甲型流感病毒NS1蛋白与TRIM25以特有的方式

考虑到哺乳动物和鸟类TRIM25蛋白质显示显著差异在CCD(补充图S1A),在人类TRIM25 NS1必要且充分的绑定[38],我们测试了NS1编码由人类的能力(加州/ / 04/09 [Cal04]),鸟类(/香港/ 156/1997 [HK156]),猪(猪/德州/ 4199 - 2/98 [SwTx98])和mouse-adapted(/波多黎各/ 8/34 [PR8])甲型流感病毒与TRIM25 orthologues。为了方便这些研究中,我们使用绑定CPSF30 NS1蛋白缺乏能力,因此无法阻止宿主基因表达[40]。此外,这些NS1蛋白保守E96 / E97氨基酸之前是与人类TRIM25(补充重要的交互图印地)[38]。

与以前的结果一致[38]co-immunoprecipitation (Co-IP)对转染HEK293T细胞的研究表明,所有测试NS1蛋白有效互动与人类TRIM25 (hTRIM25) (图1一个)。此外,鸡TRIM25 (chTRIM25)强烈束缚NS1-HK156,只有弱或没有与观察chTRIM25 NS1 PR8或Cal04 SwTx98,分别为(图1一个)。此外,所有的NS1蛋白与鼠标TRIM25 (mTRIM25)。

有人建议,鸡缺乏功能性rig - i基因[39]。我们因此问chTRIM25 IFN-β感应在IAV感染很重要,如果chTRIM25-NS1交互功能,并进一步测试。为此,我们沉默内源性TRIM25鸡LMH细胞对病毒感染和测量IFN-βmRNA表达(图1 b-1d)。具体来说,我们使用重组/公关/ 8/34病毒NS1蛋白表达从PR8 SwTx98, HK156,显示微分chTRIM25绑定,以及PR8重组病毒表达NS1基因突变R38A / K41A,已知缺乏干扰素对抗由于其废除dsRNA和hTRIM25绑定能力[10],[38],[41]。大约87%的降价chTRIM25 mRNA水平实现了由定量PCR (qPCR) (图1 b)。mock-infected控制细胞相比,IFN-βmRNA表达高度上调(∼1500倍)在感染NS1基因突变R38A / K41A病毒(图1 c)。这IFN-β感应显著降低在TRIM25-knockdown LMH细胞,表明TRIM25确实是在鸡细胞功能。此外,IFN-β感应感染PR8, SwTx98 HK156重组病毒反向与NS1蛋白的结合能力chTRIM25 (图1 d)。而PR8和HK156 IFN-βmRNA的可怜的诱发者,感染SwTx98病毒NS1蛋白的不绑定chTRIM25,导致∼15倍IFN-β归纳。此外,IFN-β感应SwTx98病毒减少到几乎TRIM25-knockdown细胞基底的水平,表明这种病毒诱发IFN-β鸡细胞中基因表达的机制主要是依赖TRIM25 (图1 d)。排除生产干扰素诱导的低水平PR8和HK156病毒由于低效LMH细胞中复制,我们测量的mRNA水平病毒M1 qPCR (图1 e)。所有的病毒复制,尽管只有细微的差别,M1 mRNA的水平负相关与IFN-β诱导这些病毒的活性。这表明TRIM25也扮演着重要的角色在鸡细胞建立抗病毒反应。

我们下一个测试的能力是否NS1蛋白绑定mTRIM25与他们在老鼠细胞IFN-inducing活动。为此,我们被感染的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)不同NS1重组病毒。IFN-β信使rna诱导由qPCR,通过生物测定和干扰素蛋白水平测定(图1 f,左面板。令人惊讶的是,尽管没有NS1蛋白绑定到mTRIM25 (图1一个),所有NS1重组病毒诱导非常低的干扰素mef相比R38A / K41A变异病毒,这表明NS1不需要绑定TRIM25抑制干扰素诱导的小鼠细胞。绑定的NS1 CPSF30也不占这个mef抑制活动,作为所有这些NS1蛋白缺乏抑制CPSF30,因此一般的基因表达[40]。此外,所有的病毒复制类似水平MEF细胞由M1 mRNA和病毒滴定(图1 f,右面板年代)。

老鼠经常作为模型来研究流感发病机理。因此重要的是要了解的详细机制流感病毒逃避免疫应答在这个特定的主机。因此,我们开始寻求与mTRIM25证实缺乏NS1交互。统治的无能NS1绑定到mTRIM25是由于缺乏NS1-TRIM25-interaction所需辅助因子在人类细胞中,我们测试了绑定的内生TRIM25 NS1-PR8 PR8-infected人类HEK293T细胞和小鼠Hepa1.6 (图2一个)。NS1有效与内源性TRIM25 HEK293T细胞,而它没有绑定到内源性TRIM25 Hepa1.6细胞(图2一个)。我们还观察到一个高效的互动与外生hTRIM25 ectopically表示NS1,但不是mTRIM25 HEK293T Hepa1.6细胞(图2 b)。符合这一点,细菌纯化谷胱甘肽-年代转移酶(GST) ns1 hTRIM25融合蛋白结合,而不是mTRIM25,在体外结合试验(图2 c)。

人类和小鼠的ccd TRIM25蛋白质份额只有56%的身份在氨基酸水平(aa 180 - 450)与aa 350 - 400年之间的主要差异。为了测试这些氨基酸的变化TRIM25 CCD负责NS1绑定我们生成了一个人类的差异/鼠标嵌合TRIM25蛋白质含有氨基酸hTRIM25 191 - 379 (mChimT25_{h191 - 379})和分析的能力与NS1-PR8 (图3和图3 b)。Co-IP实验显示,尽管mTRIM25没有与NS1, hTRIM25 mChimT25_{h191 - 379}有效地约束NS1 (图3 b)。

正如之前报道的[38],过表达NS1本地化主要与次要细胞质细胞核组件;然而,发生hTRIM25 NS1细胞质定位导致显著增加,表明hTRIM25-NS1交互。所示图3 c和3 d异位表达hTRIM25或mChimT25_{h191 - 379}明显re-localized NS1的细胞质中,他们广泛硝唑(分别为92%和80%的细胞胞质NS1)。相比之下,co-expression不与NS1的mTRIM25显示只有轻微影响NS1亚细胞定位(图3 c和3 d)。这些结果共同表明,氨基酸的改变CCD的鼠标TRIM25负责互动NS1的损失。

NS1-PR8抑制小鼠rig - i泛素化和下游干扰素诱导TRIM25-independent的方式

A型流感病毒缺乏功能性NS1蛋白诱导一个健壮的干扰素反应,因此在免疫活性的小鼠复制不佳,这表明NS1抑制干扰素诱导的小鼠[42]。然而,尽管在人类细胞NS1与人类TRIM25抑制rig - i泛素化和激活[38],相同的机制不能适用于老鼠细胞,NS1并不与鼠标TRIM25交互。为了获得更多的影响的见解NS1鼠标rig - i激活我们检查NS1的泛素化的影响人类或鼠标rig - i 2卡在人类HEK293T或鼠标Hepa1.6细胞(图4一)。

与以前的结果一致[38]的泛素化,NS1-PR8强有力地抑制GST-fused人类rig - i 2卡(GST-hRIG-I 2卡)HEK293T细胞剂量依赖性的方式。形成鲜明对比,NS1没有阻止老鼠的泛素化GST-RIG-I 2卡(GST-mRIG-I 2卡)Hepa1.6细胞(图4一)。此外,我们分析了影响NS1的仙台病毒(股票)全身泛素化的长篇rig - i在人类HEK293T细胞和小鼠Hepa1.6 (图4 b)。有趣的是,体内的泛素化表示NS1-PR8有效地抑制全身rig - i剂量依赖性的方式在两个细胞系(图4 b)。这些结果共同表明,虽然NS1有效地抑制人类rig - i的卡片泛素化,它抑制小鼠rig - i的泛素化作用于它的c端地区。

Lys172卡片的人类rig - i (hRIG-I)是必不可少的rig - i TRIM25泛素化和激活[25]。然而,这种残留不保存鼠标rig - i (mRIG-I)(补充图S2),提高质疑mRIG-I由mTRIM25 ubiquitinated作为人类rig - i之前报道的发生。引人注目的是,泛素化GST-h2CARD是探测不到的/ TRIM25−−mef,而这是强劲ubiquitinated在野生型(WT) mef (图5一个)。相比之下,GST-m2CARD显示下降但仍可检测泛素化/ TRIM25−−mef WT mef(相比图5一个)。调整的/ TRIM25−−mef鼠标或人类TRIM25显示增加在人类和小鼠rig - i 2卡泛素化(图5 b),这表明mTRIM25活跃和能够ubiquitinate鼠标rig - i卡在这些条件下不同赖氨酸残留物/ s。有趣的是,NS1抑制hTRIM25-dependent泛素化的人类或鼠标rig - i 2卡但无法抑制mTRIM25-dependent泛素化的人类或鼠标rig - i 2卡(图5 c)。支持,NS1 co-immunoprecipitated rig - i 2卡只有当hTRIM25在场,但不是在ectopically mTRIM25表达(图5 c)。自从NS1强有力地抑制全身mRIG-I的泛素化(图4 b),我们下一个测试如果NS1-PR8与内生non-complemented rig - i/ TRIM25−−mef或/ TRIM25−−mef重组与人类或鼠标TRIM25 (图5 d)。这表明,NS1容易co-immunoprecipitated内源性rig - i/ TRIM25−−mef,这种交互是外生的存在进一步增加人类而不是鼠标TRIM25 (图5 d)。此外,体内表达NS1-PR8强烈抑制SeV-induced内源性rig - i的泛素化/ TRIM25−−细胞剂量依赖性的方式(图5 e),这表明NS1结合鼠标rig - i和抑制其泛素化TRIM25-independent的方式。我们下一个内生rig - i的泛素化在WT和决定/ TRIM25−−mef PR8病毒感染(补充图S4A)。这表明rig - i泛素化是减少/ TRIM25−−mef WT mef相比。此外,PR8感染显著减少了内生的泛素化在WT mef和rig - i/ TRIM25−−mef(补充图S4A)。

最后,我们检查的能力NS1-PR8 WT mef或抑制IFN-β启动子的激活/ TRIM25−−mef。正如所料,NS1抑制SeV-induced IFN-β启动子的激活在WT mef (图5 f)。/ TRIM25−−mef显示明显减少IFN-β子活动感染比WT mef签订;然而仍有可检测IFN-β感应塞的刺激。这剩余IFN-β感应/ TRIM25−−mef进一步抑制外源性NS1 (图5 f),证明NS1抑制小鼠细胞的干扰素诱导TRIM25独立的机制。

总的来说,这些结果表明,人类TRIM25是人类的主要在E3泛素连接酶rig - i 2卡,NS1抑制其活性。我们的结果进一步表明,在小鼠细胞有一个替代在E3泛素连接酶与TRIM25配合充分激活鼠标rig - i,替代在E3泛素连接酶,这可能是NS1的目标。

NS1与鼠标Riplet E3泛素连接酶

Riplet(也称为RNF135)最近被证明是重要的干扰素生产老鼠[27]人类rig - i和ubiquitinate Lys849和Lys851 c端域[26]。因为这些在鼠标rig - i(补充赖氨酸残基是守恒的图S3)我们假设NS1可能结合鼠标Riplet (mRiplet),从而抑制rig - i泛素化和下游信号在鼠标。

所示图6,NS1-PR8容易体内表示mRiplet HEK293T细胞感染签订的存在与否。我们还观察到一个有效的交互NS1 mRiplet Hepa1.6细胞感染PR8株(图6 b)。免疫荧光分析进一步表明,随着看到人类TRIM25中的mRiplet re-localized NS1离原子核细胞质;大约90%的细胞表现出主要细胞质NS1 (图6 c)。此外,体内表达NS1 Cal04 HK156菌株也有效地与mRiplet小鼠Hepa1.6细胞(补充图S4B)。此外,Hepa1.6细胞感染各种重组/公关/ 8/34病毒NS1蛋白表达从PR8 Cal04, HK156, Tx91, SwTx98, Pan99,还显示一个互动NS1和mRiplet (图6 d),表明这种影响不是独家的NS1蛋白mouse-adapted PR8株。最后,NS1 E96A / E97A突变,缺乏人类TRIM25结合的能力[38]也能够与mRiplet转染和感染细胞,而NS1 R38A / K41A突变,缺乏dsRNA和hTRIM25绑定,不绑定到mRiplet在同等条件下(图6 e和补充图自己)。

NS1对抗的Riplet-dependent rig - i泛素化和干扰素诱导小鼠细胞

我们接下来问NS1专门抑制Riplet-mediated rig - i在小鼠细胞的泛素化。为此,我们检查了内生rig - i泛素化在小鼠Hepa1.6细胞转染空载体或Flag-mRiplet一起有或没有NS1-PR8 (图7)。这表明外源表达mRiplet显著增强内生rig - i的泛素化,这强有力地抑制了泛素化的co-expression NS1 (图7)。与此一致的是,异位表达mRiplet导致增加4.6倍mRIG-I-induced IFN-β启动子的激活,这rig - i激活被中的NS1几乎抑制基底的水平(图7 b)。最后,我们试图确定内源性Riplet老鼠的角色rig - i泛素化,同时解决是否NS1专门对抗mRiplet-induced rig - i泛素化。为此,我们研究了rig - i的泛素化在Hepa1.6细胞内源性Riplet沉默使用特定的核(图7 c)。78%击倒的效率是实现由non-silencing相比,rt - pcr分析控制核(数据没有显示)。特定击倒的内生Riplet强烈降低内源性rig - i泛素化(图7 c)。此外,中的NS1有效地阻止rig - i的泛素化在细胞转染non-silencing控制核,虽然NS1没有影响残余泛素化rig - i在Riplet-knockdown细胞(图7 c)。这些结果共同表明Riplet鼠标rig - i是一个重要的在E3泛素连接酶,这NS1专门针对Riplet抑制rig - i在小鼠细胞泛素化。

进一步证明Riplet有助于建立一个有效的抗病毒药物对流感病毒的反应,我们内生Riplet WT或沉默/ TRIM25−−mef使用特定的核,和评估流感PR8病毒复制(图7 d-7f)。mRiplet击倒的rt - pcr证实了(图7 d)。感染/ TRIM25−−细胞PR8病毒导致更高的空斑形成单位(PFU)与WT MEF细胞相比,突显出重要作用的TRIM25鼠标一个有效的抗病毒反应。此外,内生Riplet WT和siRNA-mediated击倒/ TRIM25−−细胞产生的水平明显高于病毒复制相比,转染non-silencing siRNA,最强的效果观察/ TRIM25−−mef Riplet的沉默(图7 e)。增加了病毒复制的Riplet-knockdown mef与增加在这些细胞(NS1蛋白水平图7 f)。综上所述,这些数据表明Riplet和鼠标TRIM25有助于有效的抗病毒反应。

人类流感病毒NS1蛋白结合,抑制人类Riplet

老鼠不是流感病毒的自然宿主,但事实上,所有NS1蛋白测试与鼠标Riplet,包括non-mouse改编NS1蛋白(禽流感或猪)表明,这是一个守恒在流感病毒逃避机制。因此,我们测试了如果人类Riplet与不同的NS1蛋白在病毒感染的上下文中。有趣的是,NS1从人类流感病毒(Tx91和Pan99)与人类Riplet (图8),这表明NS1绑定到鼠标的能力Riplet可能反映一个交互NS1 Riplet来源于其特定的主机。进一步证明人类Riplet NS1和生物之间的相互作用有关,我们比较的能力Tx91-NS1 PR8-NS1重组病毒抑制人类rig - i(的泛素化图8 b)。我们推断Tx91-NS1结合hTRIM25和hRiplet应该更有效抑制rig - i泛素化和干扰素诱导hTRIM25 PR8-NS1显示绑定。正如预测的那样,Tx91-NS1重组病毒更有效抑制人类rig - i泛素化与PR8-NS1病毒(图8 b)。因此,Tx91-NS1重组病毒诱导IFN-β信使rna的含量明显低于相比PR8病毒(图8 c)。最后,我们分析了IFN-β生产PR8——Tx91-infected A549细胞TRIM25击倒后,Riplet或两(图8 8 d和e)。siRNA-mediated击倒TRIM25和Riplet mRNA水平减少了约90%和80%,分别。此外,降价是非常具体的,针对TRIM25没有减少Riplet mRNA水平和亦然(图8 d)。沉默的内生TRIM25 PR8-infected细胞导致轻微但不显著减少IFN-β感应与细胞转染non-silencing控制核(图8 e)。相比之下,由Riplet-knockdown PR8显著降低细胞干扰素诱导与控制,和几乎相同的程度上Tx91引发的病毒控制细胞的水平。这些结果表明,虽然针对TRIM25 PR8抑制干扰素诱导的残余干扰素诱导(不被病毒)主要取决于Riplet。相反,击倒TRIM25或Riplet没有显著影响干扰素诱导Tx91-infected细胞。显著减少IFN-βmRNA水平只是观察到细胞TRIM25和Riplet就沉寂了下来(图8 e)。总的来说,这些结果表明,对于IFN-βTRIM25和Riplet都重要生产人类细胞在感染流感病毒。此外,虽然PR8-NS1主要目标TRIM25在人类细胞,Tx91-NS1与抑制TRIM25和Riplet在人类细胞抑制干扰素的生产。

细胞培养和转染

HEK293T(人类),海拉(人类),A549(人类),Hepa1.6(鼠标),维罗,L929细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC)。WT和/ TRIM25−−mef以前描述的[25]。所有细胞都维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺和1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL)。LMH(鸡)从写明ATCC购买、培养细胞在DMEM补充在烧瓶预涂0.1%明胶10%的边后卫,2毫米penicillin-streptomycin谷酰胺和1%。瞬时转染进行与TransIT-LT1 (Mirus)、磷酸钙(Clontech)或Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。

质粒

哺乳动物表达结构未加标签的NS1鸡β-actin启动子的控制下(pCAGGS向量[45])一直在前面描述/波多黎各/ 8/34 (PR8)和R38A / K41A突变NS1[41]),德州/猪/ / 4199 - 2/98 (Sw / Tx / 98),一个/波多黎各/ 8/34 E96A / E97A突变体,和一个/香港/ 156/1997[38],GST-PR8和加州/ 04/09 / NS1 (Cal04)[40]。人类TRIM25-V5人类rig - i和GST-RIG-I 2卡中描述[38]。老鼠TRIM25克隆小鼠LA-4细胞上标三世一步法rt - pcr(英杰公司)与正向引物(5′GAATTCACCATGGGCAAACCGATTCCGAACCCGCTGCTGGGCCTGGATAGCACCGCGGAGCTGAATCCTCTGGCC-3′)和反向引物(5′CCTCTCTATCTGCTCCAAATAGGGATCC-3′)。正向引物包括EcoRI站点和V5序列,和反向引物包括BamHI站点。V5-tagged鼠标TRIM25 cDNA当时subcloned EcoRI / BglII网站的哺乳动物表达载体pCAGGS。鸡TRIM25从初级克隆鸡胚成纤维细胞上标三世与向前一步法rt - pcr引物(5′- GAATTCACCATGGGCAAACCGATTCCGAACCCGCTGCTGGGCCTGGATAGCACCGCGACGTTGACCAAAGCTCAGTC-3′)和反向引物(5′- GGCACTGTTCTCTCTCTCTGGTAACTCGAG-3′)。正向引物包括EcoRI站点和V5序列,和反向引物包括XhoI站点。V5-tagged鸡TRIM25 cDNA当时subcloned pCAGGS到相同的网站。代V5-tagged人类/鼠标TRIM25嵌合体,TRIM25卷曲螺旋地区(aa191 - 379)被放大使用人类TRIM25-V5质粒为模板,然后结扎BstBI网站的鼠标TRIM25 pCAGGS向量序列。Myc / DDK-tagged pCMV6老鼠Riplet从Origene购买(马里兰州罗克维尔市)。记者带着萤火虫荧光素酶质粒(FF-Luc)基因的控制下IFN-β启动子(p125Luc)请提供隆Fujita(日本京都大学)[46]。记者质粒携带Renilla荧光素酶基因(REN-Luc / pRL-TK)购买从Promega WI。所有的序列被测序验证。

病毒

仙台病毒(签订;才能证明应变)是来自查尔斯河实验室和传播在为期10天的老鸡胚蛋。/波多黎各/ 8/1934病毒传播在老八,特定的无菌受孕卵(查尔斯河实验室;北富兰克林,CT)。流感病毒滴度测定空斑实验用MDCK细胞。

救援质粒编码的NS段/猪/德州/ 4199 - 2/98 /香港/ 156/1997,德克萨斯州的一个/ / 36/1991和巴拿马/ 2007/1999是由双义的cDNA克隆到质粒pDZ中解救出来[47]。救援质粒编码/加州/ 4/2009 NS是前面描述的[48]。同基因的A型流感病毒(/波多黎各/ 8/1934)窝藏的NS段/猪/德州/ 4199 - 2/98或/香港/ 156/1997获救的反向遗传学所描述的其他地方[38],[49]。/波多黎各/ 8/1934病毒表达NS1 R38A / K41A或NS1 E96A / E97A突变是前面描述的[38]。所有的病毒被放大在老八,具体无菌受孕的鸡蛋(查尔斯河实验室;北富兰克林,CT)。

干扰素生物测定

干扰素生物进行了如前所述[38],[50]。不灭的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),播种在12-well盘子,感染了表示同基因的流感病毒在感染复数(MOI) 2。在12 h postinfection,上层的流感病毒的收获和2倍稀释浮在表面的准备。稀释浮在表面的被应用到生物测定使用不灭的小鼠成纤维细胞(L929)细胞;在20 h后处理,L929细胞感染VSV-GFP莫伊的2。GFP荧光是由荧光板的读者。荧光值都报道了y轴相对荧光单位。

销售税拉试验、免疫沉淀反应和免疫印迹分析

HEK293T, Hepa1.6 MEF细胞细胞溶解在NP40缓冲区(50 mM玫瑰,pH值7.4,150毫米氯化钠,1% (v / v) NP40和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))或里帕缓冲区(50毫米TRIS-HCl pH值8.0,150毫米氯化钠,1% (v / v) NP40钠脱氧胆酸盐0.5%,0.1% SDS和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))。销售税下拉和免疫沉淀反应进行如前所述[25]。蛋白质免疫印迹,解决了SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜(Immobilon-P微孔或BioRad实验室)。以下主要使用抗体:anti-V5(1∶2000)(表达载体),anti-Flag(1∶5000)(σ),anti-HA(1∶5000)(σ),anti-GST(1∶2000)(σ),anti-TRIM25(单克隆;1∶2000)(BD生物科学),anti-TRIM25(多克隆;1∶1000)(圣克鲁斯生物技术),anti-RIG-I (1∶1000) (Alme-1 Alexis) anti-NS1 (1∶2000)[38],anti-β-actin (Abcam;Cambridge, MA)。免疫印迹是以下二次抗体:ECL anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶结合整个抗体从驴,和ECL anti-mouse免疫球蛋白辣根过氧化物酶结合整个抗体从羊(通用电气医疗集团;英国白金汉郡)。蛋白质是由一个可视化增强化学发光试剂(皮尔斯)。

共焦显微镜

海拉细胞被播种到Lab-Tek II 8-well室幻灯片(CC2载玻片,Nunc;罗彻斯特,纽约)。12到16小时后,质粒窝藏V5-tagged TRIM25, Myc-mRiplet和/或NS1质粒转染Lipofectamine 2000(表达载体)比1∶1。六个小时posttransfection中被改变了。与PBS 24 h后,细胞被洗,固定与methanol-acetone (1∶1), permeabilized NP-40 0.5% (v / v)在PBS和屏蔽0.5% BSA 0.2%鱼明胶在PBS。细胞被沾anti-V5或anti-Myc anti-NS1抗体以及DAPI。二次抗体共轭Alexa-fluor 488年和555年Alexa-fluor(英杰公司)被用来可视化蛋白质。照片拍摄在徕卡SP5 DM共焦显微镜的放大(徕卡微系统)63×。共焦激光扫描显微镜在MSSM-Microscopy共享资源设施。

记者IFN-β荧光素酶检测

Hepa1.6细胞、WT mef和/ TRIM25−−mef转染在24-well板块(猎鹰,正欲,新泽西)50 ng IFN-β记者质粒,20 ng Renilla荧光素酶和10 ng NS1质粒使用Lipofectamine 2000比1∶2。24 h后,细胞是细胞溶解和dual-luciferase试验根据制造商的指示执行(WI Promega,麦迪逊,美国)。荧光素酶值归一化Renilla值,褶皱感应SeV-stimulated样本的比例计算,或与诱导质粒转染样本与样本与空质粒转染(无刺激)。

直接的蛋白质相互作用分析

重组体人TRIM25(中描述[25]从XL1blue细菌)和鼠标TRIM25纯化伴Maltose-Binding蛋白(MBP)和carboxy-terminal国旗融合蛋白(MBP-h / mTRIM25-Flag)孵化了bacteria-produced重组销售税或GST-NS1 (PR8) 50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值7.4,150毫米氯化钠和0.1% NP40。TRIM25-NS1然后沉淀蛋白复合物和直链淀粉琼脂糖树脂(新英格兰生物学实验室),和绑定反应混合培养4 h在4°C。沉淀蛋白复合物被Coomassie染色解决通过sds - page和可视化。

siRNA-mediated击倒

瞬态击倒的内生Riplet鼠标Hepa 1.6和MEF细胞,播种在6-well盘子,是通过转染siGenome SMARTpool siRNA特定的鼠标Riplet (Dharmacon) Lipofectamine和加试剂(英杰公司)根据制造商的指示。最终浓度600海里的鼠标Riplet SMARTpool核,或600海里siGenome新核(Dharmacon)每口井的使用。Riplet击倒的效率取决于使用特定的rt - pcr引物。

击倒的内生人力TRIM25和Riplet A549细胞进行24-well板通过转染Lipofectamine RNAiMAX(表达载体)。10 picomols siGenome SMARTpool siRNA特定人类TRIM25或Riplet,或新控制核(Dharmacon)使用。40小时之后,细胞被感染了流感病毒不同的莫伊0.1 36 h。细胞然后收获qPCR分析。

击倒的内生TRIM25鸡LMH细胞(肝细胞性肝癌细胞株),播种在24-well板块,通过转染的siRNA特定chTRIM255′-GCGAGAUUUGCUGAGAGCUGAGUUU-3′(表达载体)。控制,LMH细胞转染的新控制序列5′-AAGGACGCUGAGGCCUAAUCCUGUU-3′(表达载体)。

定量聚合酶链反应

总RNA分离使用RNeasy工具包(试剂盒)和受到DNAse消化与涡轮DNAse (Ambion)。逆转录都使用了高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)。实时rt - pcr在384 -孔板进行了一式三份使用gene-specific底漆和Lightcycler480 SYBR绿色我主人(罗氏)在480年罗氏LightCycler混合。阈值使用2周期计算^nd每放大曲线导数最大的价值。使用ΔΔCt mRNA相对丰度计算方法[51]使用18 s rRNA作为参考和绘制褶皱变化相比mock-control样本。

统计分析

统计分析了使用棱镜(5.0版本,GraphPad软件,圣地亚哥加州美国)。学生的配对t检验,或者在定义情况下双向方差分析与Bonferroni测试后或确切概率法。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。