IFNα/β和IFNγ受体基因敲除小鼠,129 WT非典冠状感染的老鼠生存

我理解的角色类型(IFNα/β)和II型干扰素(IFNγ)响应冠感染我们感染了干扰素受体/−−小鼠非典冠状病毒(Urbani)的后期阶段或者一个同基因的重组病毒mouse-adapted (rMA15)包含六个毒性修改突变[30]期待,mouse-adapted病毒可能显示更加突出比Urbani病毒致病性。Urbani病毒和等效icSARS重组病毒并不致命10-wk老BALB / c, C57BL6和129 WT老鼠,通常与峰值复制在肺部感染后(dpi)效价在2天之前被清除在未来2 - 4天没有临床疾病或死亡[26],[30]。相比之下,rMA15病毒是致命10-wk旧BALB / c小鼠减肥导致超过20%的感染后4天,死于感染后4 - 5天。我们感染了129 WT, I型干扰素受体基因敲除小鼠(IFNAR1−−)和I / II型双干扰素受体基因敲除小鼠(IFNAGR−−) Urbani病毒(图S1)和129吨级,IFNAR1−−和IFNGR−−/ rMA15病毒(图1)。

129年WT IFNAR1−−和IFNGR−−老鼠,临床表现包括减肥数据和发病率rMA15感染后都是相同的。129 WT, IFNAR1−−和IFNGR−−/老鼠感染rMA15病毒失去∼15%的体重到了第四天,然后稳步恢复在未来5天(图1)。相比之下,Urbani病毒感染小鼠体重继续增加通过的感染(图S1)。在这两种情况下,病毒滴度在第二天感染后肺部达到顶峰,接近∼5.0×10的滴度⁷空斑形成单位或TCID₅₀分别为/ g (rMA15或Urbani),和所有被天9感染后迅速清除。虽然病毒滴度∼5倍高IFNAR1−−/老鼠比129年滴度WT小鼠感染后5天,我们发现IFNAR1−−和IFNGR−−/老鼠没有易感性增加,发病机制或组织学结果rMA15或Urbani病毒感染。检查合作干扰素通路疾病的重要性,干扰素受体双淘汰赛(IFNAGR−−)老鼠Urbani病毒感染;没有见过病毒效价或体重增加比129年WT老鼠或单一干扰素受体基因敲除小鼠(图S1)。这些数据表明,I型和II型干扰素受体是冠的规定感染和致病的关键结果在老鼠身上。

STAT1保护小鼠免受rMA15和Urbani病毒感染

干扰素受体基因敲除小鼠的结果相比,先前的研究已经表明,STAT1−−/老鼠不清楚白天Urbani病毒感染后22[29]。我们感染STAT1−−/老鼠来评估是否缺乏下游干扰素信号蛋白导致非典冠状感染的易感性增加,并确定的感染和病理变化与毒性mouse-adapted病毒有关。重要的是,STAT1−−/老鼠感染rMA15病毒更容易感染疾病超过129 WT, IFNAR1−−或IFNGR−−老鼠。rMA15病毒感染后,STAT1−−/老鼠损失了15%的体重开始通过第四天,继续减肥一天9感染后(图1)。体重下降接近30%,老鼠垂死的,死于致命的感染。形成了鲜明的对比和符合之前的报道,STAT1−−/ Urbani病毒最初感染的老鼠体重增加129 WT老鼠一样,通过感染后12天(图S1)。然而,在接下来的15天他们显示临床疾病恶化,失去了重要的体重。他们白天没有恢复29感染后,30%的人死亡。

肺病毒滴度STAT1−−/老鼠还在每个计算测试相比高滴度在129吨级干扰素受体敲除小鼠,(图1 b)。当rMA15病毒感染,STAT1−−/老鼠在肺部的病毒滴度更高的峰值在第二天(∼10⁸空斑形成单位/ g),仍高达10 >⁶空斑形成单位/ g感染后9天,而129 WT小鼠清除病毒了9天。Urbani病毒感染STAT1−−/老鼠也表现出持续增加,病毒复制在肺部直到15天感染后病毒检测时只能通过第五天129 WT小鼠感染后(图S1E)。综上所述,这些数据表明,STAT1-dependent,干扰素I型和II receptor-independent通路中发挥着关键作用在调节冠感染后病毒间隙和生还。

肺病与rMA15病毒感染129年WT和干扰素受体和STAT1基因敲除小鼠

从不同品系小鼠肺部感染严重程度的组织病理学分析了冠(图2)。129 WT老鼠,rMA15病毒引起了剥露毛细支气管炎在2天感染后气道上皮细胞的重要细胞凋亡(出血性所指出的原子核,凝聚染色质和核起泡),积累凋亡碎片在航空公司和血管周的成套主要由淋巴细胞引起的。类似病变在BALB / c和C57BL6小鼠[26]。rMA15病毒感染主要是定位在第二天感染后气道上皮细胞(图3),不传播到其他地区的肺部和呼吸道。一些血管周的成套指出在第二天感染后的脉管系统。到第五天,剥露毛细支气管炎,阻塞进行航空的凋亡碎片和气道上皮细胞的凋亡很少观察到,尽管血管周的成套和混合淋巴细胞浸润的炎性反应嗜酸性粒细胞,中性粒细胞和巨噬细胞更突出。白天9感染后,剩下的由rMA15病毒引起的炎症感染主要是发现peribronchiolar地区(图2)。

组织学变化的肺IFNAR1−−和IFNGR−−/老鼠类似129 WT老鼠;中的炎症肺部分暂时相关病毒效价。在第二天感染后,剥露毛细支气管炎,其特征是重要的细胞凋亡和细胞死亡的观察气道上皮和开展航空被凋亡碎片阻碍。组成的混合浸润淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞被周围的支气管上皮细胞。到第五天感染后,整个肺部和肺泡明显炎症明显,导致轻度至中度肺炎。从129 WT老鼠在肺部,炎症是清理白天9感染后;最小的炎性浸润留在肺和小支气管旁淋巴细胞的外围。

在第二天与rMA15病毒感染后,肺部病变STAT1−−/老鼠区别那些129年WT, IFNAR1−−和IFNGR−−受感染的动物。到第五天感染后,肺部病变更严重STAT1−−老鼠,符合居高不下的病毒滴度(图2)。两个特征是显著的;首先,炎症的程度更严重STAT1−−老鼠,更大数量的巨噬细胞浸润到肺的所有领域,这一发现并没有看到其他鼠标菌株。第二,肺泡隔增厚是看到整个肺血管周围和支气管旁增厚。通过9天感染后,炎症继续增加STAT1−−/小鼠肺部炎症消退时129年WT IFNAR1−−和IFNGR−−感染的老鼠。在STAT1−−老鼠,整个肺部炎症无处不在与密集的浸润细胞的外围组织尤其突出。巨噬细胞持续渗透到大多数居住在肺泡间质。有趣的是,大疫源地包含密集成纤维细胞、巨噬细胞和淋巴细胞在肺部和分散的非典型大细胞被发现在整个焦点。焦混合炎性浸润被发现与广泛的纤维蛋白沉积。胸膜炎所指的胸膜破裂被认为在大多数样品。 This pathology was consistent with proliferative and organizing phase diffuse alveolar damage (DAD). It is noteworthy that similar pathologic lesions were seen in many fatal SARS cases[31]- - - - - -[34]。

肺病与冠Urbani病毒感染小鼠

病变发展中从天2到9 129 WT, IFNAR1−−和IFNAGR−−/小鼠接种Urbani病毒是类似129年rMA15-infected WT老鼠。2 - 3在天,有分散的支气管和细支气管坏死和白细胞迁移(CD3 + t细胞,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)通过血管壁peribronchiolar和血管周的地区,但扩展的损伤肺泡不突出(图S1F)。病毒抗原被发现在支气管和细支气管上皮细胞(数据未显示)如前所出版[35]。第五天,减少坏死的细支气管上皮但peribronchiolar和血管周的成套依然存在。在9天,坏死没有被观察到,只有小血管周的成套。在15天,22日,肺部大多是正常的,除了小血管周围和peribronchiolar成套的淋巴细胞。

在STAT1−−/ Urbani病毒感染的小鼠,有相似的分布的支气管和细支气管肺部病变和129吨级的老鼠在第三天,但是,随着越来越多的坏死和炎症。观察水肿peribronchiolar周围血管和更大的包含许多炎性细胞浸润淋巴细胞,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞和巨噬细胞。丰富的病毒抗原在细支气管上皮细胞(数据没有显示)。到第五天,细支气管上皮细胞与小坏死和再生的焦点peribronchiolar和血管周的炎症严重低于在第三天。周围的细胞碎片和纤维蛋白填充一些细支气管。蓝色的色调在血管周围水肿液,建议早期胶原沉积。病毒抗原是不太常见的上皮细胞,但丰富的细胞碎片的航空公司。在9天,炎症细胞增加残余周围炎性病变,有丰富的中性粒细胞和巨噬细胞的病变。在这些焦点标记上皮增生也见过。闭塞性细支气管炎被认为在一些航空公司和间质病变发展一些气道病变,其中一个扩展到胸膜和生产焦胸膜炎。 Much of the lung parenchyma was, however, histologically normal. Only a few cells or cell debris was seen expressing viral antigen. By day 15, a fibrinous pleuritis with pyogranulomatous lesions developed in 2 of 3 mice, with focal resolving parenchymal lesions including a few foci of chronic interstitial pneumonia but most of the lung parenchyma remained fairly normal. From day 15–24, a fibrinous peritonitis (图S2A)、胸膜炎和pyogranulomatous损伤脾脏、肝脏和网膜发达的主要病变可能导致疾病和死亡STAT1−−老鼠(图开通- f)。这些病变的特点是中央坏死面积与大量的中性粒细胞和巨噬细胞的外区。巨噬细胞的病毒抗原被发现在一些这些pyogranulomatous病变(图S2D,E)。浆细胞成为丰富在脾损伤24天(图S2G)。丰富的纤维化(被马森的三色的染色)被认为在脾脏和肝脏病变24天(图S2F)。小鼠的肺从15到24天的大多是正常区域的残留慢性炎症和几个pyogranulomas,其中一些包含病毒抗原。胸膜结节pyogranulomatous和纤维素性炎症。

原位杂交rMA15病毒感染肺部

我们确定病毒感染肺部的本地化过程中感染原位杂化。我们使用riboprobe非典冠状核衣壳的互补的RNA与放射性标记核苷酸可视化组织中的病毒RNA。原位杂交进行肺从129 WT, IFNAR1−−, IFNGR−−和STAT1−−/老鼠收获2天,5、9感染后。在所有4株小鼠,探测器信号主要是局部的在第二天感染后气道上皮细胞(图3一)。这与病理病变在第二天感染后气道上皮细胞。第五天感染后,病毒RNA几乎消除了129年从控制和IFNAR1−−/老鼠和程度略低于IFNGR−−老鼠。偶尔,一些细胞与病毒RNA在外围指出,符合低滴度的病毒在这些动物在第五天。白天9,没有病毒RNA信号129吨级的肺部发现,IFNAR1−−和IFNGR−−老鼠,对应于缺乏病毒复制在这个时间点。相比之下,肺的STAT1−−/老鼠重要病毒RNA信号在整个肺部,包括著名的分布的外围肺部感染后的早期和晚期倍。令人惊讶的是,但符合组织病理学发现,病毒RNA信号从细支气管的气道上皮细胞失去了白天9 STAT1−−/老鼠和被发现在整个外围的肺,突出集中在大焦紧凑排列的细胞。这些焦点对应突出焦点病变)中提到的彩色部分肺,这主要是由成纤维细胞、巨噬细胞和淋巴细胞(图3 b)。有趣的是,细胞碎片中可以看到这些焦点可能代表细胞溶解气道上皮细胞。

描述的炎性细胞浸润

我们观察到肺的病理之间的显著区别129 WT老鼠而STAT1−−/小鼠感染后rMA15病毒。调查STAT1是否影响炎性浸润,我们从酶分离出白细胞破坏老鼠的肺收获8天感染后巨噬细胞和细胞表面标记用于量化(CD11c⁻/ CD11b⁺/ GR-1^int/ MHCII⁺),中性粒细胞(F480⁻/ CD11b⁺/ CD11c⁻/ GR-1⁺)和嗜酸性粒细胞(CD11c⁻/ Siglec⁺/ GR-1⁻)人口129 WT和STAT1−−老鼠。在白细胞数量大于10倍的差异被发现129吨级至STAT1−−感染小鼠(表1)。所示表1,嗜酸性粒细胞人口从129 WT老鼠∼∼2%增加30% STAT1−−老鼠和中性粒细胞从129年的3%增至WT老鼠35% STAT1−−老鼠。另外,巨噬细胞的数量STAT1−−/老鼠的两倍多,129年发现WT老鼠。这些数字都和组织学的研究结果一致)染色法在感染后9天。

细胞因子和趋化因子蛋白和基因表达研究

我们使用实时rt - pcr和CBA分析量化mRNA和蛋白表达水平的变化几个先天免疫因素参与肺部炎症。具体来说,我们比较了感应的促炎细胞因子(TNFα、白细胞介素6、IFNγ和MCP1)表达的变化在感染肺匀浆通过分析CBA (图4 a, B, C和D)或定量rt - pcr来衡量的mrna水平Urbani病毒或rMA15病毒感染小鼠,分别为(图4 e, F, G和H)。

在Urbani病毒感染肺部,最小的变化被认为129年WT IFNAR1−−, IFNAGR−−/老鼠对所有4细胞因子(图4 a, B, C和D)。然而,在STAT1−−老鼠,显著提高蛋白质在不同的时间点表达模式,感染后9至15天达到顶峰。TNFα蛋白质含量稳步增长从第二天通过29天感染后,白细胞介素6和IFNγ蛋白质含量达到9天,之前减少模拟受感染动物的水平。MCP1天5 - 22之间的蛋白质含量增加而减少天29感染后。

病毒感染后细胞因子诱导rMA15与Urbani病毒感染(图4 a -)。比较细胞因子转录水平2天,5和9感染后,我们注意到一些相似点和重要的差异。129吨级rMA15病毒感染后,小鼠表现出10倍感应TNFα记录的第二天感染后,紧随其后的是逐渐减少的表达水平回到基线白天9。虽然IFNAR1−−/小鼠显示出类似的动力学129 WT老鼠感染IFNGR−−/老鼠TNFα表达导致持续上升直到9天。相比之下,STAT1−−/小鼠低基线水平TNFα表达式通过第五天,高水平的表达被指出后9天,对应于肺部炎症的高峰时间,之前死亡。

IFNγ和MCP1基因表达水平在129吨级rMA15病毒感染相似,IFNAR1−−和IFNGR——/老鼠。转录水平引起的第二天,然后通过减少9天。虽然STAT1−−/感染的老鼠表现出类似的趋势增加转录水平的第二天,表情IFNγ和MCP1水平通过9天感染后继续增加。最后,白细胞介素6的表达显示类似的动力学rMA15病毒感染了129 WT控制和IFNAR1−−/老鼠山峰在第二天,第五天减少到基线水平。IFNGR−−/老鼠显示动力学相似,但在第二天表达水平较低。白细胞介素6的比较、归纳STAT1−−/老鼠遵循着一个不同的模式,与高水平的表达在第二天通过9天感染后和持续的高水平表达。IFNβ、IFNα4 IL28B、IL18 IRF1和OAS1分析实时PCR从肺RNA孤立在rMA15 timecourse WT, IFNAR−−和STAT1−−老鼠(图S3)。IFNβ、IFNα4 IL28B, IRF1 OAS1显示感应的peek在2 dpi所有3株减少整个timecouse少数例外。IFNβ,IFNα4 OAS1显示持续或晚破裂在表达式的每个只有STAT1−−老鼠。有趣的是,IL18显示最小感应(∼1.5折)WT老鼠但更少IFNAR−−和STAT1−−老鼠。因此,细胞因子的显著差异表达模式指出STAT1之间,WT和IFNAR缺乏动物,通常WT和IFNAR−−/老鼠相同的表达模式而STAT1−−/老鼠被认为失去典型的监管控制和持续的高水平表达。

类型III干扰素并不在冠发病机制中发挥作用

STAT1的中介类型III干扰素(IFN L,λ)信号除了I型和II干扰素信号。IFNL最小但显著调节在WT 129感染小鼠在感染后的第二天通过9天邮报感染过程中减少(图5一个)。IFNL的受体是一个异质二聚体IL10Rb IL28Ra。/ IL28Ra−−老鼠已经生成的BALB / c小鼠背景但不是129 WT鼠标背景。因此,尽管与其他鼠标直接比较菌株是不可能的,这些老鼠的实验与冠仍信息。C57B6背景,Urbani病毒不会引起疾病或减肥但病毒复制在BALB / c小鼠的肺。由第二天感染后病毒达到峰浓度测定和感染是通过第七天来解决[36]。相比之下,rMA15病毒感染BALB / c小鼠白天4或5感染后引起死亡[30]。我们假设如果IFNL是重要的保护冠感染,病毒会更致命的老鼠缺乏IFNL受体和IFNL受体基因敲除小鼠将表明疾病而BALB / c小鼠不正常。进一步,rMA15病毒感染IL28Ra−−/老鼠可能会导致增强病理学减肥,更高的病毒效价,或增加肺部病理。

这个假设被接种BALB / c小鼠和控制测试IL28Ra−−/老鼠Urbani病毒,rMA15病毒或PBS。没有减肥BALB / c或IL28Ra−−/ Urbani病毒感染的小鼠(数据未显示),因此缺乏IFNλ信号没有加强临床疾病。肺Urbani病毒感染BALB / c和IL28Ra−−/老鼠收获2,4,感染后7和21天。我们发现没有区别的病毒滴度在肺部BALB / c和IL28Ra−−老鼠(图5 b)。肺部受感染老鼠)染色法进行了分析。Urbani病毒感染IL28Ra−−/老鼠产生轻微的炎症,达到第二天和解决感染后7天;复制模式在BALB / c小鼠(图S4A)。

rMA15病毒感染和/或引起体重下降> 20%死于4 - 5天感染后在BALB / c和类似的发现在IL28Ra−−/老鼠(数据未显示);到了第四天感染后失去了∼20%重量。肺在天收获2和4感染后和没有观察到病毒滴度的差异(图5 b)。两个鼠标菌株显示峰值在第二天2 - 3日志的病毒滴度降低到了第四天。分析了肺癌病理)染色。BALB / c和IL28Ra−−/小鼠显示出类似的高水平的炎症感染后在2和4天,但非常相似的病理结果(图S4B)。综上所述,我们发现没有作用在防止感染IFNλUrbani或rMA15株冠。

IFNLR抗体在IFNAR1−−老鼠

BALB / c和129 WT rMA15病毒感染小鼠有不同的反应;rMA15是致命的BALB / c小鼠,但仅在129年导致瞬态减肥/ Sv老鼠。分析敲出两种类型的影响我和III干扰素信号通路,我们对待IFNAR1−−/老鼠(129背景)和中和抗体IL28Ra, IFNλ所使用的受体。老鼠注射100µg anti-IL28Ra抗体在1天,1、3、5和7天感染后在文献中所述[37]。我们没有发现差异减肥或发病机制相比,这些老鼠rMA15小鼠注射PBS (图6)。减肥到了第四天感染后小鼠显示15%,但恢复了9天,结束在开始的重量。肺分析了2天,4和9感染后,没有显示出不同病理相比IFNAR1−−老鼠(数据未显示)。两组的老鼠显示上皮细胞在感染后2天剥蚀和修复和间隙9。病毒滴度在PBS注射小鼠仅略有增加,但差异无统计学意义。这表明我型和III型信号的抑制小鼠不增加rMA15病毒的发病机理和保护129只老鼠免受疾病。

范式的干扰素信号和保护

冠状病毒感染人类的快速发展从一个非典型性肺炎,急性弥漫性肺泡损伤和ARDS在第一阶段10天的急性肺损伤。在许多患者这是紧随其后的是一个组织的发展阶段后爸爸病毒清除。病态都伴有严重的临床结果和死亡,在老年人尤其突出。的分子机制和宿主信号网络调控这些进步最后阶段肺部疾病未知,但相当大的重要性,鉴于全球疾病负担。在我们实验室之前的研究已经证明,老老鼠感染重组病毒编码S糖蛋白从早期阶段或人畜共患冠状病毒发达ARDS,特点是透明膜和爸爸。在这份报告中,我们表明,STAT1缺乏小鼠尤其容易爸爸组织的发展阶段。

先天免疫系统中起着重要的作用在调节宿主对病毒感染的反应和促进早期的适应性免疫反应。类型I, II, III干扰素通常由不同的细胞数量和使用不同的膜结合受体获得进入细胞;I型使用IFNAR1, II型使用IFNGR和III型使用IL28Ra / IL10Rb。然而,所有三个共享一个共同的胞质信号蛋白,称为STAT1,转移到细胞核和诱导表达的多个重叠的干扰素调节基因(isg)[38]。删除任何或所有的信号组件参与STAT1的信号通路减少病原体的先天免疫反应和对一些细菌和病毒的易感性增加代理。缺乏干扰素受体小鼠表现出对西尼罗病毒的易感性增加[9]、流感[12],[39]、伊波拉病毒[11]病毒,朋友[40],RSV[7],[8]和脊髓灰质炎病毒[41](综述[42])。此外,相同的表型在STAT1−−老鼠,展示整个先天免疫途径的关键作用在调节疾病严重程度、病毒滴度和病理[10]。在鲜明的对比中,我们展示了矛盾的发现冠Urbani rMA15病毒诱发严重的肺病STAT1的结束阶段依赖机制,独立于干扰素受体I型,第二和第三信号。STAT1的数据点一个新颖的机制功能调节肺部疾病严重程度后冠诱导急性肺损伤。

急性肺损伤的新范例STAT1监管

与现有的范例,冠感染成功控制和清除IFNAR1−−, IFNGR−−, IFNAGR−−和IFNLR老鼠而删除STAT1不足导致增加了病毒复制,发病率和死亡率后感染的人类流行株冠(Urbani)或鼠标调整应变(rMA15)。这些结果暗示了小说STAT1监管机制的严重阶段结束后肺部疾病冠感染无关的角色在干扰素信号,研究小组的表情。虽然有可能合作若干干扰素的组合(IFNα/β,IFNγIFNλ),信号通过STAT1需要调节冠感染,我们认为可能存在STAT1在控制细胞增殖和伤口愈合的作用可能会增加疾病的基本原因在STAT1−−老鼠。然而,三重淘汰赛的发展影响3干扰素受体将解决这个机械的可能性。

选择角色STAT1

STAT1功能的关键看门人调停IFNα/β,IFNγIFNλ信号进入核诱导重叠但isg截然不同。不那么欣赏在病毒的发病机理研究中,STAT1也扮演着关键的角色在细胞周期阻滞和细胞增殖[43]- - - - - -[45]。因此,STAT1的缺陷可能会增加病毒肺病几个潜在的机制。STAT1被证明是一个重要的肿瘤形成的控制器在几种类型的癌症包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和脑癌[46]- - - - - -[48]及其在细胞增殖作用的上下文中研究了肺纤维化[43]。/ STAT1−−小鼠成纤维细胞显示增殖增加暴露在比WT小鼠成纤维细胞生长因子。此外,STAT1−−/老鼠表现出更大的敏感性通过博来霉素化学诱导肺纤维化治疗。这些数据表明,在先天免疫反应,STAT1可能作为细胞增殖的关键调节器和伤口愈合的反应[49]。我们的数据也表明,STAT1调节急性肺损伤后的伤口愈合反应可能与病毒感染有关,细胞周期调控中看到其他类似的疾病模型。

STAT1和冠

肺的STAT1−−/老鼠感染rMA15病毒发展到肺fibrosis-like疾病早期阶段9天。急性肺损伤(ALI)中看到这些肺接近损伤在ARDS,经常看到在人类严重的非典型肺炎[50],尤其在老年人。我们发现血管周的成套,肺泡实质崩溃,入侵和放大的巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞和成纤维细胞,最重要的是,大量的纤维蛋白沉积在肺部。这些病理发现镜子中看到阿里,肺纤维化和ARDS。

冠,像许多高致病性病毒一样,表达了几个蛋白质对抗干扰素传感和放大网络。冠ORF6块STAT1核进口[18]PLP块IRF3激活[51],NSP7[51],NSP15[51],ORF3b和N是干扰素拮抗剂[19]。重要的是,这些对手只有函数的上下文中冠离散宽容的细胞内感染。这表明,在感染细胞,多种途径抑制干扰素信号本质上可以创建统计−−/环境可能导致进一步在疾病病理学观察。与流感被描述,很可能一个细胞激素风暴大大加剧了致病的结果增加了针对未受感染的细胞。STAT1的损失其他细胞的基因敲除小鼠可能造成这里描述,伤口愈合的损失控制和诱导纤维化,导致致命的疾病状态的发展后冠的感染。

非典冠状发病的分子机制管理最近才开始被评估使用靶向基因缺陷的小鼠rMA15病毒的挑战。Myd88 Sheahan等人发现了一个角色,一个适配器蛋白质TLR信号,RAG1,必要的抗体生产,防止感染和疾病。/ Myd88−−老鼠一个增强的易感性rMA15 C57 / B6小鼠病毒感染[26]小鼠没有表现出和RAG1−−/增加发病率和死亡率rMA15病毒感染,病毒复制在肺部是通过28天感染后可检测的[26]。这些数据表明,一个错综复杂的先天和适应性免疫反应之间的平衡是必要的保护从冠感染。我们也正在了解这两个过程在宿主交互。利用蛋白质组学和微阵列分析卡梅隆等[22]表明个人幸存下来冠感染了先天免疫控制,研究小组和细胞因子的反应而个人发展到严重的疾病证明了一个不受控制的先天免疫反应,与高水平的研究小组和免疫球蛋白表达,增加细胞因子反应和抗体反应的蛋白质。缺乏监管的原因是不理解。

比较Urbani rMA15病毒

感染流行病(Urbani)和鼠标调整压力增加引起的冠STAT1的病理学−−老鼠。因此,似乎鼠标适应突变rMA15增强冠状的内在致病特性产生严重的结束阶段小鼠的肺部疾病。然而,冠Urbani利差从呼吸道进入脾脏和肝脏的STAT1−−老鼠。这表明,尽管损伤可能是由病毒感染引起,病理结果从宿主对感染的反应,尽管目前尚不清楚这是否代表一个正常模式的传播是否突变的病毒已经进化,促进和分布扩散到其他器官。类似的研究结果出现在尸检样本个体死于非典。航空公司完好无损和再生,而急性病例显示蔓延至外肺实质[52]。

之间的相似性STAT1−−/老鼠感染冠和老年人感染流行期间冠是有趣的。最近的研究表明,细胞从主机岁STAT1信号级联反应较低刺激;巨噬细胞是hypo-responsive IFNγ岁STAT1的信号[49]。是在我们的研究中,观察到IFNγ表达显著增加STAT1−−老鼠。我们推测这可能是为了应对缺乏通过STAT1负面反馈信号通路。在非典期间,岁人的队列最严重的疾病和死亡率最高[53]。我们建议改变STAT1信号岁个体可能导致严重疾病的易感性。

我们不能排除这种可能性,所有3种干扰素受体是冗余冠介导的疾病,只有删除所有3种受体将观察发病的增加。证据必须等待可用鼠标应变包含删除所有三个受体。然而我们发现产生的病理类型在STAT1−−/老鼠WT和rMA15冠演示了一个角色STAT1 non-innate免疫过程中产生严重感染冠患者相似的。

我们提出一个新的潜在通路STAT1的调节肺部疾病病毒感染后结束阶段。我们假设易感性的增加STAT1−−/老鼠细胞STAT1的结果从不同的角色。首先,STAT1的损失导致干扰素反应不足导致肺部的病毒滴度更高。其次,STAT1的损失允许不受监管的细胞增殖的先天免疫反应,导致增强肺损伤和死亡的动物。我们的研究结果还指出越来越作用的细胞损伤对病毒感染的反应,可以在高致病性呼吸道感染潜在的治疗靶点。

道德声明

所有的老鼠在这项研究中治疗后IACUC指南。感染小鼠预处理与氯胺酮和甲苯噻嗪作为麻醉剂。小鼠安乐死如果体重低于20%的体重或者临床症状开始保证我们每IACUC批准。住房和动物保健和实验性的协议都是依照UNC-Chapel山机构动物保健和使用委员会的指导方针或NIH的指导方针,根据实验的地方。

病毒和细胞

维罗E6细胞生长在MEM(表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10% FCII (Hyclone,南洛根,UT)和庆大霉素和卡那霉素(Gibco-BRL)。股票的生物学冠(Urbani),重组冠(icSARS)和mouse-adapted冠(rMA15)传播和效价在维洛维罗E6细胞冻存或−80°C到使用所述[30]。所有实验与传染性病毒在II级生物安全柜进行认证的生物安全三级实验室包含冗余的排气风扇与人员穿防护设备包括特卫强西装,头罩,HEPA-filtered驱动过滤呼吸器(地表铺面)所描述[30]。

老鼠

129 s6 / SvEv野生型和STAT1−−/老鼠(产品目录号002045 - m - f)得到泰康利农场(日耳曼敦,纽约)。鼠标改编冠感染,I型干扰素受体缺陷(干扰素α/β受体)(IFNAR1−−)小鼠饲养在UNC鼠标设备(北卡罗来纳州教堂山)。II型干扰素受体缺陷(干扰素γ受体)(IFNGR−−)小鼠(股票编号为002702)从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。Urbani病毒感染,IFNAR1−−/小鼠获得的礼物从琼德宾在俄亥俄州立大学博士和干扰素α/β/γ受体双淘汰赛(IFNAGR−−)在NIH小鼠饲养动物设施(马里兰州贝塞斯达)。IFN-lambda受体基因敲除小鼠(IL28Ra−−、发酵菌,西雅图,华盛顿)在北卡罗来纳大学教堂山分校的动物饲养设施。住房和动物保健和实验性的协议都是依照UNC-Chapel山机构动物保健和使用委员会的指导方针或NIH的指导方针,根据实验的地方。所有动物实验动物进行生物安全三级实验室使用SealSafe Hepa-filtered闭锁和人员穿着个人防护设备,包括特卫强套装和外套和正压Hepa-filtered空气呼吸器。十周大的老鼠麻醉的氯胺酮和甲苯噻嗪或异氟烷和鼻内感染了PBS单独或10⁵空斑形成单位/ 50µl rMA15或重组或生物流行病病毒,icSARS或Urbani, PBS(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。老鼠每隔24小时监控病毒诱导的发病率和死亡率。子集的小鼠安乐死在2天,5日和9 rMA15感染的感染后(dpi)表征,而低致病性Urbani病毒感染动物采样2天,3、5、9、15、22和29感染后。分析了所有组织对组织病理学改变和病毒滴度。

病毒复制的器官

量化的传染性病毒在组织从rMA15感染,每个器官重,放在0.5毫升DPBS,均质,通过空斑实验效价州立E6细胞如前所述[26]。Urbani感染,上层的10% (w / v)肺匀浆在维洛细胞单层膜上制备和滴定在24 - 96孔板如前所述[40]。表示为TCID的病毒滴度₅₀每克组织。检测的下限是10^1.5TCID₅₀/ g。

组织学分析

肺组织被固定在PBS / 4% para-formaldehyde, pH值7.3,嵌入在石蜡5µm部分被UNC准备组织病理学核心设施。确定炎症的程度,部分被苏木精和伊红染色(H & E),取得了失明的方式。

BD仪珠阵列(CBA)蛋白表达

上层清液的20%(重量/体积)肺匀浆被用于检测细胞因子和趋化因子使用BD CBA工具包(BD生物科学)根据制造商的指示。每个蛋白质的检测下限是包含在工具包的协议。

原位杂交

³⁵S-UTP-labeled riboprobes N基因的特定冠(Urbani)或从巴尔病毒EBER2基因(负控制探针)生成了一个SP6-specific MAXIscript在体外(Ambion)和转录工具包原位杂交进行如前所述[26]。简而言之,杂化了5×10 deparaffinized组织部分⁴cpm /µl³⁵S-labeled riboprobes过夜。通过分级组织洗,脱水乙醇,在“挪威通讯社”星期六报导放射自显影法乳液(柯达)涂层,孵化−80°C的7天。发展后,部分与苏木精复染色和银颗粒沉积由光学显微镜分析。相比rMA15-specific信号是由银颗粒沉积在并行部分杂化³⁵S-labeled riboprobe EBER2基因互补的巴尔病毒。

实时聚合酶链反应分析

非典冠状感染小鼠的肺模拟或直接删除并均质1毫升的试剂盒试剂(表达载体)和总RNA分离后制造商的指示。总RNA的互补cDNA生成从1µg使用250 ng随机引物(表达载体)和逆转录酶标二世(表达载体)。实时PCR实验使用Taqman基因表达分析,ABI棱镜7300(应用生物系统公司)。18 s rRNA作为内生控制用于在所有化验正常化。放大的相对折叠感应mRNA使用Ct检测方法。Taqman底漆集使用18岁(# Hs03003631应用生物系统公司),IFNγ(Mm00801778应用生物系统公司),TNFa (Mm99999068应用生物系统公司),MCP1 (Mm99999056应用生物系统公司),IFNB (Mm00439552应用生物系统公司),IFNA4 (Mm00833969应用生物系统公司),IL28B (Mm00663660应用生物系统公司),IL18 (Mm00434225应用生物系统公司),IRF1 (Mm01288574应用生物系统公司)和OAS1 (Mm00449297)。

流式细胞术

小鼠接种如上所述,牺牲放血在感染后2和4天,并通过心脏灌注肺穿刺1×PBS。肺解剖,剁碎,孵化2小时剧烈摇晃在消化缓冲37°C (RPMI, 10%的边后卫,消息灵通的15毫米,2.5毫克/毫升胶原酶(罗氏),1.7毫克/毫升DNase我(σ)]。细胞通过细胞40微米过滤器,resuspended RPMI媒体,分层在5毫升lympholyte-M (Cedarlane),并在2500 rpm离心机30分钟。收集细胞,洗了洗缓冲区(1×哈佛商学院,消息灵通的15毫米),和总可行的细胞由台盼蓝排斥。孤立的细胞被孵化与anti-mouse FcγRII / III (2.4 g2;在冰上BD Pharmingen) 20分钟,然后染色流式细胞仪染色缓冲区(1×哈佛商学院,1%的边后卫,2%正常兔血清)使用以下从eBioscience抗体:anti-F4/80-FITC, anti-Gr-1-PE, anti-CD11b-APC, anti-CD11c-PE, anti-Ly-6C-FITC, anti-CD3-FITC, anti-CD8-APC anti-CD4-PerCP, anti-NK1.1-PE。细胞被固定在2%多聚甲醛和分析在青色血细胞计数器(Dako)使用峰会软件。

统计分析

百分比从重量、病毒滴度和炎性细胞数量进行评估统计学意义差异的非参数Mann-Whitney测试在GraphPad棱镜或未配对t使用GraphPad InStat3软件。P≤0.05的值被认为是重要的。