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研究文章gydF4y2Ba

粘膜免疫抗原与铁受体预防尿路感染gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

简单的尿路感染,uropathogenic所致gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是最常见的疾病需要医疗干预。预防性疫苗减少发病率和财政负担这些感染的医疗保健系统将是有益的。在这里,我们描述大规模选拔过程的结果,结合生物信息学、基因组、转录组和蛋白质组屏幕识别六个候选疫苗从5379年预测蛋白质由uropathogenic编码gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变CFT073。候选疫苗,蔡,协会,宫内厅,IreA,铁,和IutA,都属于一个功能类的分子参与铁收购,这一过程在所有微生物发病机制的关键。鼻内接种的CBA / J小鼠这些外膜铁受体引起系统性和黏膜免疫反应,包括抗原IgM的生产,免疫球蛋白,IgA抗体。疫苗接种的细胞反应的诱导和分泌IFN-γIL-17。的六个潜在的候选疫苗,IreA,协会,并从实验感染IutA提供重要的保护。在免疫动物,class-switching IgM的抗原IgA免疫球蛋白和生产尿液代表免疫相关的保护gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba膀胱殖民。这些发现是一个重要的第一步发展的亚单位疫苗预防尿路感染和演示如何针对整个类所需的分子集体发病机理可能代表一个基本战略对抗感染。gydF4y2Ba

作者总结gydF4y2Ba

因为尿路感染(尿)是一种重要的医疗负担,这将有利于开发一种疫苗来防止简单的泌尿道感染所致gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。使用大规模筛选过程我们一致认为蛋白质参与铁吸收潜在的候选疫苗gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。铁收购是一个关键的功能需要由细菌引起感染。在uropathogenicgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,这个函数是由一种曲目中清除铁从主机系统的感染。我们发现疫苗接种与某些铁受体从这些系统足以引起保护性免疫实验尿路感染。诱导的抗体反应中发挥了关键作用,防止感染,因为抗体class-switching和尿液中抗体的产生与膀胱的细菌数量减少。针对整个类的分子参与铁收购而不是单个蛋白质,可以成功地识别组件的保护泌尿道感染的疫苗。这种策略可能是一个有用的方法发展的疫苗,以防止其他病原菌引起的感染。gydF4y2Ba

引用:gydF4y2BaAlteri CJ, Hagan EC Sivick KE,史密斯SN,莫布里停止与铁(2009)粘膜免疫受体抗原预防尿路感染。公共科学图书馆Pathog 5 (9): e1000586。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586gydF4y2Ba

编辑器:gydF4y2Bah·史蒂文•塞弗特西北大学范伯格医学院的美利坚合众国gydF4y2Ba

收到:gydF4y2Ba2009年2月23日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2009年8月24日;gydF4y2Ba发表:gydF4y2Ba2009年9月18日,gydF4y2Ba

版权:gydF4y2Ba©2009 Alteri et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。gydF4y2Ba

资助:gydF4y2Ba这项工作已经由公共卫生服务格兰特AI043363来自美国国立卫生研究院。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。gydF4y2Ba

利益冲突:gydF4y2Ba作者宣称没有利益冲突存在。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

尿道是最常见的细菌感染的网站。超过半数(53%)的女性和14%的男性经验至少一个尿路感染(UTI)在他们的生命中gydF4y2Ba[1]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[2]gydF4y2Ba,导致平均680万医生办公室访问,130万年急诊,每年245000人住院,每年超过24亿美元的成本仅在美国gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是传染病在80%以上的简单的尿,这发生在一个正常尿路解剖患者缺乏结构异常或炎性病变gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

除了泌尿道感染引起的急性膀胱炎和肾盂肾炎的症状,一些更严重的条件往往与这些感染有关。上尿路小孩子会对肾脏造成永久性损伤。估计有57%的儿童急性肾盂肾炎肾瘢痕gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。尿是经典与磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶或环丙沙星治疗根除感染病毒。然而,这些抗生素耐药性增加的文档gydF4y2Ba[6]gydF4y2Ba。此外,成功的初级处理后,复发性感染经常发生,估计有27%的女性经历最初的六个月内复发感染和2.7%经历第三次感染gydF4y2Ba[7]gydF4y2Ba。水库对再感染仍不清楚,同一品种集占25 - 100%的复发性泌尿道感染病例了gydF4y2Ba[8]gydF4y2Ba]。因此,这些并发症对泌尿道感染的治疗和构成重大挑战表明,预防泌尿道感染的疫苗将减轻这种发病率和经济负担的主要来源。gydF4y2Ba

事实上,一些团体试图刺激对UPEC保护性免疫力。早期研究利用各种荚膜和有限合伙人核心抗原和heat-killed细菌引起保护性免疫反应gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[10]gydF4y2Ba。最近,整个细胞或细胞提取物制剂已被证明在一些人提供适度的短期保护作用gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[12]gydF4y2Ba。因为他们的丰度在细胞表面,并演示了在UPEC发病机理中的作用gydF4y2Ba[13]gydF4y2Ba,菌毛有吸引力的目标定义蛋白质亚单位疫苗。例如,免疫接种1型fimbrial adhesin, FimH,共轭周质的伴侣,FimC,减少了99.9%的小鼠膀胱殖民化,以及在灵长类动物模型提供保护gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba。此外,基于其他几个surface-exposed亚单位疫苗分子如P菌毛(PapDG复杂),α溶血素,菌毛博士salmochelin受体铁,接合的荚膜多糖K13白喉类毒素至少可以诱导一些免疫动物的免疫反应gydF4y2Ba[16]gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba[20]gydF4y2Ba。然而,尽管许多研究都集中在疫苗的开发UPEC,没有可用的在美国。gydF4y2Ba

大规模的反向疫苗学的方法提供了一个替代传统疫苗的设计。开创成功的使用gydF4y2Ba脑膜炎奈瑟氏菌gydF4y2Ba,该技术适用于基因组和生物信息学方法识别新型疫苗的目标gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba。最近应用于extraintestinal致病性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaUPEC所属(ExPEC)致病型,一个减法杂交研究发现surface-exposed特定抗原ExPEC,发现其中一些蛋白免疫小鼠免受致命的败血症gydF4y2Ba[22]gydF4y2Ba。由于之前的泌尿道感染的疫苗设计的有限的成功策略,我们假设一个功能性疫苗学方法确定疫苗的目标UPEC以公正的方式可以引起保护性免疫。gydF4y2Ba

在这里,我们描述了使用先前建立的基因组学和蛋白质组学数据,以确定六其外膜铁受体(蔡美儿,协会,宫内厅,IreA,铁和IutA)作为公认的疫苗UPEC的目标。每一个71 - 84 kDa蛋白质预测形成跨膜beta-barrel外膜,与一系列的循环扩展进入体循环gydF4y2Ba[23]gydF4y2Ba。促进导入特定的铁源,这些受体调节的含铁细胞,分泌细菌iron-chelating分子,或主机heme-derived铁。因为铁收购对于细菌的发病机制是必要的,众所周知,尿道是iron-limited环境,铁收购通过这些受体UPEC感染是至关重要的gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba。因此,删除的含铁细胞受体IreA,蔡Hma)血红素受体,受体enterobactin宫内厅,salmochelin受体铁,或aerobactin受体IutA所有减少UPEC的健康小鼠尿路gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们证明了一个公正的,理性疫苗学方法一致确定一个类的分子参与铁收购候选疫苗,鼻内接种这些铁UPEC外膜受体提供了防止泌尿道感染。此外,我们表明,抗原抗体和细胞因子反应生成的反应与铁受体蛋白疫苗接种,其中,前者与保护。因此,我们建议这类分子承诺保护疫苗对UPEC和目标,因为他们保存函数的铁收购发病机理,可能采用其他革兰氏阴性细菌感染疫苗的发展。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

候选抗原的选择gydF4y2Ba

确定细菌的蛋白质可以作为疫苗目标对UPEC感染,我们利用一种功能性疫苗学的方法,结合基因组学和蛋白质组学技术。开始,目标是建立和数据标准定义UPEC疫苗从我们先前描述的研究来识别蛋白质组装满足这些需求。5379年的预测蛋白质gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肾盂肾炎应变CFT073,只有6个蛋白(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)符合我们所有五个建立标准:高gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba表达,诱导期间增长人类尿液表面接触,抗原性,pathogen-specificity。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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表1。gydF4y2Ba候选抗原和选择标准。gydF4y2Ba

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转录组和蛋白质组数据进行评估来确定候选人会议表达式和抗原性标准。数据从一个gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba转录组研究表明基因编码铁采集系统组件是最高度调节CFT073隔离尿液的CBA / J小鼠实验感染gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba。当所有基因表达水平的排名顺序gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba铁,这些铁收购基因,特别是外膜受体,属于前18%最高度表达小鼠尿路(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。同样的,当外膜蛋白(OMPs),分离从CFT073培养部分surface-exposed,在人类尿液gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba并与OMPs Luria培养基中培养细菌隔绝,这些铁受体是最高度诱导蛋白质gydF4y2Ba[30]gydF4y2Ba。此外,在列出的候选疫苗gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba由人类urine-induced OMPs六的前七。除了细菌从尿液分离,我们和其他组织观察到这些铁外膜受体的表达膀胱细胞相关UPEC,两者兼而有之gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba[32]gydF4y2Ba。最后,一个immunoproteomics研究发现这些铁作为抗原受体;也就是说,他们的反应与抗血清与UPEC小鼠慢性感染菌株CFT073,表明这些蛋白质引起体液反应在实验泌尿道感染gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

UPEC株代表菌株的一个子集,从共生的遗传学上截然不同的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,一种疫苗针对UPEC应该专门针对致病菌株。为此,比较基因组杂交研究发现131基因存在于所有UPEC菌株分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10),但是没有fecal-commensalgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba隔离测试(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba。在这些UPEC-specific基因两个编码外膜血红素受体,gydF4y2Ba蔡gydF4y2Ba和gydF4y2Ba协会gydF4y2Ba。此外,点污点分析UPEC和fecal-commensal的集合gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba分离鉴定其中的几个铁OMP基因(gydF4y2Ba蔡gydF4y2Ba,gydF4y2Ba协会gydF4y2Ba,gydF4y2Ba铁gydF4y2Ba,gydF4y2BaiutAgydF4y2Ba比non-pathogens)现在更频繁地在病原体gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba。甚至在尿路病原体基因在统计学上没有更频繁(gydF4y2Ba宫内厅gydF4y2Ba和gydF4y2BaireAgydF4y2Ba)不过现在在同桌的频率相对较低。gydF4y2Ba

5379年预测蛋白质UPEC应变CFT073,六个候选抗原,所有的铁外膜受体,从我们一系列的基因组学和蛋白质组学研究均匀高排名的潜在疫苗目标(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。这个筛选过程强烈建议广泛针对整个类的分子参与铁收购可能是一个有效的策略开发保护泌尿道感染的疫苗。gydF4y2Ba

疫苗接种授予保护实验泌尿道感染gydF4y2Ba

六个铁受体候选疫苗,蔡,协会,IutA, IreA,宫内厅和铁作为affinity-tagged重组蛋白表达和纯化。与这些抗原的预测结构一致,CD光谱的复合净化协会展示了槽在218海里,这是β-sheet-rich构象的一个特征(gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba)。六个纯化蛋白抗原都生化反应交联的佐剂霍乱毒素(CT) 10∶1的比例(抗原∶CT)和组的老鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 15 - 20)鼻内接种antigen-CT复杂或CT。主要免疫(0)天之后和升压剂(天7和14),这些动物经尿道的挑战与UPEC应变CFT073和保护评估在48 h后感染(hpi)通过确定cfu尿液,膀胱和肾脏。gydF4y2Ba

六位候选人的三个授予保护实验与UPEC挑战。血红素受体、协会、保护老鼠对殖民的肾脏。Hma-vaccinated老鼠证明近3-log减少肾脏CFU / g(中值gydF4y2BaPgydF4y2Ba13/20 = 0.008)和老鼠细菌中检测不到(< 100 CFU / g)肾脏(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。公认的含铁细胞受体IreA显示显著的保护和展示3-log减少膀胱(CFU / g中位数gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.035)(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。IreA, 9/15接种小鼠中检测不到细菌在膀胱。aerobactin含铁细胞受体,IutA,赋予重要保护UPEC挑战在膀胱和肾脏。小鼠接种IutA显示一个日志CFU / g减少膀胱(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.009)和肾脏(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.007)(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)。这表明,黏膜免疫的鼻孔在远端网站生成一个保护作用,膀胱和肾脏。并不是所有抗原选为候选人提供保护实验泌尿道感染。蔡美儿和宫内厅的重组蛋白交联的时候霍乱毒素未能引起显著的保护挑战UPEC应变CFT073 (gydF4y2Ba图1 a和CgydF4y2Ba)。所有的本地蛋白质疫苗在接种小鼠耐受性良好,没有动物死于疫苗接种,除了蔡,致命的老鼠在11/30(幸存的老鼠不保护)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图1所示。gydF4y2Ba与外膜铁受体免疫抗原可防止尿路殖民gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaCFT073。gydF4y2Ba

CBA / J小鼠鼻内接种疫苗所述主剂100µg纯化蛋白交联到10µg CT (a e)或100µg肽和10µg CT (F),其次是2增加25µg抗原交联到2.5µg CT或混合肽的CT。一周后,最终提高动物与1×10经尿道的挑战gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba现病史CFT073和殖民测量48。符号代表CFU / g组织或个人老鼠和酒吧/毫升尿液显示值的值。清晰的酒吧,单独与CT模拟接种疫苗;灰色酒吧、接种疫苗纯化蔡(A), (B)协会,(C)宫内厅(D) IreA, (E) IutA或铁(F)肽(浅灰色酒吧)或IutA(深灰色的酒吧)。虚线显示试验的检测极限,100 CFU / g。意义决心使用称为单侧Mann-Whitney测试。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.g001gydF4y2Ba

以来显著减少post-challenge CFU观察协会和IreA接种小鼠,这些抗原测试来确定相似级别的保护后可以生成不同的挑战与另一个UPEC隔离。20组小鼠免疫组织与协会,所述IreA,单独或CT和CFU测定48 hpi UPEC菌株536后的挑战。在这些实验中,协会接种疫苗的老鼠明显受不同的挑战和显示> 10倍减少膀胱(CFU / g中位数gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0287)(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。接种IreA显著保护小鼠免受感染UPEC菌株536和这些老鼠表现出log-fold减少肾脏(CFU / g中位数gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0379)(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图2。gydF4y2Ba免疫与协会和IreA减少殖民gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba536年。gydF4y2Ba

CBA / J小鼠鼻内接种疫苗所述主剂100µg纯化蛋白交联到10µg CT(圆圈)或CT(封闭的圆圈),其次是2增加25µg独自2.5µg CT或CT抗原交联。一周后,最终提高动物与1×10经尿道的挑战gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba现病史536和殖民测量48。符号代表CFU / g组织或个人老鼠和酒吧/毫升尿液显示值的值。清晰的酒吧,单独与CT模拟接种疫苗;灰色的酒吧,与净化协会或IreA接种疫苗。意义决心使用称为单侧Mann-Whitney测试。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.g002gydF4y2Ba

肽(30 aa)对应于单一预测细胞外循环在salmochelin含铁细胞受体铁(aa 491 - 520)和aerobactin受体IutA 467 - 498 (aa)也被评估以确定其作为潜在的免疫原。细胞外循环选择根据他们的预测拓扑直接反对暴露表面残留的抗体反应。这些肽也代表高度保守的内循环salmochelin aerobactin受体;铁肽身份37 > 90%含铁细胞受体序列包括尿路隔离536 UTI89和83972。IutA肽> 76%的身份(aa) 23/30 15 aerobactin受体序列中存在不同的致病性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,包括uropathogenic和extraintestinal隔离UMN026gydF4y2Ba[34]gydF4y2Ba、IAI39 S88gydF4y2Ba[35]gydF4y2Ba。组的老鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 15)接种如前所述肽与CT混合或单独CT和保护评估在感染后48 hpi CFT073 UPEC压力。这些肽未能引起显著保护尿液,膀胱,或肾脏的老鼠,然而,有近₂降低CFU / g的肾脏铁(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.053)和IutA (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.078)肽,展示一个强大的趋势保护(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)。这些结果暗示肽可能是适合发展的泌尿道感染的疫苗,但可能更有效的载体分子如果交联或融合。在一起,这些发现表明针对整个功能类的分子参与铁的收购是一个有效的策略来识别保护候选疫苗,显著减少细菌在提升泌尿道感染与UPEC实验挑战后殖民。gydF4y2Ba

抗原接种小鼠的脾细胞分泌IFN-γIL-17gydF4y2Ba

促炎细胞因子是编排对病原的保护性免疫反应的关键。两大促炎细胞因子的分泌介质,IFN-γIL-17A (IL-17),测量从小鼠的脾细胞免疫佐剂(CT), IreA(保护性抗原),或宫内厅(一个保护性的抗原)后接种疫苗。细胞分析预处理和post-challenge计抗原刺激的免疫应答gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。脾细胞培养gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在1µg /毫升的相应的用于免疫纯化抗原。上层清液中细胞因子测定ELISA 48 h后孵化。脾细胞从Iha-vaccinated IreA-vaccinated老鼠收集(+)(−)之前和之后都挑战了IFN-γ的重要抗原分泌和IL-17相比,相应的从CT控制小鼠脾细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(gydF4y2Ba图3 a和BgydF4y2Ba)。如果从任何组小鼠脾细胞缺乏可检测水平IFN-γ或IL-17(数据没有显示)。有趣的是,脾细胞来自宫内厅,IreA-vaccinated老鼠post-challenge不如pre-challenge促炎细胞因子分泌细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.003)(gydF4y2Ba图3 a和BgydF4y2Ba)。IFN-γ和IL-17分泌脾细胞明显减少post-challenge (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.003)在IreA-vaccinated老鼠(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba),而只有IL-17脾细胞分泌明显减少(gydF4y2BaPgydF4y2Ba与宫内厅(= 0.0007)在小鼠接种疫苗gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。整体而言,这些结果表明,接种小鼠产生抗原特异的细胞能够分泌IFN-γIL-17,两个重要的促炎细胞因子调节,以回应gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba引发刺激。没有发现显著相关细胞因子的生产和降低CFU post-challenge之间。然而,IFN-γ和IL-17分泌减少接种小鼠post-challenge pre-challenge相比只是观察到与抗原免疫后小鼠免受感染(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba),未见与保护性的抗原免疫接种后(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图3。gydF4y2Ba抗原接种小鼠的脾细胞分泌IFN-γIL-17。gydF4y2Ba

Iha-vaccinated脾细胞从(A)或(B) IreA-vaccinated没有挑战(−)或两天后经尿道的挑战gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaCFT073(+)与相应的抗原刺激gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。细胞因子被ELISA以文化上层清液。开放的圆圈表示CT control-treated老鼠和封闭的圆圈表示铁受体antigen-vaccinated老鼠。每个圆圈代表一个单独的动物和酒吧代表值。意义确定使用的小动物——一张长有Mann-Whitney测试。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.g003gydF4y2Ba

接种疫苗的老鼠分泌抗原IgA的尿液gydF4y2Ba

评估感染的体液免疫反应在主站点,膀胱粘膜,尿液的抗原IgA水平由ELISA测定。占的数量和浓度变化的尿液从每个鼠标,收藏是汇集用于间接ELISA测定抗原IgA。尿液从IreA - (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)和IutA-vaccinated (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)组,有显著降低膀胱殖民在挑战,褶皱增加IgA最高(分别为34倍和6.2倍)接种后。抗原并没有产生显著降低殖民接种小鼠膀胱的尿液更温和fold-increases IgA接种后(蔡协会的2.2倍,2.0倍,1.7倍和Iha) (gydF4y2Ba图4汉英gydF4y2Ba)。相应地,肽抗原代表细胞外循环的铁和IutA没有显著保护从膀胱感染,和IgA在背景水平在这些动物的尿液(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba)。这些研究结果表明,与抗原疫苗接种,IreA IutA,从实验提供重要的保护膀胱与UPEC挑战,产生重要的抗原诱导IgA免疫动物的分泌物中检测到尿液。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图4。gydF4y2Ba小鼠产生抗原尿IgA在鼻内的免疫反应。gydF4y2Ba

IreA-vaccinated尿液从(A)、(B) IutA-vaccinated, (C) Hma-vaccinated, (D) Iha-vaccinated, (E) ChuA-vaccinated peptide-vaccinated (F),相应的CT控制老鼠收集之前接种疫苗接种后(前)和前尿道挑战UPEC应变CFT073 (post)。混合样品在适当涂镀ELISA抗原IgA的盘子和探索。开酒吧代表CT控制老鼠和阴影从接种小鼠酒吧代表值。吸光度反映了IgA的相对数量。误差线表示的意思是+ /−SEM的两个实验。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.g004gydF4y2Ba

接种小鼠产生抗原血清抗体gydF4y2Ba

评估系统性体液免疫反应我们的候选疫苗,血清抗原抗体的水平由接种小鼠相比CT控制老鼠。血清收集了眼眶下的眼流血之前接种疫苗和疫苗接种后之前与UPEC应变CFT073经尿道的挑战。对于每个循环蛋白质和肽抗原检测,有一个显著增加相应抗原相比,接种后血清免疫球蛋白的pre-immune血清(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0002)(gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba)。在大多数情况下,免疫球蛋白水平之间没有差别的预处理和post-vaccinated血清CT控制老鼠。此外,所有接种后血清的水平明显高于有比pre-vaccination血清IgM (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba)。尽管IgG1 IgG2a从pre -增加接种后,没有斜向生产IgG1或IgG2a任何团体(数据没有显示)。蛋白质抗原这种现象并不罕见,因为他们可以刺激生产Th1、Th2细胞由于其广泛的MHC II级肽曲目gydF4y2Ba[36]gydF4y2Ba。所有样品测试显示明显的增加血清IgA(数据没有显示)。这些发现表明接种小鼠产生有针对性的抗体,和天生的IgM class-switched免疫球蛋白与iron-receptor滴鼻免疫抗原的反应。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图5。gydF4y2Ba抗原血清IgM和免疫球蛋白在接种疫苗的老鼠。gydF4y2Ba

ChuA-vaccinated血清从(A)、(B) Hma-vaccinated, (C) Iha-vaccinated, (D) IreA-vaccinated IutA-vaccinated (E), (F)铁和IutA细胞外环肽抗原和相应CT control-treated老鼠收集之前之前接种疫苗接种后(前)和经尿道的挑战UPEC应变CFT073 (post)。样本镀涂在适当重复ELISA板和探测相对免疫球蛋白和IgM。开放的圆圈表示CT控制老鼠和封闭的圆圈表示接种疫苗的老鼠。每个圆圈代表一个单独的动物和酒吧代表值。意义确定使用的小动物——一张长有Mann-Whitney测试。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.g005gydF4y2Ba

抗体class-switching和粘膜IgA与保护gydF4y2Ba

免疫球蛋白和IgM经常监测,以确定类转换经历了由B细胞的水平。在我们的研究中,所有动物接种疫苗证明明显增加血清免疫球蛋白和IgM pre -接种后。然而,协会、IreA, IutA-vaccinated(保护)动物显示更戏剧性的免疫球蛋白增加比IgM蔡——相比,宫内厅和肽环antigen-vaccinated(保护)动物(比较gydF4y2Ba图5 b、D和E图5 a, C,和FgydF4y2Ba)。这项研究表明,这些动物已经足够刺激类切换到更有效的抗体同形像。更多的定量评估这一趋势和血清免疫球蛋白和IgM的关系,防止泌尿道感染,我们首先计算一个类切换索引使用的数据从所有免疫小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 203)。类开关指数的比值变化中值血清免疫球蛋白的变化中值为每个组血清IgM接种疫苗的老鼠。占增加非特异性抗体,血清IgG、IgM的平均变化CT-treated鼠标军团从相应的减去antigen-vaccinated组值。类开关指数被谋害规范化post-challenge膀胱CFU / g中值来确定任何关系之间存在抗体class-switching从膀胱炎和保护。因为传染性可以不同的实验,从每个antigen-vaccinated CFU / g组中值除以平均CT组的CFU / g正常化。最后,两类开关指数和归一化值CFU / g值是日志gydF4y2Ba10gydF4y2Ba在线性范围内转换的比较。这一分析表明,类开关有显著相关性指数和膀胱的CFU / g (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0014)(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba),这表明减少膀胱殖民可能归因于的相对数量从IgM抗体class-switching免疫球蛋白与保护性抗原小鼠接种疫苗。从IgM抗体class-switching之间没有显著相关性被发现在肾脏免疫球蛋白和CFU / g。然而,和预期的一样,也有很强的相关性之间的抗原IgA的尿液和保护UPEC膀胱感染(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba);具体来说,增加尿IgA与减少膀胱CFU (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0165)。这些发现表明抗体class-switching和尿IgA是每一个免疫相关预防泌尿道感染所致gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图6。gydF4y2Ba同形像class-switching和泌尿IgA与vaccine-mediated免受感染。gydF4y2Ba

(A)类开关指数计算除以整个组的血清免疫球蛋白的吸光度变化接种小鼠(占非特异性免疫球蛋白增加减去相应的变化中值的吸光度CT-vaccinated鼠标队列)相同的计算预制组中位数IgM[(ΔIgG吸光度值gydF4y2Ba真空吸尘器gydF4y2Ba−ΔIgGgydF4y2BaCTgydF4y2Ba)/(ΔIgMgydF4y2Ba真空吸尘器gydF4y2Ba−ΔIgMgydF4y2BaCTgydF4y2Ba)]。这类开关指数然后密谋反对规范化膀胱CFU(集团平均菌落gydF4y2Ba真空吸尘器gydF4y2Ba/组中位数CFUgydF4y2BaCTgydF4y2Ba为每个接种实验)。因此,每个点反映了集体涉及10个接种疫苗和10个CT数据从一个实验小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 203)。低规范化CFU值表明增强细菌清除后的挑战,在高类开关指数代表优越的B细胞活化通过比较增加免疫球蛋白IgM相比增加。(B)规范化膀胱CFU值从每个疫苗接种实验绘制antigen-specfic IgA的平均吸光度的变化检测尿液中(ΔIgAgydF4y2Ba真空吸尘器gydF4y2Ba)。皮尔森相关系数(gydF4y2BargydF4y2Ba),gydF4y2BaPgydF4y2Ba值显示。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.g006gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

引起尿路UPEC代表一个重大医疗负担可以减轻疫苗的发展将从这些感染提供保护。朝着这一目标,我们描述了使用多管齐下,功能性疫苗学的方法均匀挑出一类分子,那些参与铁收购,作为潜在的目标。筛选过程选择六个候选疫苗从5379年预测蛋白质编码中gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaCFT073基因组。六个候选疫苗满足以下所有条件:预测surface-exposed,存在于细菌外膜gydF4y2Ba[30]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba,守恒UPEC菌株之一gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba,转录调节gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba在人尿中,诱导期间文化gydF4y2Ba[30]gydF4y2Ba和抗原gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba。这些疫苗目标、蔡、协会、宫内厅IreA,铁,和IutA,都是外膜β-barrel蛋白质功能作为含铁化合物的受体。这些,我们发现鼻内接种协会,IreA,或IutA产生抗原特异性体液反应,抗原生产IL-17 IFN-γ,提供了重要的实验感染UPEC保护。gydF4y2Ba

特定场域保护观察抗原提供了最大的细菌数量减少,协会和IreA。IreA疫苗免疫的小鼠明显受CFT073殖民只在膀胱,用>₂降低CFU / g和中值60%的老鼠有察觉的细菌在器官水平。戏剧性的减少膀胱内细菌殖民化的水平可能导致减少细菌的数量提升到肾脏,可能考虑适度减少细菌在IreA-vaccinated小鼠的肾脏后挑战UPEC应变CFT073或536。gydF4y2Ba

与膀胱保护与IreA协会显著降低肾脏和殖民的细菌的数量,超过一半的动物,防止肾完全殖民。尽管显著保护肾脏,免疫与协会疫苗并没有减少细菌能够在膀胱。kidney-specific保护协会的疫苗可能反映了生物功能的协会UPEC在尿路的殖民,UPEC无法生产协会减少了健身实验期间只在肾脏泌尿道感染gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba。协会的位置专疫苗表明免疫反应可能扰乱正常功能的外膜血红素受体,也许通过抗体干扰配体结合域或细菌的选择性免疫针对展览协会的组织表达。gydF4y2Ba

诱导的细胞因子IL-17 IFN-γ表明,细胞反应可能是重要的一代的保护性免疫反应。评估免疫细胞反应,我们分析抗原生产两种细胞因子已知的关键中介抗菌活动在主机内,IFN-γ和IL-17,从脾细胞post-immunization之前和之后的挑战。干扰素-γ的生产已被证明是重要的控制尿路感染gydF4y2Ba[37]gydF4y2BaIL-17已被证明能够促进中性粒细胞的招聘对细菌感染的反应gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba。IL-17最近欣赏作为一种重要的中介控制感染gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba李斯特菌gydF4y2Ba,致病性gydF4y2Ba分枝杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba克雷伯氏菌gydF4y2Ba[39]gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba[43]gydF4y2Ba。干扰素-γ和IL-17都产生免疫反应IreA和宫内厅。脾细胞获得接种小鼠post-challenge显示减少抗原的细胞因子的分泌干扰素-γ和IL-17,表明抗原从脾淋巴细胞可能是归航感染的网站。此外,post-challenge减少这两种抗原细胞因子检测只是重要IreA疫苗,在膀胱产生保护性反应。gydF4y2Ba

粘膜免疫被认为是最有效的手段开发一个泌尿道感染疫苗和我们先前已经表明,鼻内接种/ P伞先生是有效地保护小鼠免受泌尿道感染所致gydF4y2Ba变形杆菌gydF4y2Ba一个代理的复杂的泌尿道感染gydF4y2Ba[44]gydF4y2Ba。因为当地免疫尿道是不切实际的,之间的免疫细胞迁移粘膜网站可以利用在鼻内接种与抗原gydF4y2Ba[45]gydF4y2Ba。我们推断,鼻内接种将产生一个遥远的泌尿生殖道粘膜反应对UPEC接种动物。与此一致的是,我们观察到两种疫苗,IreA IutA,授予显著保护膀胱,所分泌的抗原最大生产IgA检测到尿液中。IreA疫苗,IgA的增加在尿液的研究提供证据表明,可能占bladder-specific保护在小鼠接种这种疫苗。相反,膀胱内没有诱导保护性免疫的抗原不生成一个类似增加IgA的水平。基于这些发现,IgA的相对水平与保护膀胱尿显著相关。时,检查所有的候选疫苗和膀胱内细菌计数,降低CFU有直接关系的膀胱和增加IgA的尿液。这种免疫相关表明,粘膜反应和疫苗产生IgA足以提供保护UPEC殖民的膀胱。这一发现是一致的与其他研究表明,特定的抗体感染gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba压力导致膀胱炎的决议,与外膜蛋白质口服免疫产生抗原特异性针对UPEC IgA粘膜反应gydF4y2Ba[46]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[47]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

发现IgA的尿液在鼻内免疫反应间接表明class-switching抗体同形像发生在接种疫苗的动物。免疫小鼠血清抗体显示,分析抗原IgM产生回应所有的候选疫苗测试。此外,抗原免疫球蛋白明显增加每个疫苗相比pre-immune血清反应。的协会和IutA疫苗提供重要的保护肾脏,可能循环免疫球蛋白或抗原浆细胞减少导致观察到的细菌殖民化。有趣的是,大大保护老鼠对UPEC感染的疫苗,协会,IreA, IutA,显示一个戏剧性的增加相对于IgM抗原免疫球蛋白。这表明class-switching的保护性免疫反应的抗体同形像的象征。评估这种效果,我们定义了一个类开关指数通过比较来自比中位数IgM的抗原免疫球蛋白的变化,规范化的CT和绘制这些值对CT-normalized log-ratio膀胱post-challenge CFU / g。通过绘制规范化CFU / g值对类开关指数,我们发现之间的显著相关性class-switching抗体同形像和保护细菌殖民化的膀胱。gydF4y2Ba

有有限的成功开发一个有效的泌尿道感染的疫苗将提供由UPEC免受感染。免疫与Solco-Urovac灭活的疫苗配方由uropathogenic细菌,产生尿IgAgydF4y2Ba[48]gydF4y2Ba和阴道接种这种疫苗提供了保护,持续8 - 12周gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba。如果管理更加频繁,接种Solco-Urovac可以增加复发到六个月的时间gydF4y2Ba[49]gydF4y2Ba。这表明这种疫苗可能是有用的在易感人群预防复发性尿路。主要的1型fimbrial adhesin UPEC, FimH也被用作候选疫苗在小鼠并提供保护gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba并阻止细菌尿在灵长类动物gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba。之一,我们识别和检测的候选疫苗,铁,一直以前接种小鼠,并与铁,类似于我们的结果被证明产生抗原免疫球蛋白g而不是IgAgydF4y2Ba[17]gydF4y2Ba。与我们的研究结果相比,这组发现铁保护老鼠对肾脏感染。这种差异可能来自我们使用了一个铁的事实细胞外loop-derived肽与CT和混合变性蛋白没有辅助使用的先前的研究gydF4y2Ba[17]gydF4y2Ba。最近,它已经表明,鼻内接种formalin-killed UPEC缺乏荚膜多糖和O抗原生成一个特定的小鼠的体液反应;然而,这种疫苗的保护效果尚不清楚gydF4y2Ba[50]gydF4y2Ba。最后,使用致命的挑战extraintestinal致病性的典范gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba感染,发现接种铁,但不是蔡美儿,增加了免疫小鼠的生存gydF4y2Ba[22]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

尽管这些进步,泌尿道感染的疫苗可提供长期保护目前缺乏针对简单的尿。理性的大规模筛选过程我们描述确定六surface-exposed外膜受体铁化合物。这些代表候选疫苗,因为他们是守恒的uropathogenic肠道共栖菌菌株和很大程度上缺席,诱导期间增长人类尿液和实验泌尿道感染期间,抗原。铁收购是众所周知的是一个共同特质细菌所必需的发病机理,针对受体参与这个过程有可能破坏这一重要功能除了病原体中和和调理素作用。鼻内接种有三个六个候选疫苗(IreA协会,IutA)提供保护与uropathogenic挑战gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba这项研究提供了基础的发展一个亚单位疫苗,将这些保护性抗原提供更广泛的功效在尿路和uropathogenic隔离。重要的是,我们已经表明,关注整个类的蛋白质参与了奇异函数所需的发病机制,而不是一个单一的蛋白质可能是基本策略,通常可以采用在对病原体的疫苗的发展。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

菌株和文化条件gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2Ba应变CFT073隔绝急性肾盂肾炎患者的血液和尿液gydF4y2Ba[51]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba536株从急性肾盂肾炎患者被隔离gydF4y2Ba[52]gydF4y2Ba。除非特别指出,细菌培养在Luria肉汤(磅)包含适当的抗生素(100µg /毫升氨苄青霉素,卡那霉素25µg /毫升、和/或20µg /毫升氯霉素)与曝气37°C。gydF4y2Ba

提升泌尿道感染的小鼠模型gydF4y2Ba

女性的CBA / J小鼠经尿道的接种如前所述gydF4y2Ba[53]gydF4y2Ba。在接种之前,过夜gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaCFT073文化被离心收获(3000×gydF4y2BaggydF4y2Ba,30分钟4°C)和PBS resuspended ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba4.0,相当于4×10gydF4y2Ba9gydF4y2BaCFU /毫升。细菌悬液(50µl /鼠标)是经尿道的使用无菌0.28毫米内径聚乙烯导管连接到一个输液泵(哈佛装置),总剂1×10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU /鼠标。测定菌落,器官从安乐死动物48 h post-inoculation和均质在PBS GLH均质器(泛光灯国际)。细菌在组织匀浆被镀在枚举Luria-Bertani琼脂含0.5 g / L氯化钠使用Autoplate 4000螺旋铁甲工(螺旋生物技术)。殖民地列举使用QCount自动化板计数器(螺旋生物技术)。gydF4y2Ba

血液收集必要的从眼眶下的麻醉小鼠的出血使用1.1到1.2毫米Micro-Hematocrit毛细管(费舍尔)和血清使用Microtainer血清分离器分离管(正)。六到八周大的老鼠用于这些研究和动物≤15周大所有实验的结论。所有程序进行了根据协议通过大学动物保健和使用委员会密歇根大学。gydF4y2Ba

抗原纯化gydF4y2Ba

基因编码选择抗原被扩增CFT073基因组DNA和菌进行基因克隆到pBAD -gydF4y2BamycgydF4y2Ba篇(英杰公司)或pET30b + (Novagen)。重组蛋白表达从pBAD(协会、IutA ChuA)诱导gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba全球培养对ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba= 0.8 100年增加L-arabinoseµM 4 h。从宠物(Iha IreA)蛋白表达增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3) pLysS培养好汤(12 g / L胰蛋白胨,24 g / L酵母提取物,2.3 g / L KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,12.5 g / L KgydF4y2Ba2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba,4%甘油)ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba= 1.0在一夜之间37°C和诱导1毫米β-D-1-thiogalactopyranoside异丙酯(IPTG)。gydF4y2Ba

诱导文化被离心收获(8000×gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C, 10分钟),在10毫米resuspended玫瑰,pH值7,100 U Benzonase核酸酶(σ)。细菌细胞溶解由两个段落尽管法国细胞压力(20000 psi)和溶解产物是通过离心(8000×gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C, 10分钟)。细菌膜被超速离心法从清除溶解产物颗粒状(112000×gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C, 30分钟)和膜颗粒resuspended 5毫升100毫米不gydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba10毫米Tris-HCl 8 M尿素,1% ASB-14, pH值8.0。他的gydF4y2Ba6gydF4y2Ba标记的蛋白质纯化在nickel-nitriloacetic acid-agarose列(试剂盒)在变性条件下根据制造商的指示(QIAexpressionist)。用筛选了纯化蛋白质透析4°C到最终解决方案包含0.05% Zwittergent在PBS, pH值7.5和量化使用BCA蛋白质化验(皮尔斯)。gydF4y2Ba

多肽合成gydF4y2Ba

假定的细胞外循环的铁和IutA预测使用PRED-TMBB计划(gydF4y2Bahttp://biophysics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/gydF4y2Ba)。30-mer肽相应循环6 IutA和循环7铁(铁:YLLYSKGNGCPKDITSGGCYLIGNKDLDPE;IutA: VDDIDYTQQQKIAAGKAISADAIPGGSVD)被表达载体合成纯度≥96%。gydF4y2Ba

疫苗接种gydF4y2Ba

纯化抗原被化学交联霍乱毒素(CT)(σ)10∶1的比例使用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-succinimidyl 3 - (2-pyridyldithio)丙酸(SPDP)(皮尔斯)根据制造商的建议。肽抗原溶解在1毫米EDTA在PBS,混合着降低CT,孵化在4°C 18 h。所有免疫接种经20µl /动物的总量(10µl /鼻孔)。动物收到主剂0 100天µg交联抗原(包含10µg CT)或10µg CT。两个提高25µg抗原(交联到2.5µg CT)或2.5µg CT仅7和14天给药,和老鼠挑战如上所述。gydF4y2Ba

组织培养gydF4y2Ba

单细胞悬浮体是由脾脏通过强制器官虽然40µm细胞过滤器(BD猎鹰)。血红细胞的细胞溶解使用8.02毫克/毫升NH 2分钟gydF4y2Ba4gydF4y2BaCl, 0.84毫克/毫升NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba,0.37毫克/毫升蒸馏水中EDTA。最后悬浮液在RPMI(补充谷酰胺,Gibco)和丙酮酸钠1%,1%的谷酰胺,青霉素和链霉素1%,1%的非必需氨基酸,10%胎牛血清的边后卫,50 mMβ-mercaptoethanol 0.001%。脾细胞(1.5×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba用培养基培养细胞/毫升)单独或与1µg /毫升纯化抗原。孵化后的细胞在37°C, 5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba48 h,上层的收获和储存在−20°C。gydF4y2Ba

ELISAgydF4y2Ba

血清间接ELISA, EIA / RIA中绑定96 - ELISA板(康宁)涂在rt一夜5µg /毫升纯化蛋白(血清)或10µg /毫升纯化蛋白(尿液)稀释在碳酸盐缓冲,pH值9.8。非特异性结合位点与10%的边后卫被封锁,0.04% NaNgydF4y2Ba3gydF4y2Ba在PBS房间临时1 h。1∶128小鼠血清的稀释阻断缓冲区或50µl汇集稀释尿液的申请在2到5井复制。山羊anti-mouse IgA免疫球蛋白,IgM得到共轭,碱性磷酸酶(南方生物技术)。碱性磷酸酶底物,gydF4y2BapgydF4y2Ba-nitrophenyl磷酸(1毫克/毫升)(σ),稀释在碳酸盐缓冲和应用在rt直到颜色开发井。与氢氧化钠反应是停止和阅读μQuant板读者(Bio-Tek仪器,Inc .)的波长405纳米。gydF4y2Ba

细胞因子ELISA、纯化IL-17A IFN-γ,匹配相应的抗体对从研发系统和使用根据制造商的建议。为检测、门诊部当Easy-tablets(2毫克/片,在穿越有机物)稀释直到颜色开发和应用。反应停在添加100µl 6 N HgydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和一盘一起读读者波长490纳米。盘子被洪水冲刷所有与洗井四次缓冲区之间孵化项目。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有的图形和统计分析使用GraphPad棱镜完成5。意义决心使用Mann-Whitney测试。确定相关的保护使用皮尔逊相关系数和线性回归来生成最适合线。所有统计数据进行了使用95%置信区间适用的地方。gydF4y2Ba

支持信息gydF4y2Ba

图S1。gydF4y2Ba

圆二色性谱纯化用协会。远紫外CD光谱分析纯化协会(800µg /毫升)后缓冲交换和复原。光谱测量从195年到250海里25°C使用Jasco有限公司(日本东京)j - 810启1.00工具。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000586.s001gydF4y2Ba

(0.04 MB PDF)gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者希望感谢马修·夏勒技术建议,韦斯利Dunnick技术援助和试剂,Neal锤圆二色性分析,埃里卡弗兰纳里和玛丽baillie gifford有益的讨论。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

构思和设计实验:CJA电解珩磨凯斯HLTM。进行了实验:CJA电解珩磨凯斯,SNS。分析了数据:CJA电解珩磨凯斯HLTM。该报写道:CJA电解珩磨凯斯HLTM。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

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