数据
文摘
最近出现的一种新颖的流行毒株,目前有强烈兴趣了解毒性流感病毒的分子特征。PB1-F2蛋白质从流行病学重要的甲型流感病毒株进行了研究,以确定其功能和毒性。使用27-mer肽来源于PB1-F2和嵌合病毒c端序列的设计在一个共同的背景,我们表明,诱导细胞死亡PB1-F2取决于贝克/伯灵顿介导细胞色素c从线粒体释放。这个函数是PB1-F2特定蛋白质/波多黎各/ 8/34,未见使用PB1-F2肽来源于过去的流感大流行毒株。然而,PB1-F2蛋白质三大流行毒株的20倍th世纪和高致病性H5N1亚型的增强肺部炎症反应导致增加病理。最近流行的季节性流感菌株没有这个炎性函数的能力,失去了PB1-F2蛋白的免疫刺激性活动通过截断或突变在人类适应。这些数据表明,PB1-F2蛋白导致大流行株的毒力当PB1基因片段最近来自禽流感水库。
作者总结
目前有很大兴趣了解流感病毒引起疾病。在本文中,我们探索流感病毒的作用PB1-F2蛋白质疾病。我们表明,导致细胞死亡的蛋白质的能力是通过线粒体介导的死亡通路控制的蛋白质称为伯灵顿或贝克。然而,这个函数只的蛋白质似乎相关限制的病毒,而不是过去的大流行毒株。相反,生成肺部炎症的能力是所有过去的流感大流行毒株的共同特征以及H5N1型高致病性禽流感毒株,仍然是一个重要的大流行威胁。似乎有可能这个炎性表型是禽流感病毒的新兴的储层特征,因此重要的新菌株,跨越物种屏障,并建立自己在人类。在哺乳动物肺、循环和适应这个函数通常是迷路了。值得注意的是,这部小说2009年甲型H1N1流感大流行菌株不能表达一个完整的PB1-F2。如果它获得一个功能齐全的,炎症PB1-F2通过重组,这预示着极大地增强了疾病的潜力。
引用:McAuley杰,Chipuk我,博伊德KL·范·德·N,格林博士,她从来是(2010)从H5N1和20 PB1-F2蛋白质th世纪大流行性流感病毒造成免疫病理反应。公共科学图书馆Pathog 6 (7): e1001014。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001014
编辑器:Kanta苏巴拉奥,美国国立卫生研究院、美国
收到:2009年12月17日;接受:2010年6月23日;发表:2010年7月22日
版权:©2010 McAuley et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:这里描述的工作是由小灵通赠款ai - 66349(果酱),ai - 44828 (DRG), ai - 40646 (DRG)和ALSAC赞助。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
第一次超过40年的时间里,出现了一种新型流感病毒从动物宿主和引起人类流感大流行[1]。与三大流行的20个th世纪,大多数疾病的新型H1N1大流行性流感病毒一直温和[2]。这种差异的原因发病机理尚不清楚,因为大流行性病毒的毒性的分子签名是不清楚。比较《创世纪》的三个20th世纪大流行表明,只有2独特的基因片段从禽流感水库可行性在任何情况下,血凝素(HA)和PB1[3]。是接受抗原新奇病毒达到大流行状态,需要解释为什么HA基因已经在过去的大流行。然而,小说的意义包含PB1基因片段的20倍th世纪大流行还不理解。PB1-F2蛋白的发现,这是翻译的+ 1阅读框PB1基因片段,可能是一个线索[4]。如果这个基因产物导致毒性,它可能作为标志的流行菌株的致病性。有趣的是,2009年的H1N1大流行性流感包含一个PB1基因片段,被认为是源于人类的病毒和猪大约15年来一直在进化[5],[6]。其PB1-F2开放阅读框被截断后预计11个氨基酸,因此可能非功能性表达。
PB1-F2短(87 - 90同上)甲型流感病毒蛋白质在2001年发现[4]。表达式后,迅速退化,它不需要病毒复制在蛋或培养细胞[4]。PB1-F2蛋白质被人体免疫系统,导致体液和t细胞反应在季节性H3N2感染或高致病性H5N1病毒[4],[7],[8]。PB1-F2已被证明的表达来提高病毒致病性甲型流感病毒感染的小鼠模型[9],[10]。
PB1-F2毒性及其函数的精确的贡献在甲型流感病毒在哺乳动物宿主的生命周期尚不清楚。的c端部分PB1-F2开放阅读框包含一个线粒体靶向序列[4]。完整的表达PB1-F2线粒体靶向和细胞凋亡有关[4],[11]它已经表明,线粒体与随后的细胞死亡可能导致毒性破坏[11],[12]。建议第二PB1-F2蛋白质的功能,造成免疫病理通过增强炎症反应,已经证明了流感疾病的动物模型[10],[13]。这种机制增加致病性尤为引人注目的从1918年大流行毒株PB1-F2时表示,为临床相关性[10],[13]。最后,PB1-F2蛋白质已被证明PB1体外结合,和已经提出,这可能提高转录增加核保留时间[14]。下游影响复制预测增强毒性。但是我们最近证明,这第三个属性PB1-F2程控和病毒株特定不会导致病毒性肺负荷或致病性体内的变化[15]。
建立在我们最近的报告检查结果PB1-F2在病毒复制的影响[15],我们这里分析PB1-F2蛋白对发病机制的贡献在小鼠模型的上下文中提出的其他两个机制,细胞死亡和增强炎症。展示人类疾病的相关性结果,PB1-F2蛋白质来自各种流行病学的重要甲型流感病毒菌株包括所有从20大流行毒株th世纪,高致病性禽流感病毒H5N1亚型,季节性和代表菌株被利用。我们这里显示的能力通过PB1-F2介导线粒体相互作用导致细胞死亡是特定于实验室应变/波多黎各/ 8/34 (H1N1;PR8)在病毒研究,认为这个函数可能不是一个因素在人类致病性与大多数流行病学相关菌株。然而,能力增强的炎症反应是一个一般特征PB1-F2 PB1基因所编码的蛋白质直接介绍鸟类的基因库。这些PB1基因导致的形成大流行毒株的20个th世纪,从目前流行的高度致命的H5N1病毒,构成了一个迫在眉睫的大流行威胁。这些发现的意义为未来当前H1N1大流行性流感的大流行准备和理解进行了讨论。
结果
PB1-F2诱导细胞死亡的病毒株具体
流感病毒有能力破坏宿主免疫力的几种机制。有人建议,下调宿主免疫反应的细胞凋亡PB1-F2反应免疫效应细胞的毒性[12]。然而,PB1-F2对细胞死亡的影响有上下文;蛋白质的凋亡影响特定细胞类型,不同依赖整个病毒感染与表达PB1-F2孤独,和这一点只研究了应变PR8使用实验室。我们推断,如果这种机制形成的甲型流感病毒中不可或缺的组件策略下调宿主免疫反应的感染,然后诱导细胞死亡将由临床流行病学PB1-F2蛋白质从几个重要的甲型流感病毒株。
肽来源于PB1-F2 PR8, c端序列的三个20th世纪大流行株(1918、1957、1968),最近的高致病性禽流感病毒H5N1亚型,和最近的季节性H3N2病毒合成进行研究[10],[15](图1)。最近的季节性H1N1病毒表达的一种形式PB1-F2截断57氨基酸后,缺乏线粒体靶向序列位于c端区域,因此无法以这种方式被评估[15],[16]。这些多肽的二级结构预测是由圆二色性和匹配这一地区的报告结构作为长篇描述蛋白质和44-mer肽[17],[18](数据没有显示)。这些肽内化时提交给细胞体外,并观察到有类似的细胞内的分布和动力学退化一样完整蛋白质表达的病毒(图S1;文本S1)。
预测的氨基酸序列比较的临床流行病学PB1-F2蛋白c端区域的几个重要的菌株。彩色线底部的图表示预测的氨基酸组成螺旋区域(蓝色),本研究中使用的27-mer肽(绿色)和线粒体靶向序列预测(红色)。蓝色阴影突出了季节性预测的氨基酸序列差异(1995)和大流行(1968)H3N2病毒株。黄色阴影表明氨基酸参与的细胞死亡表型预测PR8(见讨论)。绿色阴影突出了N66S突变,预测1918年流行毒株毒力因素[13]。
首先,我们暴露了人类肺上皮细胞系A549和BalbcJ老鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7肽的小组的最终浓度为1小时50µm。评估通过流仪结果AnnexinV坏死+π+事件显示,只有肽来源于实验室应变PR8诱导大量的人类上皮细胞系A549细胞死亡(图2一个)。PR8和肽来源于1918年的流行毒株导致RAW264.7细胞(细胞死亡图2 b),但1918年A549肽没有影响。接触RAW264.7或A549细胞肽来源于病毒株来源于PR8以外或1918株并不影响生存能力,类似于接触氨基肽控制或未曝光的控制。有可以忽略不计AnnexinV+只有事件要么细胞系肽,这表明坏死的细胞死亡结果在这个试验,而不是细胞凋亡。
诱导细胞死亡的决心在人类上皮A549和小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系膜联蛋白的检测+π+事件后& B)接触小组27-mer肽来源于PB1-F2蛋白c端地区(见图1定义)的n端27-mer肽来源于PR8(最终浓度为每个肽50µM),或没有肽1小时;和感染的重组病毒方法病毒的定义;H3N2 PB1来自/武汉/ 359/95)在感染复数1.0 C)感染后12小时和D) 8小时。星号(*)表示显著性差异)所有其他肽和控制相比,B)肽和控制除了PR8和1918 C研发)所有病毒PB1基因部分来源于一种H1N1病毒和无病毒控制通过方差分析(p < 0.05)。
评估是否PB1-F2蛋白表达在病毒感染中也有类似的影响诱导细胞死亡,我们下一个感染A549的面板或RAW264.7细胞重组病毒的莫伊1到12小时。这个小组包括前所述病毒无法表达PB1-F2(ΔPB1-F2 / PR8),或表达的PB1-F2 1918流行毒株(1918 PB1-F2 / PR8)或截断1956 H1N1型流感(太阳PB1-F2 / PR8)[10],[15]。此外,两种前所述病毒[15]7基因段PR8背景(7∶1重组)和编码PB1基因片段的2004高致病性禽流感H5N1亚型(H5N1 PB1 / PR8)或1995个人类H3N2病毒(H3N2 PB1 / PR8)是利用及其同基因的缺失突变体为PB1-F2 (H5N1ΔPB1-F2 / PR8和H3N2ΔPB1-F2 / PR8)。使用共焦显微镜我们证明PB1-F2蛋白的病毒利用在这项研究中,有一个完整的PB1-F2 ORF表达和分布在整个细胞(图S2;文本S2)和[15]。
正如前面已经证明[4],[11],[12],PR8病毒诱发显著的细胞死亡而未受感染的控制(图2 c, D)。PB1-F2已被证明是在感染后6 - 8小时最大限度地生产这些细胞类型[15]只有最小的细胞死亡是欣赏前6小时后感染(数据未显示)。RAW264.7细胞PR8病毒感染时,坏死感染后死亡8小时达到高峰,而在A549细胞感染12小时后达到顶峰。ΔPB1-F2 / PR8无力表达PB1-F2和截断的c端部分太阳PB1-F2 / PR8废除的能力这两种病毒导致细胞死亡的细胞类型(图2 c, D)。然而,有趣的是,1918 PB1-F2表达式,与增强毒性有关[10],[13]在细胞死亡,没有造成显著增加控制。此外,删除PB1-F2一个H3N2或H5N1 PB1基因段背景并没有改变这些PB1s嵌合病毒的细胞死亡表型表达。我们从这些数据得出能力通过PB1-F2引起的细胞死亡是一个属性的特定菌株的致病性和不太可能导致20th世纪流感病毒大流行或最近的季节性流感。
PR8 PB1-F2促进贝克/ BAX-dependent线粒体外膜透化作用
有人建议PB1-F2能够诱导细胞死亡,破坏线粒体组织通过与内线粒体膜腺嘌呤核苷酸转运蛋白3 (ANT3)和线粒体外膜电压通道1 (VDAC1)产生一个线粒体渗透性转换[12]。或者,PR8 PB1-F2 permeabilize平面膜已被证明,因此可以直接permeabilize线粒体[19]。我们因此探测机制诱导细胞死亡的PR8 PB1-F2。我们假设PB1-F2 c端域可以促进线粒体外膜透化作用(MOMP)通过激活pro-apoptotic bcl - 2家族效应蛋白质伯灵顿和贝克。
为了验证这个假设,我们接触隔离从BALBcJ老鼠的肝脏线粒体获得各种浓度的PR8派生PB1-F2肽。分析细胞色素c释放表明肽来源于实验室应变PR8可以促进MOMP。PR8是鼠标适应实验室压力和初始实验利用只小鼠中完整的线粒体,我们重复肽暴露实验使用来自肝组织线粒体的鸡胚,远雪貂,绿头鸭。结果表明,PR8 PB1-F2衍生肽是一种有效的诱导细胞色素c释放和不特定物种(图3一)。只要10µm PR8 PB1-F2肽诱导细胞色素充足c释放每个物种进行了分析。作为不同的PB1-F2蛋白质可能显示物种特异性PB1-F2蛋白在线粒体定位,我们接下来检查MOMP和释放细胞色素c使用不同的c端PB1-F2肽的面板和一个氨基肽从PR8消极的控制。再次,只有PR8 PB1-F2能够促进MOMP (图3 b),无论该物种的线粒体。相比之下,线粒体的肝脏贝克- /伯灵顿- / -老鼠没有释放细胞色素c当孵化PB1-F2 c端肽(图3 b)。这些数据表明,细胞凋亡诱导的PR8 PB1-F2蛋白质是依赖于贝克/伯灵顿激活和MOMP。
A和B)分析MOMP通过检测细胞色素c释放肽的免疫印迹接触后面板(见图1重定义)的膜分数(线粒体)来源于鸡、鸭、雪貂和鼠标肝脏(B包括线粒体伯灵顿- / bak - / -老鼠)。线粒体)暴露于1,100和1000年µM PR8肽1小时显示释放细胞色素c进入上层清液(年代)。颗粒包含未释放的细胞色素(p)包含完整的线粒体c。B)线粒体受到细胞色素的肽面板和上层清液进行了分析c释放。C8-BID被用作积极控制哺乳动物线粒体。皮套裤溶解线粒体膜,使总细胞色素的释放c。建发)诱导的细胞死亡C)野生型和D)伯灵顿- / bak - / -小鼠胚胎成纤维细胞(mef)后1小时暴露在面板的肽(50µM最终浓度)。星号(*)表示显著差异相比,所有其他肽和控制通过方差分析(p < 0.05)。
确定贝克/伯灵顿依赖PR8 PB1-F2诱导细胞凋亡在细胞水平上,我们对野生型小鼠胚胎成纤维细胞(mef)和贝克- /伯灵顿- / -mef PB1-F2肽的面板和分析细胞凋亡。的PR8 PB1-F2衍生肽在野生型mef诱导细胞凋亡,但肽来源于其他病毒没有显示类似的活动(图3 c)。然而,细胞凋亡在贝克- /伯灵顿- / -mef是大大减少,这样PR8 PB1-F2诱导细胞死亡相当于细胞暴露在其他肽(图3 d)。综上所述,细胞色素c释放和凋亡数据暗示PR8 PB1-F2贝克/伯灵顿激活和细胞凋亡的线粒体途径,但表明,这种影响是特定于某些流感病毒株。
PB1-F2原因增加支气管肺泡灌洗液中细胞结构
PB1-F2蛋白质实验室病毒和临床相关的菌株已被证明有助于原发性病毒性毒性[9],[10],[13]继发性细菌感染的发病机理[10]在老鼠身上。这似乎并没有提出相关的能力PB1-F2增强复制或造成细胞死亡,这两个函数仅限于特定的病毒株([15]这报告)。因此,我们调查的贡献几个临床相关的PB1-F2蛋白质免疫病理反应。
老鼠暴露在小组PB1-F2衍生肽,安乐死24小时后收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)。c端PB1-F2肽来源于PR8,从1918年H1N1流感大流行株,1957年(H2N2)和1968年(H3N2),和2004年H5N1病毒引起的所有重要的大量白细胞BALF中相比,控制。一些细胞类型增加包括t细胞(数据未显示),树突状细胞(数据未显示),巨噬细胞(图4一)和中性粒细胞(图4 b)。有趣的是,肽来源于最近的H3N2病毒,一个/武汉/ 359/1995,没有造成对控制炎症细胞的显著提升。当肽暴露小鼠随访7天发病,引人注目的差异被认为比较五肽,引起炎症和1995年H3N2肽和控制。“促炎”肽引起蜷缩,耸起,呼吸困难,折边的皮毛和减肥在暴露后的第一个24 - 48小时达到高峰,而“非炎症”曝光没有造成临床症状(数据未显示)或减肥(图4 c)。因此,导致肺部炎症的能力似乎是一个属性PB1-F2蛋白质最近出现的禽流感基因库。H1N1病毒在人类传播自1950年有一个截断PB1-F2缺乏c端残留负责这种效应和与1968年大流行克制,最近流传H3N2病毒缺乏PB1-F2能够引起炎症。
组小鼠暴露于一组多肽(100毫米最终浓度,看到的图124小时后的定义)并被实施安乐死。BAL流体从动物被流式细胞术化验[10]的平均数)巨噬细胞和B)中性粒细胞比未曝光的老鼠或小鼠暴露于一个氨基肽的控制。星号(*)表示显著差异相比1995 H3N2肽通过方差分析和控制(p < 0.05)。两个星号(* *)表示与对照组相比差异显著。误差线指示的标准差的意思。C)在另一组实验中,小鼠暴露于肽监测明显的疾病和百分比变化从最初的体重。为了清楚起见,肽作为确定分组的炎症可能在A和B。
评估的贡献PB1-F2炎症的一个完整的病毒,在其他蛋白质的表达可能会导致炎症反应,我们利用先前描述的一组病毒PR8骨干在小鼠感染模型。与这些病毒数据之前报道,变更或废除PB1-F2没有导致体重显著差异,导致小鼠死亡所需要的剂量,或肺病毒滴度1、3、5和7天之后感染任何比较除1918 PB1-F2之前报道[10],[15]。然而,能够清晰的看到PB1-F2表达式的微分效应在肺部的炎症反应。中断PB1-F2 PR8或更换的表达式PR8 PB1-F2与c端截断时PB1-F2都显著降低BALF中白细胞的数量3天病毒感染(图5一个PR8相比)。这显著差异时维护专门评估大量巨噬细胞和中性粒细胞(图5 b, C)。表达的1918 PB1-F2导致类似PR8病毒的影响。使用包含H5N1病毒PB1基因段PR8背景显示中断PB1-F2表达也显著压低了炎症反应相比,病毒表达全长PB1-F2维护能力(图5 a, B, C)。与肽数据,然而,在协议没有发现差异可以归因于1995年H3N2 PB1-F2派生而来。
组小鼠感染的病毒(见方法感染后定义)和安乐死72小时。BAL流体从动物被流式细胞术化验[10]的平均数)白细胞、巨噬细胞,和C)中性粒细胞比未感染的小鼠或小鼠感染病毒表达PB1-F2缺乏能力。星号(*)表示显著性差异相比,动物感染ΔPB1-F2 / PR8或太阳PB1-F2 / PR8病毒和感染控制动物通过方差分析(p < 0.05)。两个星号(* *)表示一个重要的区别与动物相比太阳PB1-F2 / PR8病毒感染和未感染控制动物。三个星号(* * *)表明一个显著差异相比,动物感染了H5N1ΔPB1-F2 / PR8病毒和感染控制动物。误差线指示的标准差的意思。
PB1-F2引起肺部炎症变化
有确定PB1-F2驱动大量炎症细胞中可检测到肺部BAL液体,我们下一个评估的影响增强炎症反应在肺组织病理学改变。组的小鼠暴露于多肽的面板和安乐死24或72小时后检查肺部的一位经验丰富的兽医病理学家(K.L.B.)被蒙蔽的目的学习和小组的组成。在24小时计算,只有最小的血管周的变化观察和组间没有明显差异(数据没有显示)。72小时后曝光,然而,重要的病理学观察在某些组小鼠相比,镜像发病率见的二分法图4 c。只有最小的罕见,血管周围淋巴细胞浸润的小血管周围观察到小鼠暴露于氨基肽或多肽控制来自季节性H3N2病毒/武汉/ 359/1995 (图6 e, F)。然而,在小鼠暴露于肽来自从1918年和1957年大流行株,以及从2004年H5N1病毒肽,II型pneumocytes肥大和观察肺泡septae增厚。发现显著浸润的中性粒细胞和巨噬细胞在间质血管周的地区以及肺泡内空间(图6罪犯)。巨噬细胞严重超过中性粒细胞,镜像后发现BAL液肽(图4 a, B)。
组小鼠暴露于一组多肽(100毫米最终浓度,看到的图1定义)和安乐死72小时后。肺被移除,sufflated,切片,苏木精和伊红染色病理评估。代表40×部分所示从PB1-F2小鼠暴露于活性肽的蛋白质)PR8, B) 1918年H1N1, C) H2N2 1957 D) 2004年H5N1, E) 1995年H3N2,或F)没有肽控制。
在肺部的老鼠暴露在PR8肽,炎性变化被认为类似,但有一个额外的发现直接与纤维蛋白沉积,肺泡壁的破坏大量的坏死碎片填充肺泡,暗示细胞死亡(图6)。从这些数据和资料图4,我们得出这样的结论:暴露的主要影响哺乳动物肺PB1-F2蛋白质是一代巨噬细胞和中性粒细胞为主的炎症反应导致显著的免疫病理反应。改编后的H3N2人类,这个函数已经丢失。的附加功能PR8 PB1-F2蛋白质引起细胞死亡提高病理学中看到的动物导致糟糕的临床结果。在滴定板肽的老鼠,只有PR8肽引起致命的疾病(数据未显示),表明两个函数PB1-F2可能导致致命的病毒性肺炎。
评估这个炎性表型中一个完整的病毒,老鼠感染了WT PR8, 1918 PB1-F2 / PR8,ΔPB1-F2 / PR8,或太阳PB1-F2 / PR8安乐死72小时后病理检查如上所述。在所有肺部检查,病理变化的典型PR8观察病毒感染,包括血管周的浸润淋巴细胞为间质区域,区域的局灶性坏死终端航空公司和著名的细胞碎片与急性出血到肺泡(图7)。在小鼠的肺部感染PR8或1918年PB1-F2 / PR8,然而,更多的血管周的成套指出,可行和退化的外加剂组成的中性粒细胞和巨噬细胞。炎症细胞的数量在间质和肺泡明显在这些老鼠比小鼠感染ΔPB1-F2 / PR8或太阳PB1-F2 / PR8。这一发现支持的数据了图5和PB1-F2肽引起的病理学改变图6。染色为髓过氧化酶(MPO)强调了大量粒细胞及其引发的炎症小鼠的肺部感染PR8或1918年PB1-F2 / PR8和明显在这些肺相比更强烈ΔPB1-F2 / PR8或太阳PB1-F2 / PR8肺部感染(图7 b)。我们得出结论,表达完整PB1-F2增强肺部炎症在流感病毒肺炎和增加发生的病理损害。在感染病毒PR8等可能导致PB1-F2介导的细胞死亡和炎症的机制无关,增强肺损伤。
组小鼠感染病毒的面板显示(见方法感染后定义)和安乐死72小时。脾,肺被移除,sufflated)后,进行组织病理学检查与苏木精和伊红染色或B)应用程序MPO抗体特定的后跟一个辣根peroxidase-conjugated二级抗体染色chromagen轻拍,用苏木精复染色。
讨论
这里给出的数据证明甲型流感病毒的容量PB1-F2蛋白质提高肺部炎症反应在一个小鼠模型。本研究首次探讨PB1-F2利用PB1-F2蛋白质来自几个不同的功能,流行病学重要的甲型流感病毒株。这些压力包括那些包含小说PB1基因片段为20世纪所有流行菌株的形成和目前流行的高致命的H5N1毒株构成大流行迫在眉睫的威胁。由PB1-F2导致的炎症反应以增加细胞浸润到肺间质和肺泡空间,主要包括巨噬细胞和中性粒细胞。中病毒了,诱导的炎症PB1-F2被PB1属性限制蛋白质编码的基因片段,直接介绍鸟类的基因库。季节性病毒株已适应人类缺乏PB1-F2能够引起炎症。一个重要的警告是,这些实验是在PR8背景,所以进一步研究这些PB1-F2蛋白质在本土背景表示。我们分析几个动物物种的MOMP利用线粒体和细胞死亡的研究涉及PB1-F2表达涉及到PR8 PB1-F2贝克/伯灵顿激活和细胞凋亡的线粒体途径。然而,诱导细胞死亡通过线粒体协会只是特定的PB1-F2蛋白在这些研究和实验室PR8株不是所有PB1-F2蛋白质的一般属性。
所有流感病毒感染人类是人畜共患的基因片段重组由最终源自前体菌株的禽流感水库。欣赏一段时间,出现大流行毒株的要求之一是抗原新奇的哈,这促进了临床发作率高[20]。然而,大流行毒株的分子特征导致另一个标准,能够导致严重的疾病,目前尚不清楚。小说的包容PB1基因片段的毒性20th世纪大流行可能是一个有趣的线索。这里给出的证据牵连到完整PB1-F2蛋白表达,由+ 1开放阅读框编码PB1基因的一个组成部分,作为一个标记的致病性20th世纪大流行毒株。H5N1的促炎症功能PB1-F2证明了本研究提供了进一步的理由担心这个亚型代表一个严重的流感大流行的威胁,尽管禽流感病毒株之间存在显著的序列多样性和炎性表型的特定分子特征还不知道。全长PB1-F2蛋白质表达的几乎所有禽流感病毒株[16]血统,但分析这些菌株引入人类或猪后表明永久截断在哺乳动物适应主机。这种模式意味着有一些蛋白质的功能效用鸟类不是病毒在哺乳动物的进化优势。我们推测,这里描述PB1-F2的炎症性质有助于传播流感病毒的自然宿主利基在水禽,肠道,通过增加腔的分泌物。如果炎症诱导的肺是有害的或中性的哺乳动物宿主中病毒在其生命周期,随着时间的推移这个函数可能会丢失在适应尽管缺乏证据的积极选择压力的蛋白质[21]。这是一个明显的区域进一步研究相关的物种。
在人类中,H1N1 PB1-F2沿袭1918年引入成为截断约1948 - 1950 (图1),失去c端区域包含线粒体靶向序列[4],[22]和促进炎症(报告)。当前循环H3N2血统PB1-F2蛋白质仍然是完整的,但在适应过程中进化。在这项研究中我们证明PB1-F2源自1968年的大流行株可引起肺部炎症,但从最近流行的季节性H3N2不能。分析PB1-F2这些菌株c端区域的显示只有5个氨基酸差异被发现在该地区选择生成肽用于研究炎症(图1)。两种变化,在MTS K73R和R75H在位置显示丙氨酸替代为线粒体定位很重要[22]。然而,变化都是保守的,和一个/武汉/ 359/1995 PB1-F2显示了共焦显微镜(线粒体定位图S2)。这表明改变线粒体靶向的突变不负责表型的变化。一个明确的重点是了解哪些突变,或者是它们的组合,负责减少容量的1995 H3N2病毒产生炎症。这可能允许预测禽流感或猪PB1基因段前体代表大流行威胁他们归类到病毒跨越物种屏障。只有一个氨基酸的变化,1918 PB1-F2 N66S变化(图1),获得的毒性有关[13]。然而,66年代在位置没有必要以来的炎症反应增强其他炎性PB1-F2蛋白质研究不具备这残留在那个位置。
我们假设先进的早期作品之一[10]解释immunopathogenic表型的1918大流行毒株PB1-F2是前面描述的细胞死亡的表型[4],[11]负责杀死肺癌细胞的炎症反应导致激活本地主机防御。然而,细胞死亡之间的分离和免疫病理证明在这个报告中,特别是1918年PB1-F2无法激活线粒体细胞死亡途径,表明PB1-F2的免疫刺激性活动是一个直接的影响。PB1-F2表达过程中早期感染[10]和半衰期较短[4]。这表明这些触发炎症反应可能发生在感染早期,可能通过直接识别PB1-F2模式识别受体。找到潜在的PB1-F2约束力的合作伙伴在这个路径是明显的兴趣,是一个正在进行的研究的焦点。虽然在人类抗体生成可识别PB1-F2[7],尚不清楚这是否可以调节的功能结果PB1-F2表达式和减少疾病。这些研究的一个额外的警告是删除PB1-F2起始密码子被证明影响表达水平的截断版本PB1, N40蛋白质[23]。虽然N40超表达是改变病毒复制的研究没有显示,可能造成未知影响体内可能复杂化的解释我们的实验与PB1-F2淘汰赛病毒。
发现以来,人们一直认为PB1-F2蛋白选择病毒pro-apoptotic,针对线粒体和诱导通过协会和VDAC1 ANT3孔隙的形成[4],[11],[12],[19],[24]。ANT3 VDAC1分子主要组件的渗透率过渡线粒体膜的孔隙,使细胞色素c从线粒体释放,导致半胱天冬酶的激活途径和随后的细胞死亡。然而,这种离子通道激活,导致膜透性,氧化应激和线粒体钙含量改变[25]。凋亡通路周围的大多数可用的数据表明,贝克/伯灵顿中介细胞色素c释放(而不管组件的渗透率过渡孔复杂涉及)马克凋亡细胞死亡,而细胞色素c释放完全由VDAC和ANT意味着non-apoptotic,主要是坏死细胞死亡[26]。我们的结论,在病毒检测,只有PB1-F2 c端域PR8实验室的压力有效地从事贝克/伯灵顿通路。存在的依赖贝克/伯灵顿的表情PR8诱导孔隙形成线粒体定义了角色PR8 PB1-F2 BH3只有蛋白质激活线粒体内的伯灵顿复杂的构象变化。是否这个复杂导致协会VDAC / ANT离子通道的形成,或激活伯灵顿复杂只会导致孔隙的形成和随后的细胞色素c释放,目前不知道。
分析5944年PB1-F2蛋白质的氨基酸序列预测流感研究数据库中可用[27]上下文中的这些数据表明ILV氨基酸68 - 70的主题PR8 PB1-F2 ORF可能参与细胞死亡的表型(图1)。这是唯一的c端部分面积PR8序列不同PR8与其他菌株之间的研究。68我和69 l中只有17 5944序列,从人类的病毒。在场的70 v总是当我68和69 l。14这些病毒的传播在1933年和1947年之间,H1N1亚型,且仅2病毒发表PB1-F2序列从这个时代不分享这个主题。这个主题的其他3病毒/维多利亚/ 68 (H3N2),一个/ TW / 3355/97 (H1N1),和一个/俄罗斯:圣。彼得堡/ 8/06 (H1N1)。1918年的大流行毒株已经从氨基酸序列冠捷68 - 70;这个主题是共享的只有8其他序列数据库中可用。这种不寻常的主题在这个位置和分享70 v替换PR8可能占1918 PB1-F2能力有限导致坏死体外(图2),虽然需要进一步的研究来证实这一假设。本报告的其他病毒研究更常见的主题在这三个位置,F和S是常见的在71位置使它不太可能担当这一任务。好映射所需的特定氨基酸导致细胞死亡表型需要更好地确定哪些病毒可能会利用这一机制,这是否占1918 PB1-F2的能力有限也会导致一些细胞死亡,以及可能回归这种表型的突变必要的序列。然而,目前的数据表明,它是一种罕见的特征在现代季节性病毒和动物宿主。
2009年的H1N1大流行性流感病毒的出现增加了紧迫感理解流感病毒的毒性的分子基础。当前循环流行毒株不编码长篇PB1-F2蛋白质,所以不会将导致肺部炎症前流行菌株有效。此外,自从PB1-F2已被证明是一个主要的毒力因素的成因和严重性继发细菌感染[10],我们和其他人预计,细菌性肺炎这个大流行期间频繁的并发症会低于20th世纪大流行[28]。事实上,尽管细菌超级复杂超过95%的死亡在1918年的大流行[29]、细菌性肺炎在尸检时发现只有29%的人死亡,是迄今为止的评估当前的大流行期间[30]。这可能改变如果H1N1大流行性流感获得全长PB1-F2通过降级的两个停止密码子PB1-F2 ORF或重组病毒编码长篇PB1-F2。被降级,H1N1大流行性流感的全长PB1-F2更像1995年比1968年大流行前体H3N2病毒,预测残留73 r, 75 h和79 q (图1)。它还缺少PR8特定氨基酸序列在68 - 70。在此基础上分析和数据呈现在这项研究中,不太可能降级的停止密码子或重组PB1基因片段与目前流行的季节性流感菌株为大流行性流感病毒提供功能,促炎PB1-F2。的确,虽然这手稿在修订公布的数据表明,遗传降级停止密码子的H1N1大流行性流感菌株产生完整PB1-F2只有最小对毒性的影响和支持继发细菌感染[31]。然而,不太可能场景禽流感或猪流感病毒的重配功能齐全的PB1-F2仍有可能,预示着增强毒性和增加继发细菌感染的发生率和严重程度。
材料和方法
细胞系和病毒感染
Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)是生长在最小的基本培养基(MEM)补充10%热灭活胎牛血清(的边后卫),2毫米谷氨酰胺和抗生素。A549细胞生长在F12K中补充10%的边后卫,2毫米谷氨酰胺和抗生素。永生化mef主要由使转染,unpassaged mef SV40基因组DNA使用Lipofectamine 2000(标准条件,英杰公司)和选择集落形成和增长。SV40野生类型和无限增殖贝克−−/伯灵顿−−/。293 t, MEF和伯灵顿−−/贝克−−/MEF细胞在DMEM培养基补充10%的边后卫和抗生素。细胞培养是维持在37°C公司5%2孵化器。细胞被洗一次磷酸缓冲盐(PBS)感染的病毒所示表明感染复数(MOI)和进一步孵化如前所述[10]。
代的质粒和病毒
一组质粒生成pHW2000骨干所描述[15],[32]PR8 PB1基因片段的编码,一个/越南/ 1203/04 (H5N1)或/武汉/ 359/95 (H3N2)。在这些背景,开放阅读框PB1-F2中断通过改变起始密码子(由PB1编号T120C突变)所以翻译不会启动和插入一个终止密码子11残留物(C153G),以确保完成之后1淘汰赛[9],[10]。的PR8 PB1-F2序列进一步改变QuikChange定点诱变(Stratagene)所描述[10],[15]所以,表达的蛋白质是相同的/胡尔汀/ 1/18 (H1N1;1918 PB1-F2)或/北京/ 11/56 (H1N1;太阳PB1-F2)病毒。在任何情况下这些突变PB1-F2阅读框造成非同义突变PB1阅读框。N40起始密码子[23]是完整的质粒。这八PB1质粒被纳入一套对应的八个病毒7基因PR8骨干(7∶1)反向遗传学描述[15]。导致病毒获救MDCK细胞通道然后传播一次鸡蛋对股市在这些研究中使用。所有病毒完全测序,以确保没有救援和无意突变发生在病毒传播,然后在组织培养的特点和鸡蛋如前所述[33]。表达式或缺乏PB1-F2蛋白质的表达是确认所有病毒通过使用共焦显微镜(图S2)。
肽一代
使用预测从PR8 PB1-F2蛋白质的氨基酸序列,胡尔汀/ / 1/1918,1 /新加坡/ 1/1957 /香港/ 1/1968 /武汉/ 359/1995 /越南/ 1203/2004,从c端端肽合成所描述[10]。该地区覆盖始于61年在氨基酸和扩展的终止蛋白质(通过PR8序列)氨基酸87 (图1)。额外的氨基端肽合成PR8序列作为一个积极的控制(MGQEQDTPWILSTGHISTQK)作为描述[10]。多肽合成在一个顶点396多个有机合成器(肯塔基州Luisville Aaaptec)或从GenScript购买公司(皮斯卡塔韦,NJ)。立即使用在动物或细胞培养之前,肽在PBS停牌1毫米的浓度。
细胞死亡分析
肽进行了接触分析96年圆底组织培养的菜肴,而病毒感染在24孔板进行了分析。细胞被播种密度1×106细胞/毫升30分钟(肽化验)或隔夜感染(病毒化验)媒体与BSA(细胞生长媒体代替FCS)。细胞被暴露于50嗯(最终浓度)的肽1 h,或感染病毒的莫伊表示时间从2-12h不等。细胞从上层清液层被收获,清洗和沾APC标签膜联蛋白和Propidium碘(PI)(加利福尼亚州圣何塞,正欲)20分钟。最后洗步骤后,细胞在100年resuspended ul流式细胞仪清洗缓冲(PBS包含3% BSA和叠氮化钠0.01%)和流式细胞仪分析了石中剑(BD生物科学)和BD CellQuest Pro软件(版本5.2.1,BD生物科学)。被定义为Annexin-V坏死细胞事件+和π+,而凋亡Annexin-V事件+只有。可行的细胞被认为是Annexin-V和π积极。
线粒体分离和细胞色素c的释放
厚膜分数(称为线粒体)纯化从10克的新鲜肝脏(鸭、雪貂和鼠标)或20鸡胚胎第14天,使用dounce同质化和差速离心的海藻糖线粒体隔离缓冲区(海藻糖TMIB: 300毫米,10毫米HEPES-KOH pH值7.4,10毫米氯化钾,EDTA 1毫米,1毫米EGTA, 0.1% BSA)。MOMP化验,线粒体是孵化TMIB补充到110毫米氯化钾(海藻糖线粒体分析缓冲区,TMAB),±caspase-8裂解鼠标报价(研发系统)或肽(最终浓度表示的文字和图传说)60分钟37°C。反应被分离成上层清液和颗粒在5500×g离心5分钟和anti-cytochrome sds - page及免疫印迹分析c。上层清液和颗粒分数是分开使用标准XT 4 - 12%的凝胶系统(Bio-Rad) 1 x拖把缓冲区在150 V。蛋白质被西方标准条件下,转移到硝基阻塞在5%牛奶/ TBST和主要的抗体(阻断缓冲区:细胞色素c1∶2000,克隆7 h8.2c12 Pharmingen)孵化一夜之间在4°C。二级抗体阻断缓冲区(1∶5000)在25°C孵化前1小时标准增强化学发光检测。MOMP化验,所有肽在无水resuspended DMSO(5毫米股票)N2环境、整除、储存在−80°C和解冻只有一次。获得贝克BAX-deficient线粒体,厚膜分数被隔绝polydIdC-treated的肝脏MxCre贝克−−/伯灵顿f /−老鼠。表示,总细胞色素c是由一个示例包含线粒体可溶性家伙0.5%。
感染动物模型
6 - 8周大雌性Balb / c小鼠(杰克逊实验室,巴尔港,我)在生物安全二级维护设施在SJCRH动物资源中心。所有实验程序是在全身麻醉下进行吸入异氟烷2.5%(百特医疗公司,迪尔菲尔德,IL)。传染性病原体和肽在无菌PBS稀释和鼻内接种量100 ul(50每鼻孔ul)麻醉老鼠在一个正直的位置。六到十组小鼠体重,每天至少疾病和死亡率。所有实验100 TCID感染剂量50,这些股票,也没有引起体重下降10 - 15%的死亡率。
为细胞cssessment落下帷幕
安乐死由有限公司2吸入,气管被曝光和空心塑料导管21个指标(BD Insyte,正欲,桑迪,UT)。肺灌洗三次1毫升的冷,无菌PBS。流式细胞术(流式细胞仪石中剑,正欲,圣何塞,CA)执行和白细胞(WBC)的数量每毫升决定(Hemavet 3700年,吸引了科学、达拉斯、TX)在BALF悬浮红细胞后消耗使用红色细胞溶菌作用解决方案(σ)。短暂的细胞被沾1 ul / 106细胞Gr1一起(FITC) / F480 (PER-CP) 20分钟,然后洗100年resuspended ul流式细胞仪清洗缓冲。中性粒细胞比例(Gr1一起+区域内的细胞)、巨噬细胞(F480+细胞内的地区)评估细胞的比例事件分析流式细胞术与白细胞的数量/毫升。
组织病理检查
肺通过公司后立即被安乐死2吸入,sufflated一夜之间,中性缓冲福尔马林固定在10%。肺是常规处理,嵌入在石蜡和切割5点哦。病理检查,幻灯片被苏木精和伊红染色,显微镜下检查如前所述[10]。生产髓过氧化酶(MPO)受影响的组织通过免疫组织化学染色法检测了在SJCRH兽医病理学核心实验室。这样做是在LabVision autostainer在室温下使用tris-buffered盐水冲洗步骤之间。内源性过氧化物酶活性被孵化H为3%2O2(一家位于Humco TX) 5分钟。幻灯片是孵化兔子反髓过氧化酶(DAKO Carpinteria, CA,猫# A0398)在1∶1500 30分钟紧随其后孵化与辣根peroxidase-conjugated Rabbit-on-Rodent聚合物(BioCare医疗、和谐、钙、猫# RMR622) 30分钟。幻灯片5分钟孵化与chromagen轻拍(3、3′diaminobenzidine tetrahydrochloride,猫# K3466, DAKO)。苏木精(ThermoShandon, ta - 125 - mh)是用作复染色。病理分级和描述是由一个有经验的兽医病理学家(KLB)蒙蔽的组成团体使用前面描述的方法[33]。
支持信息
图S1。
吸收PB1-F2衍生肽进入细胞。J774巨噬细胞被孵化)n端PB1-F2肽:链霉亲和素:Cy2, B)链霉亲和素:Cy2,或C) C端PB1-F2:链霉亲和素:Cy2 5小时。代表部分如图所示。D)共焦荧光图像拍摄每20分钟从6 16小时的具体位置。代表细胞显示出PB1-F2肽的吸收,胞质分布,和退化在时间点如图所示。这优于完整长度的分布和动力学PB1-F2当表达病毒[15]就在几个小时之前,尽管肽浓度峰值以来病毒复制不是必需的。绿色染色代表PB1-F2,蓝色是核染色,和红细胞膜。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001014.s001
气管无名动脉瘘管的(3.60 MB)
图S2。
在感染细胞的表达PB1-F2。MDCK细胞被感染病毒或小组模拟感染,和表达和本地化的PB1-F2被12小时后共焦显微镜检查。没有检测到表达PB1-F2化验病毒改造这样的ORF PB1-F2蛋白质中断。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001014.s002
气管无名动脉瘘管的(2.71 MB)
确认
我们要感谢圣裘德儿童研究医院合作者的约瑟夫Opferman博士MxCre贝克−−/伯灵顿f /−动物,史蒂夫Otieno和理查德Kriwacki圆二色性分析,珍妮弗·彼得斯和塞缪尔·康奈尔细胞成像技术援助共享资源的共焦显微镜,艾米艾弗森技术援助,多萝西从兽医病理学核心——布什和帕梅拉·约翰逊组织学染色和免疫组织化学实验室的支持,和乔恩•Yewdell (NIH)提供针对PB1-F2的抗体。
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