胞。相比之下,巨噬细胞TRAIL-mediated上皮细胞杀死并不限于IV-infected, DR5 high-expressing原子能委员会,但也未受影响与低水平表面DR5表达原子能委员会(图5,6)。这表明释放是在大量在I型干扰素刺激导致大量的附带损害(感染)上皮屏障,特别是巨噬细胞中存在大量的空域,期间观察到第四肺炎[6]。

总之,我们的数据揭示了小说角色的I型干扰素诱导凋亡肺泡上皮损伤和突出IV-infected巨噬细胞作为核心球员。识别信号的步骤在这个IFN-β-dependent有害macrophage-epithelial相声提供了新的治疗策略的潜在目标的前提下尽可能地减弱肺损伤的抗病毒免疫反应在第四严重的肺炎。

材料和方法

道德声明

按照法律规定所有动物实验的德国动物福利法案(Tierschutzgesetz)和地方当局批准黑森州(Regierungsprasidium吉森;参考数字64/2007,09/2009,39/2011)。所有实验进行氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下,和所有正在努力减少受感染动物的痛苦。人类肺组织从病人获得叶切除术后通知书面同意(病理和手术、Justus-Liebig-University吉森)。BALF样本来自吉森和马尔堡大学的生物(UGMLC)。使用人类的肺组织和BALF样本被吉森大学的伦理委员会批准。

老鼠

C57BL / 6小鼠wt是从查尔斯河实验室购买的。小道−−/老鼠[35]Amgen Inc .提供的是(CA千橡市,美国)。pkr−/−[42]是一种礼物j . Pavlovic(瑞士苏黎世大学医学病毒学研究所)。美国Kalinke提供ifnar−−/老鼠[43]Langen Paul-Ehrlich-Institut的赞助下,德国,被backcrossed B6N20。Dr5−−/老鼠一种礼物t . Mak(坎贝尔家族乳腺癌研究所医学生物物理学,多伦多大学,加拿大)[44]。B6.SJL -Ptprc一个老鼠表达CD45.1同种抗原(Ly5.1 PTP)循环白细胞(C57BL / 6遗传背景)获得杰克逊实验室。老鼠在特定的无菌条件下饲养。

人体标本

从叶切除术获得人类肺组织标本从肿瘤远端。BALF吉森和马尔堡大学的材料来源于肺中心(UGMLC)生物。BALF患者样本进行支气管镜检查诊断为目的但显示正常BALF细胞结构和差动白细胞数量(即居民肺泡巨噬细胞> 90%)被用于隔离的居民肺泡巨噬细胞在体外感染实验或控制样本。pH1N1-BALF样本收集的重症监护病房的患者内科二世,UGLC 2009年12月至2011年1月与RT-PCR-confirmed (BALF) H1N1大流行性流感感染(细菌感染被排除在BALF材料)。所有的病人(n = 6,年龄42±15 y)需要机械通气由于ALI / ARDS和受到BAL原因诊断当天入学。从患者BALF材料机械通风由于病毒性(即细菌性肺炎或sepsis-induced) ARDS和患者样本受到BAL原因诊断在入学的日子,发现,细菌性肺炎(n = 8)另外包括在内。

试剂

以下anti-mouse马伯/二级试剂用于流式细胞仪和免疫荧光:CD31-FITC (BD Pharmingen、海德堡、德国),CD45-APC-Cy7 (BD Pharmingen、海德堡、德国),EpCam-annexin V-Alexa萤石647(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),小道(Biolegend、Uithoorn、荷兰),IgG2a同形像(Biolegend、Uithoorn、荷兰),驴anti-rat免疫球蛋白Alexa萤石488(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),山羊anti-rat IgG-PE (Serotec,杜塞尔多夫,德国),mouse-anti流感NP(子午线生命科学、Asbach、德国),anti-mouse DR5(研发、威斯巴登、德国),山羊anti-mouse免疫球蛋白Alexa萤石647(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),山羊anti-mouse免疫球蛋白Alexa萤石555(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),驴anti-rat免疫球蛋白Alexa萤石488(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),CD45.1-FITC (BD Pharmingen、海德堡、德国),CD45.1-PE (BD Pharmingen、海德堡、德国),CD45.2-APC-Cy7 (Biolegend、Uithoorn、荷兰),SiglecF-PE (BD Pharmingen、海德堡、德国),CD11c-PE-Cy5.5(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),GR1-PE-Cy7 (Biolegend、Uithoorn、荷兰),CD3ε-APC (Biolegend、Uithoorn、荷兰),CD11c-APC (Biolegend、Uithoorn、荷兰),MHCII-FITC (BD Pharmingen、海德堡、德国),CD103-PE-Cy5.5 (Biolegend、Uithoorn、荷兰),CD11b-PE-Cy7 (Biolegend、Uithoorn、荷兰),F4/80-APC(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),B220-PE-Cy7 (BD Pharmingen,海德堡,德国)。反TRAIL-PE和相应的同形像IgG1κ-PE来自BD Pharmingen(德国海德堡)。免疫印迹分析以下anti-mouse抗体被用于:Anti-β-Actin (Biolegend、Uithoorn、荷兰),anti-IRF3(圣克鲁斯、海德堡、德国),anti-phospho IRF3(细胞信号,法兰克福点。德国),anti-IRF7(圣克鲁斯、海德堡、德国),anti-PKR (Abcam,剑桥,英国),anti-phospho PKR (Abcam,剑桥,英国),anti-cleaved Caspase-3(细胞信号,法兰克福。M。、德国)和二级anti-rabbit IgG-HRP抗体(细胞信号,法兰克福。M。,德国)。多克隆anti-IFN-βAb (PBL、Herford、德国)是用于交货体内中和在180国际单位/毫升的浓度。因为在体内中和10.000 IU / 70µl anti-IFN-α或反IFN-βAb (PBL、Herford、德国)气管内的管理如果不显示。抑制anti-TRAIL抗体或相应的免疫球蛋白g控制(Uithoorn, Biolegend荷兰)体外500 ng / ml的浓度和150µg腹腔注射感染后的3和5天。10.000 IU / 70µl重组小鼠IFN-β(PBL、Herford、德国)稀释0.1% bsa或0.1% bsa单独应用气管内的或添加到细胞培养上清液的浓度。重组小鼠小道(研发、威斯巴登、德国、100 pg / ml)和Staurosporin(σ,Deisenhofen、德国、2µM)被用于在体外实验。

原子能委员会隔离和文化

小鼠原子能委员会被孤立的方法由螺旋器和他的同事们[45]概述[46]。2.0×105原子能委员会/被播种在24孔板(BD生物科学、海德堡、德国)。共培养实验,3.0×105原子能委员会被播种在底部一侧8µm孔隙大小transwells (BD生物科学、海德堡、德国)[47]。的细胞在DMEM和消息灵通的补充,谷酰胺,10% FCS和抗生素5 d。人类原子能委员会孤立如前所述[48]并保存在火腿的F12培养基(Biochrom,柏林,德国)补充10% FCS和抗生素5 d。小鼠和人类的纯度原子能委员会评估使用anti-CD45 anti-CD326 / EpCam和anti-pro-SP-C抗体(Biolegend、Uithoorn、荷兰;微孔,德国的埃施博恩)。细胞悬浊液纯度> 90%被用于进一步的实验。

肺泡巨噬细胞隔离和文化

小鼠肺泡巨噬细胞是居民隔离来自肺部的支气管肺泡灌洗液(BALF) wt或gene-deficient老鼠所描述[47],培养RPMI 1640含2% FCS,谷酰胺和抗生素和坚持2 h后进一步治疗。在选定的实验中,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1∶400稀释,σ,Deisenhofen,德国)添加到培养基后直接感染或巨噬细胞是Jak / Stat抑制剂对待我(1500 nM在DMSO, Calbiochem,达姆施塔特,德国)或湾11 - 7082(25µM在DMSO, Calbiochem,达姆施塔特,德国)之前或DMSO单独添加1 h和感染后细胞培养基。在共培养实验2.5×105以前感染或mock-infected小鼠肺泡巨噬细胞/好居民结合小鼠肺泡上皮细胞的底部一侧transwells co-cultivated 48 h如前所述[47]。

人类居民肺泡巨噬细胞纯化BALF的患者进行支气管镜检查诊断,但并没有发现异常BALF细胞结构或微分BALF中白细胞计数和播种密度为2.5×105细胞/或1.25×105细胞/在24 -或48-well板,分别。肺泡巨噬细胞从pandH1N1或控制病人(5.0×105BALF细胞/)被播种在12孔板,在RPMI 1640含50% FCS,谷酰胺和抗生素,坚持40分钟。细胞被洗几次删除non-adherent淋巴细胞和中性粒细胞。巨噬细胞纯度是评估使用整体形态标准,包括细胞大小和形状差异总是> 90%。

体外感染

下面的四株被用于体外感染:/公关/ 8/34 (H1N1) (A / PR8), A / X-31 (H3N2)(×31),高致病性禽流感H5N1病毒与人类致命病例/泰国/ KAN-1/04(/泰国)[49],swine-origin H1N1大流行性流感病毒A /汉堡/ 5/09 (A /火腿)和季节性H1N1病毒/孟菲斯14/96-M (/ Mem)[50]。热失活进行了30分钟的56°C。细胞被感染(MOI = 1,除非另有指示)的总量75年48孔板或100µlµl 24孔板在PBS稀释+ / +补充0.1% BSA(σ,Deisenhofen,德国)和抗生素1 h。后切除剂各自的培养基补充0.1% BSA(σ,Deisenhofen,德国),2µg /毫升Trypsin-TPCK (Troisdorf沃辛顿,德国)和抗生素添加和细胞在37°C和5%孵化有限公司2~ 24 h。进一步处理,细胞使胰蛋白酶化与胰蛋白酶/ EDTA (PAA、Colbe、德国)流式细胞仪分析实时聚合酶链反应和免疫印迹或细胞溶解。

在活的有机体内治疗方案

小鼠气管内的接种350 - 500微升/ PR8无菌PBS稀释−−/总量的70µl或模拟感染了PBS−−/一个人。老鼠牺牲在指定的时间点和血液和BALF获得和处理(如前所述)[6]。BALF细胞血细胞计数器和量化的统计白细胞细胞是由微分项子集Pappenheim-stained cytocentrifuge准备使用整体形态标准,包括细胞核的细胞大小和形状的差别。由肺肺泡泄漏分析渗透率测定FITC-labelled输液注射白蛋白(σ,Deisenhofen,德国)和检测血清和BALF FITC-fluorescence,如前所述[6]或通过检测BALF中总蛋白浓度的商用分光光度测定(BCA化验,Biorad,慕尼黑,德国)。原子能委员会的分析细胞凋亡、肺气管内的消化了Dispase和加工中的应用概述[6]。

创建骨髓嵌合体小鼠

BM细胞被孤立在无菌条件下胫骨和股骨的wt C57BL / 6,pkr−−/,ifnar−−/或小道−−/供体小鼠全身辐照后如前所述(6 Gy)[6]。作为骨髓移植,控制wt C57BL / 6 BM细胞(表达CD45.2同种抗原)被移植到CD45.1 alloantigen-expressing C57BL / 6小鼠的比例在每个移植实验和捐赠者CD45.2-expressing血液中白细胞数量,BALF和肺匀浆被流式细胞术分析。捐赠者的比例定期循环和lung-resident髓细胞> 90%,通过流式细胞仪分析显示CD45.2的比例+与CD45.2+细胞。嵌合小鼠被安置在特定病原体免费条件12周之前公关/ 8感染。

RNA隔离和实时rt - pcr

细胞裂解后RLT缓冲区(试剂盒、希尔登,德国),RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成、试剂和孵化之前列出的步骤进行[46]。反应进行的第一步加上序列检测系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)使用Sybr绿色fluorogenic探针在25µl反应包含5µl cDNA示例中,铂Sybr绿色qPCR supermix(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)和45 pmol正向和反向引物。以下使用正向和反向引物:小鼠肌动蛋白,5′-ACCCTAAGGCCAACCGTGGC-3′、反向5′-CAGAGGCATACAGGGACAGCA-3′;人肌动蛋白,5′-CTGGGAGTGGGTGGAGGC-3′、反向5′-TCAACTGGTCtCAAGTCAGTG-3′;小鼠小道向前,5′-GAAGACCTCAGAAAGTGGC-3′和反向5′-GACCAGCTCTCCATTCTTA-3′;人类历史的轨迹向前5′-GAGGTTGCAGTGGTGAGA-3′、反向5′-CCCCTGCTGGCAAGTCAA-3′;小鼠IFN-beta5′-ACGTCTCCTGGATGAACTCCA-3′和反向5′-CAGTTGAGGACATCTCCCACG-3′;人类IFN-β向前,5′-CAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGC-3′、反向5′-TCATCCTGTCCTTGAGGCAGT-3′;小鼠DR5向前5′-AAGTGTGTCTCCAAAACGG-3′,反5′-AATGCACAGAGTTCGCACT-3′;人类DR5向前5′-GGTTCCAGCAAATGAAGGTG-3′和反向5′-GAGTCAAAGGGCACCAAGTC-3′。相对基因丰度看家基因计算ΔCt价值,与ΔCt = Ct参考−Ct目标和数据提出了ΔCT或褶皱表达式(2ΔΔCt在治疗组之间)值。

免疫印迹

培养细胞或者原子能委员会独立于A / PR8感染小鼠细胞溶解在裂解缓冲(20毫米Tris-HCL, 150毫米氯化钠,1毫米Na2EDTA、1毫米EGTA NP-40 0.5%, 2毫米原钒酸钠和蛋白酶抑制剂鸡尾酒;罗氏公司、德国曼海姆)和蛋白质含量是使用商用分光光度测定(BCA化验,Biorad,慕尼黑,德国)。解决在sds - page分离蛋白质和转移到Hybond PVDF-membrane(通用电气医疗集团;慕尼黑,德国)。膜被封锁和孵化主要和次要抗体。乐队是使用增强化学发光免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团,慕尼黑,德国)。

病毒滴度

BALF中病毒滴度测定中使用空斑实验Madin-Darby犬肾细胞。总之,重复的单层细胞生长在6-well板与1毫升孵化BALF稀释1 h在室温和覆盖1.25% Avicel半固态包裹中包含2µg /毫升Trypsin-TPCK(沃辛顿,Troisdorf,德国)48 h。细胞被固定为4%在PBS pfa, permeabilized triton x - 100, 1%孵化与稀释主要anti-NP(子午线生命科学、Asbach、德国)和二级HRP-conjugated anti-mouse抗体(圣克鲁斯、海德堡、德国)45分钟,分别和沾染了真正的蓝色(美国马里兰州盖瑟斯堡KPL,,)。斑块是计算使用光学显微镜(DM 2500年徕卡微系统公司,位于德国)。

流式细胞术

1 - 5×105细胞被洗在流式细胞仪缓冲区(PBS−−/,7.4% EDTA, 0.5% FCS, pH值7.2)和固定在1% pfa / PBS−−/或在膜联蛋白V resuspended染色缓冲区(10毫米玫瑰,140毫米CaCl氯化钠和2.5毫米2),各自的初级和二级抗体孵育15分钟在4°C,和流动仪分析使用FACSCanto流式细胞分析仪(BD生物科学、海德堡、德国)和流式细胞仪天后软件。

免疫荧光

细胞培养在室幻灯片被固定为5分钟的混合物甲醇∶丙酮(1∶1)和孵化的30分钟3% BSA在PBS。2 h的细胞被染色的主要和洗后与二次抗体2 h。后最后一个洗涤步骤细胞满是DAPI-containing安装介质(Vectashield;向量实验室,一夜之间决定,德国)和晾干。样本分析徕卡DM 2000光学显微镜使用徕卡数码影像软件(位于德国)。

ELISA和TransAM活动分析

小鼠和人类IFN-αIFN-β,小道从细胞培养上清液和FasL水平进行了分析,小鼠肺或人类BALF或上层清液均相使用商用ELISA试剂盒(研发系统、威斯巴登、德国;PBL、Herford、德国;USCN,瑞士巴塞尔)根据制造商的指示。激活使用商用TransAM NF-κB是量化分析p65(活动主题、La Hulpe、比利时)根据制造商的指示。短暂,TransAM分析量化激活p65绑定到一个固定化consensus-binding网站低聚糖后的核提取物。主要抗体特定的抗原决定基的绑定和主动形式p65然后添加之后,随后的孵化与二次抗体比色定量和开发解决方案。

统计数据

所有数据给出平均值±标准偏差。两组之间的统计显著性估计使用双尾成对或不成对学生的学习任务配对或未配对样本,分别。>的比较两组互相单向方差分析和因果Tukey-HSD应用。重要性与Windows软件SPSS计算。的值p< 0.05被认为是重要的。

支持信息

图S1。

/ PR8感染率的小鼠和原子能委员会体外和IFN-β表达在人类肺泡巨噬细胞和上皮细胞/ PR8感染。(一)小鼠和原子能委员会是一个/ PR8感染了莫伊和NP的百分比表示+细胞决定在8 h, 16 h和24小时π。(B)人类或原子能委员会体外使用莫伊= 1 / PR8感染和IFN-βmRNA表达量化在给定的时间和被描绘成褶皱mock-infected控制的感应。酒吧图表代表意味着±SD 4 (A, B)独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。留言。,not detectable; ns, not significant; AM, alveolar macrophages; AEC, alveolar epithelial cells; pi, post infection; NP, nucleoprotein; MOI, multiplicity of infection.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s001

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图S2。

IFN-β和TRAIL表达依赖于流感病毒株在小鼠和人类肺泡巨噬细胞。小鼠左面板(上、下)或人工(上下右面板)体外感染了表示IV和莫伊IFN-β(上左和右面板)或小道(左下和右面板)mRNA表达量化在给定的时间和被描述为褶皱mock-infected控制的感应。酒吧图表代表意味着±SD (A, C) (B, D) n n = 3 = 5独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;老妈,小鼠;火腿,人类是;莫伊,感染复数;pH1N1,猪H1N1大流行性流感;sH1N1,季节性H1N1流感病毒。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s002

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图S3。

FasL表达感染肺泡巨噬细胞。小鼠是是体外感染/ PR8表示莫伊和FasL mRNA表达量化在给定的时间和被描绘成褶皱感应mock-infected控制(A),小鼠体外感染/ PR8表示莫伊和sFasL水平的量化细胞培养上清液(B)。酒吧图表代表意味着±SD 3个独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;莫伊,感染复数、sFasL可溶性Fas配体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s003

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图S4。

时间的表达在IV-infected原子能委员会。小鼠原子能委员会是体外感染/ PR8表示莫伊和小道mRNA表达量化在给定的时间和被描绘成褶皱mock-infected控制的感应。酒吧图表代表意味着±SD 3个独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;莫伊,感染复数;AEC,肺泡上皮细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s004

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图S5。

BM重建的效率和居民交换嵌合体小鼠。控制移植和居民CD45.1重构效率+收件人老鼠与CD45.2 BMT后+BM, CD45.2的分数+总外周血的白细胞(PBL)和居民是被从血液或流式细胞术量化BALF 12 w BMT后。酒吧图表显示意味着±SD从3独立实验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s005

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图S6。

控制策略检测的居民和渗出物从BALF巨噬细胞(ExMac)。供体白细胞(CD45.2+SSC)是封闭的高CD3ε−分数排除淋巴细胞。中性粒细胞被定义为CD11c−GR-1高(中性粒细胞)。ExMac被定义为CD11c高SiglecF低GR-1int而居民被定义为CD11c高SiglecF高GR-1低。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s006

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图S7。

病毒载量BALF的嵌合小鼠wt wt移植后,pkr−−/,ifnar−−/或小道−−/BM d7π。酒吧图表显示的空斑形成单位(空斑形成单位)×103±5动物的SD /组。n。,not significant.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003188.s007

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确认

作者希望感谢j . Pavlovic和t . Mak提供转基因老鼠。我们感谢r·温克勒j . Bespalowa, d . Hensel优秀的技术援助。

作者的贡献

构思和设计实验:哈罗德,k . Hoegner j . Lohmeyer w·西格。进行了实验:k . Hoegner帕洛格。分析了数据:哈罗德,j . Lohmeyer格鲁伯。造成试剂/材料/分析工具:h . Walmrath Kalinke, m . Matrosovich s Gattenloehner j .。博得纳Lewe-Schlosser页。该报写道:哈罗德,j . Lohmeyer t·沃尔夫Pleschka。

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