广告

  • 加载指标

188滚球软件

同行评议

研究文章

流感病毒PB1-F2蛋白质通过线粒体ANT3和VDAC1诱导细胞死亡

流感病毒PB1-F2蛋白质通过线粒体ANT3和VDAC1诱导细胞死亡

  • 他在Zamarin,
  • 阿道夫•Garcia-Sastre,
  • 队,
  • 荣王,
  • Peter Palese称
公共科学图书馆
x

文摘

流感病毒PB1-F2之前是一个87 -氨基酸线粒体蛋白质,可以诱导细胞死亡,尽管诱导细胞凋亡的机制仍不清楚。描述其作用机理的过程中我们发现病毒PB1-F2蛋白质糖分会让细胞凋亡刺激如肿瘤坏死因子α,证明增加半胱天冬酶3 PB1-F2-expressing细胞基质的乳沟。此外,治疗与PB1-F2重组蛋白纯化小鼠肝线粒体导致细胞色素c的释放,线粒体膜电位的损失,和tBid-induced线粒体透化作用增强,暗示可能观察到的细胞致敏细胞凋亡的机制。使用glutathione-S-transferase下拉与后续的质谱分析,我们确定了线粒体的扶少团团员PB1-F2蛋白质和显示,病毒蛋白独特与内线粒体膜腺嘌呤核苷酸转运蛋白3和线粒体外膜压敏电阻器阴离子通道1,两者都是在细胞凋亡与线粒体渗透性转换。符合这种交互,阻断剂的渗透过渡孔复杂(PTPC)抑制PB1-F2-induced线粒体透化作用。根据我们的研究,我们提出一个模型,proapoptotic PB1-F2蛋白质通过线粒体PTPC行为和可能发挥作用的下调宿主对感染的免疫反应。

剧情简介

PB1-F2由流感病毒短编码的多肽。虽然这种病毒蛋白的作用不是完全理解,众所周知本地化的mitochodria感染细胞,促进细胞死亡。作者发现PB1-F2糖分会让细胞死亡与两个线粒体蛋白质,通过交互ANT3 VDAC1。这些交互促进mitochodria的透化作用和促进线粒体的发布产品,触发细胞死亡(凋亡)。PB1-F2-mediated通过线粒体细胞死亡可能会导致流感病毒的致病性。

引用:王Zamarin D, Garcia-Sastre,小X, R, Palese P(2005)流感病毒PB1-F2蛋白质通过线粒体ANT3和VDAC1诱导细胞死亡。公共科学图书馆Pathog 1 (1): e4。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004

编辑器:跳过处女,华盛顿大学医学院的美利坚合众国

收到:2005年4月13日;接受:2005年6月23日;发表:2005年9月30日

版权:©2005 Zamarin et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

缩写:ANT3,腺嘌呤核苷转运蛋白3;英航,bongkrekic酸;CsA,环孢霉素;GFP,绿色荧光蛋白;销售税,glutathione-S-transferase;哈,血凝素;NP,核蛋白质;PARP聚核糖聚合酶;PTPC,渗透过渡孔复杂;TNFα,肿瘤坏死因子α; VDAC1, voltage-dependent anion channel 1

介绍

流感病毒感染导致细胞的激活途径,旨在抑制病毒复制和抗病毒的感应状态(1]。为了克服抗病毒信号,流感病毒进化辅助蛋白质,如NS1和PB1-F2提出了down-modulate宿主免疫反应的不同方面(2,3]。虽然NS1蛋白已被证明扮演一个角色在I型干扰素的抑制反应,PB1-F2蛋白质的功能仍然是难以捉摸的。

PB1-F2是小说87 -氨基酸蛋白质识别的另一个阅读框的意外收获PB1基因的甲型流感病毒/公关/ 8/343]。初步研究表明,线粒体的蛋白定位导致线粒体形态的改变,线粒体膜电位的耗散,和细胞死亡,在免疫细胞的起源(更明显3]。基本的两性分子的螺旋PB1-F2蛋白c端地区随后决定负责其线粒体定位(4,5]。蛋白质的合成肽来自c端域oligomerize被证明有能力和是非permeabilize脂质双分子层膜(6,7),属性观察与一些已知的细胞线粒体凋亡介质(8,9]。然而,尽管这些发现PB1-F2-induced细胞凋亡的具体机制和功能尚不清楚。

调节线粒体透化作用已经涉及到几个已知的人类病原体的生命周期(10,11]。事实上,稳定细胞株的凋亡蛋白overexpressing bcl - 2家族比他们的父母不太宽容的流感病毒复制细胞系(12- - - - - -14),强调的重要性的作用线粒体凋亡通路在流感病毒的发病机理。

细胞凋亡信号通过激活线粒体所得的成员proapoptotic bcl - 2家族BH3-only蛋白质如报价,施加其影响通过释放一些线粒体凋亡诱导介质,如细胞色素c、凋亡诱导因子,酶G, Smac /暗黑破坏神和Omi / HtrA2 [15]。线粒体透化作用的确切机制导致仍在调查之中,但众所周知,涉及细胞凋亡bcl - 2家族的介质,如贝克和伯灵顿,和蛋白质构成渗透过渡孔复杂(PTPC),如腺嘌呤核苷转运蛋白3 (ANT3)内线粒体膜和压敏电阻器阴离子通道1 (VDAC1)在线粒体外膜[16- - - - - -19]。

针对可能的贡献PB1-F2蛋白质流感病毒的发病机理,我们试图确定蛋白质的作用在调制宿主的免疫反应,并进一步阐明其作用机理。我们表明,线粒体PB1-F2透化作用的蛋白质使敏感细胞肿瘤坏死因子-α的proapoptotic效果通过tBid信号(TNFα)。此外,我们的研究结果表明,PB1-F2-induced凋亡收益通过一个独特的机制涉及其与ANT3交互和VDAC1蛋白质PTPC的内部和外部的线粒体膜,分别。ANT3-specific抑制剂的使用,我们认为直接PB1-F2 permeabilizes线粒体ANT3-dependent方式。我们的研究结果提供了一个更深的洞察PB1-F2蛋白质的功能和强调的作用PTPC线粒体透化作用和细胞死亡的流感病毒感染细胞。

结果

PB1-F2蛋白转染细胞凋亡刺激处于敏感状态

我们研究了瞬态PB1-F2流感病毒蛋白的表达是否会提高通过内在和外在proapoptotic刺激细胞死亡(图1)。达到最大瞬时转染的效率PB1-F2蛋白质,代理的proapoptotic效应最初在293年PB1-F2-transfected化验t细胞,在细胞凋亡检测到乳沟的聚核糖聚合酶(PARP),直接衬底的半胱天冬酶3 (图1),无关的流感病毒蛋白的核蛋白(NP),不诱导细胞凋亡,被用作控制。减少全身的PARP伴随增加在PB1-F2-transfected细胞裂解PARP产品被紫外线照射引起DNA损伤反应,顺铂,相比控制(图1PB1-F2-transfected细胞)。治疗50 ng / ml的TNFα或5 ng / ml的TNF-related凋亡诱导配体导致显著增加PARP乳沟,而控制(图1A)。针对发现PB1-F2致敏细胞外在和内在凋亡刺激,我们测试是否PB1-F2-expressing细胞也由于分离从敏感到死亡的增长矩阵(女性)。激活的女性也已被证明能够涉及proapoptotic BH3家族成员(20.,21]。的确,PB1-F2也由女性敏感细胞死亡,证明了快速膜起泡和分裂使胰蛋白酶化的人类肺上皮细胞A549细胞转染表达PB1-F2构造(图1B) (22]。以确定是否确实PB1-F2-expressing细胞发生凋亡,我们标记PB1-F2-transfected A549细胞M30抗体caspase-cleaved细胞角蛋白。有趣的是,在缺乏其它凋亡刺激的情况下,只有一小部分PB1-F2-expressing细胞进行了细胞凋亡(图1C),这就可以解释PB1-F2 proapoptotic效应相对较低的蛋白质中观察到上面的化验。整体而言,这些结果表明,PB1-F2蛋白增强细胞proapoptotic刺激的影响。

缩略图
下载:
图1所示。PB1-F2蛋白质糖分会让细胞凋亡细胞毒性刺激的反应

(一)PB1-F2蛋白质的表达增强的乳沟多聚腺苷酸核糖聚合酶(PARP)细胞毒性药物的反应。转染293 t细胞与PB1-F2 (F2)或流感病毒NP (NP) 24 h和随后治疗6 h和50 ng / ml TNFα,5 ng / ml TNF-related凋亡诱导配体,100μM顺铂或紫外光照射60 J / m2表示。所有细胞收集6 h后,细胞溶解,并通过免疫印迹裂解PARP处理。

(B)由女性PB1-F2蛋白质容易使细胞死亡。A549细胞转染空向量或24 h post-transfection PB1-F2和使胰蛋白酶化。细胞培养在PBS 0.3% BSA 15分钟,用移液器吸取到显微镜载玻片上,和细胞形态学的变化(膜起泡箭头所示)用相差显微镜检查(22]。

(C)的一个子集PB1-F2-expressing细胞发生凋亡。A549细胞转染与HA-tagged PB1-F2 24 h和彩色HA型表位和裂解细胞角蛋白(M30)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g001

致Bcl-xL PB1-F2蛋白质是细胞凋亡的抑制

PB1-F2以来显示本地化线粒体(3,4),我们调查是否线粒体凋亡机制参与PB1-F2-induced凋亡的提高。线粒体细胞凋亡透化作用的介质是由抗凋亡蛋白如Bcl-xL和bcl - 2。鉴于PB1-F2-induced的依赖性凋亡细胞凋亡的因素,我们决定确定PB1-F2-induced凋亡敏感可以克服Bcl-xL cytoprotective效应。为了我们的实验中,我们使用生成稳定细胞系A549细胞overexpressing Bcl-xL蛋白质(A549-Bcl-xL)和各自的控制细胞系表达新霉素抗性基因编码。结果细胞系都表现出瞬时转染效率约60%,见证了瞬时表达绿色荧光蛋白(GFP);未公开的数据)。

在一个控制稳定细胞系转染与新霉素向量(A549-neo),表达PB1-F2增强TNFαproapoptotic效应,证明immunolabeling M30抗体特定的裂解细胞角蛋白18 (图2),Coimmunostaining PB1-F2确实显示PB1-F2-expressing细胞发生凋亡。然而,在回应TNFαPB1-F2-induced凋亡抑制A549细胞株的稳定overexpressing Bcl-xL (图2整体B)。这些结果表明,线粒体凋亡途径所需PB1-F2-mediated凋亡的提高。

缩略图
下载:
图2。PB1-F2 Protein-Mediated增强TNFα-Induced Bcl-xL细胞凋亡受到抑制

A549细胞含有stably-integrated新霉素抗性基因(A549-neo) (a),或A549细胞稳定overexpressing Bcl-xL (A549-Bcl-xL) (B)转染空载体或向量编码HA-tagged PB1-F2。在24 h post-transfection,细胞治疗50 ng / ml TNFα,表示。然后6小时后处理,M30抗体的细胞被固定和染色裂解细胞角蛋白和anti-HA抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g002

流感病毒PB1-F2蛋白质破坏线粒体组织和诱导细胞色素C的释放

进一步描述PB1-F2-mediated凋亡增强,我们生成一个单克隆抗体(26 d3)特定的n端结构域的蛋白质,并证实了显微镜PB1-F2蛋白质表达转染质粒本地化A549-neo线粒体,A549-Bcl-xL细胞(图3A)。而在正常细胞线粒体通常沿着微管网络,分布式的线粒体PB1-F2-transfected细胞失去正常tubuloreticular组织并显示一个点状的外观(图3A)。有趣的是,这种影响并不是被Bcl-xL超表达(图3),这表明线粒体网络的破坏不是PB1-F2-induced细胞凋亡的主要机制。

缩略图
下载:
图3。流感病毒PB1-F2蛋白质破坏线粒体

(一)PB1-F2扰乱reticulotubular组织线粒体。A549-neo A549-Bcl-xL细胞转染和HA-tagged PB1-F2 24 h和沾染了抗体与人类anti-mitochondrial血清HA标记和线粒体的标志。点状的线粒体的细胞(*)表示,虽然与普通reticulotubular线粒体细胞组织(#)所示。

(B) PB1-F2蛋白质诱导线粒体细胞色素c的释放在转染细胞。海拉细胞转染了HA-tagged PB1-F2 24 h,处理50 ng / ml TNFα8 h,并沾anti-HA抗体(绿色,二次抗体FITC) anti-cytochrome c抗体(红、二次抗体Alexa 568),和DAPI(蓝色)。用共焦显微镜观察细胞。

(C)亚细胞分离与PB1-F2转染293 t细胞。293 t细胞转染24 h,随后mock-treated或50 ng / ml TNFα对待。细胞随后被收集和分离到胞质和线粒体分数。剩余的细胞色素c在线粒体碎片被免疫印迹检测。Tom20蛋白质被用作加载控制。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g003

进一步评估的影响PB1-F2蛋白在线粒体凋亡通路,我们分析了PB1-F2-expressing细胞线粒体细胞色素c的释放。海拉细胞转染了血凝素(HA)标记PB1-F2,处理50 ng / ml TNFα8 h,和彩色标记和细胞色素c。PB1-F2蛋白的表达导致从线粒体细胞色素c的释放(图3在细胞的一个子集,B)见证了扩散的细胞色素c在细胞质中。更好的定量测量数量的细胞色素c的释放,与质粒转染293 t细胞表达PB1-F2或空向量和24 h后治疗与50 ng / ml TNFα8 h。细胞随后被分离成胞质和线粒体分数,和线粒体细胞色素c剩余的一部分是由免疫印迹(图3C)。治疗PB1-F2转染细胞与TNFα导致增强线粒体细胞色素C的释放相比,矢量控制。

PB1-F2直接诱导线粒体透化作用和糖分会让线粒体Proapoptotic tBid的效果

进一步调查是否PB1-F2蛋白在线粒体的影响是直接的,我们与重组PB1-F2孵化纯化小鼠肝线粒体蛋白质。重组tBid蛋白质被用作控制。治疗PB1-F2蛋白导致的线粒体细胞色素c的释放,而在更高浓度增加,建议直接作用PB1-F2在促进线粒体外膜透化作用(图4A)。这种效应时没有被观察到一个重组glutathione-S-transferase (GST)蛋白质是本试验中使用类似的浓度(未发表的数据)。针对以前的报告,PB1-F2蛋白c端区域的目标内线粒体膜,我们继续调查是否PB1-F2-induced线粒体透化作用还包括内部的线粒体膜。为此我们使用了线粒体potential-sensitive染料JC-1确定孵化与PB1-F2重组蛋白纯化的线粒体会导致线粒体内膜的耗散的潜力。JC-1染料的吸收完整线粒体导致增加红橙色荧光在590 nm激发态在490海里。我们可以看到图4B,孵化纯化的线粒体为10分钟PB1-F2剂量的增加导致减少JC-1荧光在590海里,这表明PB1-F2 protein-induced线粒体透化作用涉及到内部的线粒体膜。有趣的是,尽管PB1-F2重组蛋白,有效的克分子数相等的浓度,低于tBid释放细胞色素c (图4),这是与tBid内线粒体膜的透化作用。这表明线粒体膜电位的损失可能不会tBid-induced所需细胞色素c的释放(23),这可能是PB1-F2-induced线粒体透化作用的必要条件。这些结果证实了以前的研究结果——PB1-F2蛋白质在细胞的表达会导致损耗的线粒体膜电位(3]。有趣的是,当我们和其他人显示,表达PB1-F2蛋白质本身不会引起显著的凋亡水平(3]。这表明内膜PB1-F2透化作用的蛋白质可能不是细胞凋亡诱导的主要机制。相反,我们假设PB1-F2-induced内膜透化作用作用与另一个凋亡机制可能是负责PB1-F2-mediated凋亡增强所示图1和2。

缩略图
下载:
图4。流感病毒PB1-F2直接Permeabilizes线粒体蛋白质

(一)PB1-F2重组蛋白质纯化小鼠线粒体细胞色素c的释放引起的。小鼠线粒体(50μg总蛋白)孵化1 h与重组蛋白在30°C的兴趣表示浓度。细胞色素c的释放在上层清液的化验是使用c anti-cytochrome抗体免疫印迹。重组tBid蛋白质被用作控制。线粒体颗粒是Tom20蛋白质化验,确保使用等量的线粒体。

(B) PB1-F2 tBid导致线粒体膜电位的耗散。小鼠线粒体(50μg)孵化了10分钟30°C与感兴趣的蛋白质浓度表示。相对损失在膜电位是衡量吸收膜potential-sensitive JC-1染料。数据表示为荧光相对百分比mock-treated线粒体。

(C) PB1-F2蛋白质提高tBid-induced细胞色素C的释放。纯化小鼠线粒体(50μg)与10 nM PB1-F2或孵化20μl mock-treated 15分钟,随后接受重组tBid表示浓度的1 h总量的30μl。上层清液的化验,供免疫印迹细胞色素c的释放。的线粒体颗粒处理Tom20确保平等的线粒体使用量。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g004

内在和外在的事实细胞凋亡刺激收敛的线粒体通过信号bcl - 2家族BH3蛋白质,我们调查是否存在PB1-F2理想浓度将提高从纯化的线粒体细胞色素c的释放tBid重组。孵化与重组tBid结果纯化的线粒体细胞色素c的释放在tBid浓度低至10 nM (图4C)。预培养纯化的线粒体10 nM PB1-F2增强tBid-induced细胞色素C的释放几乎十倍(图4C)。随着PB1-F2蛋白质用于在哪种浓度不能释放细胞色素C本身的影响结果表明,PB1-F2和tBid不仅仅是添加剂。我们推测,PB1-F2-induced内线粒体膜的透化作用可能在应对tBid增强细胞色素c的释放。整体而言,这些结果表明,敏感的细胞凋亡PB1-F2可能继续通过其增强作用的效应细胞BH3家族的蛋白质。

先前的研究显示,PB1-F2蛋白定位,内部和外部的线粒体膜(3- - - - - -5]。作为细胞凋亡蛋白以前采取行动通过显示线粒体蛋白质控制透化作用的内在以及外在的线粒体膜,我们推测,观察到PB1-F2-induced凋亡敏感膜可以通过组件进行。调查可能参与PB1-F2-induced细胞凋亡的线粒体蛋白质,我们试图识别潜在的线粒体的扶少团团员PB1-F2蛋白质。

PB1-F2蛋白与线粒体PTPC ANT3和VDAC1蛋白质

PB1-F2蛋白质表达在293 t细胞作为氨基端GST融合蛋白,以及GST-PB1-F2之间的配合物及其相互作用的蛋白质与glutathione-Sepharose珠子推倒。蛋白质从珠子,随后被筛选了由SDS凝胶电泳分离,用银染色。一个不相关的多肽类似的长度融合销售税(GST-Nipah-Wc,包含的最后43个氨基酸W的尼帕病毒融合蛋白GST)被用作控制。独特的蛋白质乐队大约在36岁,55,80 kDa特定PB1-F2融合蛋白而不是销售税或控制蛋白质检测(图5道4和5)。蛋白质的质谱分析确定了线粒体ANT3 36-kDa乐队,55-kDa乐队β微管蛋白,细胞角蛋白和80 kda的乐队。后者可能是污染物的蛋白质制备。虽然PB1-F2与微管蛋白相互作用可能对PB1-F2-induced线粒体混乱(见非常重要图3),我们选择了把重点放在ANT3蛋白质,这是参与线粒体凋亡。Coimmunoprecipitation实验与转染HA-tagged ANT3证实PB1-F2之间的交互和ANT3 (图5B)。正如所料,转染HA-tagged ANT3本地化mitochodria (图5C)。

缩略图
下载:
图5。PB1-F2蛋白质与ANT3和VDAC1交互

(一)细胞蛋白质推倒GST-PB1-F2 12% sds - page和silver-stained中分离了出来。星号标记的蛋白带的GST-PB1-F2车道(~ 36 kDa, 55 kDa,和80 kDa)。道4和5代表两个不同的下拉实验的结果。

(B) PB1-F2专门与ANT3和VDAC1而不是其他线粒体内外膜蛋白。互动与ANT3 PB1-F2 VDAC1确认与转染293 t细胞由coimmunoprecipitation HA-tagged ANT3和flag-tagged VDAC1(五大图像)。Tom20 COXIV,蒂姆44蛋白质被用作线粒体coimmunoprecipitation控制。

(C)转染ANT3和线粒体VDAC1本地化。转染293 t细胞与Flag-tagged ANT3和VDAC1 24 h,随后被分馏产生胞质和线粒体分数。Tom20蛋白质作为控制线粒体分数。处理每个样本一式三份(通道1、2和3,ANT3;VDAC1车道4、5、6日)。

(D) PB1-F2直接与ANT3和VDAC1交互。35S-labeled ANT3和VDAC1表达在体外使用兔网织红细胞溶解产物系统和被下拉5μg销售税(左车道)或GST-PB1-F2(右车道)。蛋白质分离12% sds - page和可视化放射自显影法。

(E) PB1-F2表示在病毒感染与ANT3和VDAC1交互。转染293 t细胞与Flag-tagged ANT3 VDAC1蛋白质和24 h后感染野生型PR8病毒(PR8)或病毒破坏了PB1-F2表达的莫伊(del) 2。15小时后感染,收集细胞和免疫沉淀反应anti-PB1-F2多克隆血清。流感病毒NP被用作控制显示相同水平的样本之间的感染。世行,免疫印迹。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g005

验证之间的交互PB1-F2 ANT3直接,我们表示35S-labeled ANT3体外标记蛋白GST下拉给执行和销售税或GST-PB1-F2蛋白质。只能够共沉淀在GST-PB1-F2 vitro-translated ANT3蛋白质,表明之间的直接交互PB1-F2和ANT3可能(图5D)。

先前的研究显示,氨基酸形成的预测基本的两性分子的螺旋69 - 82是充分的针对PB1-F2内线粒体膜(4]。然而,immunoelectron显微镜研究之前也表明这两个内在和外在的长篇PB1-F2蛋白质局部线粒体膜(3),这表明蛋白质的N末端可能发挥作用在针对线粒体外膜的蛋白质。因此,虽然ANT3 PTPC确认的是唯一的组件通过质谱与PB1-F2交互,我们不能排除这种可能性,PB1-F2施加影响与其他蛋白质孔隙的复杂。因为ANT3完全是一个内在膜蛋白,我们推测,外膜PB1-F2可能通过一个额外的机制。事实上,免疫沉淀反应实验表明PB1-F2蛋白质也与VDAC1互动(图5B),和销售税下拉实验在vitro-translated VDAC1证实,可能是直接的交互(图5D)。这些研究结果令人惊讶,因为VDAC1蛋白质是没有发现在原始的质谱实验。当VDAC1蛋白很可能错过在我们的分析中,也有可能氨基GST标签可能阻止与VDAC1 PB1-F2蛋白质之间的相互作用在细胞内。

ANT3和VDAC1似乎是至关重要的组件的复杂孔隙(19]。ANT3是一种内心线粒体膜蛋白功能作为ADP的逆向转运催化ATP的交换(19,24]。在凋亡刺激,ANT3被认为接受主要构象变化导致的形成特异性的毛孔内线粒体膜。凋亡刺激也引发VDAC1外膜蛋白构象变化,线粒体外膜中形成气孔。ANT3和VDAC1认为互动,形成了PTPC,导致损耗的内在的线粒体膜电位和凋亡的释放介质从线粒体膜间隙24- - - - - -26]。

消除非特异性相互作用的可能性的PB1-F2线粒体蛋白质,我们执行PB1-F2 coimmunoprecipitation实验外线粒体膜运输蛋白Tom20, COXIV内线粒体膜蛋白质,蛋白质Tim44,定位到矩阵内部的线粒体膜(图5B)。PB1-F2与这些蛋白质,蛋白质未能coimmunoprecipitate进一步确认的特异性与ANT3互动和VDAC1 (图5B)。

确认转染标记ANT3和VDAC1蛋白质正确针对线粒体,我们进行了亚细胞分离和确定,大多数表示ANT3 VDAC1确实存在线粒体内的分数(图5C)。此外,确定PB1-F2 ANT3和交互的上下文中VDAC1病毒感染,感染Flag-ANT3——Flag-VDAC1-transfected 293 t细胞与野生型PR8病毒或其PB1-F2记者病毒破坏了蛋白质的表达。免疫沉淀反应实验anti-PB1-F2多克隆血清显示PB1-F2蛋白在病毒感染与ANT3和VDAC1交互(图5E)。

由于缺乏可用性的抗体特定ANT3 VDAC1,我们无法证明PB1-F2与内源性蛋白质之间的相互作用,除了通过质谱分析所示的交互。因此,进一步证实的特异性相互作用,我们开始识别领域内的交互PB1-F2蛋白质。

PB1-F2 C端域的蛋白质与ANT3负责互动,而C -和n端结构域与VDAC1交互

表达PB1-F2 HA-tagged N -或c端域的不成功,导致碎片,似乎是不稳定的(未发表的数据)。稳定蛋白质的每个部分,我们生成HA-tagged GFP-fusion蛋白质结构的每个域(HA-nF2-GFP HA-cF2-GFP;图6),氨基端区域(HA-nF2-GFP)包括氨基酸1-38,而c端融合蛋白(HA-cF2-GFP)包括氨基酸39 - 87 (图6转染海拉细胞),全身HA-PB1-F2-GFP线粒体融合蛋白和HA-cF2-GFP蛋白质本地化,而HA-nF2-GFP融合蛋白是广泛地分布在细胞质和细胞核(图6B)。因为可能的相互作用的蛋白质的N末端细胞目标可能受到其亚细胞定位,我们额外的构建融合生成N末端的线粒体细胞色素氧化酶的目标信号,目标蛋白质内部的线粒体膜(HA-MTS-nF2-GFP) [27]。由此产生的融合蛋白本地化线粒体(图6B)。我们下决定是否融合蛋白与Flag-tagged ANT3 VDAC1转染293 t细胞。HA-PB1-F2-GFP和HA-cF2-GFP融合蛋白被证明与VDAC1和ANT3交互,而HA-nF2-GFP只有VDAC1互动(图6C和6D)。HA-MTS-nF2-GFP蛋白质具有内线粒体膜目标序列仍未能与ANT3交互,证实蛋白质的N末端不负责互动(图6C)。有趣的是,与VDAC1 HA-MTS-nF2-GFP蛋白质之间的相互作用也大大减少HA-nF2-GFP蛋白质缺乏MTS(相比图6D)。有可能迫使本地化的nF2内线粒体膜可能阻止其与VDAC1外膜。

缩略图
下载:
图6。识别PB1-F2负责与ANT3互动和VDAC1蛋白质域

(A) PB1-F2 N -和c端域被克隆分别为氨基端HA - c端GFP融合蛋白如下。(1)GFP控制;(2)完整的融合蛋白(HA-PB1-F2-GFP);(3)38 - 87 c端氨基酸域融合蛋白(HA-cF2-GFP);(4)n端氨基酸1-37域融合蛋白(HA-nF2-GFP);(5)n端结构域融合蛋白与细胞色素氧化酶线粒体靶向序列(HA-MTS-nF2-GFP);(6)控制MTS-GFP融合蛋白(HA-MTS-GFP)。

(B)融合蛋白的定位确定转染海拉细胞(绿色,GFP-fusion蛋白质;红色,为线粒体Mitotracker染料染色;蓝色,DAPI核染色)。

(C和D)融合蛋白相互作用与ANT3 VDAC1由cotransfecting 293 t细胞相互融合构造和一个向量编码Flag-tagged ANT3或VDAC1,分别。免疫沉淀反应进行anti-HA抗体,为后续的免疫印迹Flag-tagged ANT3或VDAC1。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g006

的PB1-F2 Protein-Mediated线粒体透化作用被ANT3阻滞剂减毒

我们进一步调查的角色在PB1-F2-induced PTPC线粒体透化作用。我们求助于已知的孔隙复杂抑制剂:bongkrekic酸(BA),显示出抑制ANT3 [28),环孢霉素(CsA),也还有结合线粒体矩阵D和抑制ANT3。纯化小鼠肝线粒体与重组治疗30分钟PB1-F2蛋白质的存在与否BA (图7的线粒体)。孵化增加剂量的PB1-F2蛋白质导致线粒体膜电位以耗散JC-1荧光。这种效应减弱,虽然没有完全抑制,当线粒体preincubated 50μM BA (图7一个)。

缩略图
下载:
图7。以ANT3-Dependent方式PB1-F2蛋白质诱导线粒体透化作用

(A)重组PB1-F2蛋白质孵化了50μg纯化小鼠肝线粒体的存在与否50μM英航30分钟。线粒体是进一步处理评估膜电位的JC-1荧光在590海里。

(B) PB1-F2诱发转染细胞线粒体膜电位的损失。海拉细胞转染GFP融合构造PB1-F2,和12 h后服用50 ng / ml TNFα8 h,表示。细胞随后沾Mitotracker CMXRos红色染料。细胞消失膜电位由(*)表示。

CsA (C)线粒体渗透性转换抑制剂抑制PB1-F2-induced线粒体膜电位的损失。在CsA的海拉细胞转染和治疗(B)和与Mitotracker染料染色。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g007

确认ANT3参与PB1-F2-induced耗散的细胞内线粒体膜电位,和识别领域的蛋白质负责这透化作用,我们用PB1-F2-GFP转染海拉细胞融合结构中描述图6和染色细胞线粒体膜potential-sensitive Mitotracker CMXRos红色染料。GFP蛋白被用作控制。符合之前的报道(4,5),我们发现,在缺乏其它刺激的情况下,蛋白c端域的更有效驱散内心的膜电位比完整的蛋白质(图7B,上层显微照片),揭示了降低Mitotracker红染色在这些细胞。这是进一步与我们的研究结果一致,PB1-F2蛋白c端域的负责与ANT3互动(图6)。治疗的海拉细胞表达PB1-F2-GFP融合构造TNFα导致膜电位的耗散,进一步确认完整的蛋白质需要额外凋亡刺激的效果(图7B)。确认PB1-F2-induced渗透率过渡确实收益在ANT3-dependent方式,我们做了相同的实验在CsA的存在,一个已知ANT3抑制剂(图7C)。治疗CsA的海拉细胞导致保护细胞线粒体膜电位的表达cF2-GFP和TNFα-treated细胞表达PB1-F2-GFP蛋白质。

PB1-F2-Induced凋亡ANT3-Dependent方式所得

确认PB1-F2-mediated致敏细胞凋亡在ANT3-dependent收益的方式,我们调查是否BA, ANT3拦截器,可以抑制这种效应。A549细胞转染PB1-F2 24 h和随后处理TNFα在50μM英航的存在与否。我们可以看到图8,英航抑制TNFα-induced在这些细胞凋亡,而未经处理的控制。总的来说,这些结果,以及相互作用的研究,表明PTPC在PB1-F2-induced线粒体透化作用过程中发挥作用。

缩略图
下载:
图8。通过组件的PTPC PB1-F2凋亡作用

(一)ANT3阻滞剂英航抑制PB1-F2-mediated敏感的细胞凋亡。A549细胞转染PB1-F2 20 h然后对待TNFα表示,无论是在50μM英航的存在与否。收集细胞8 h后,沾M30抗体裂解细胞角蛋白。

(B)提出的模型PB1-F2行动期间感染。在感染的早期阶段,PB1-F2定位线粒体,它与ANT3 VDAC和容易使线粒体渗透性转换。感染后期,当更多PB1-F2合成,和抗病毒凋亡信号通路,诱导线粒体进行渗透过渡,从而导致细胞凋亡的诱导。PB1-F2-induced线粒体透化作用可以通过三种可能的机制进行,右边显示图形:(1)增强复杂孔隙的形成通过直接与ANT3 VDAC1;(2)独立的线粒体膜透化作用的内在和外在的帮助下ANT3 VDAC1,分别;和(3)直接线粒体膜的透化作用。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010004.g008

讨论

线粒体凋亡是一个关键的控制网关对许多细胞凋亡通路,即线粒体透化作用和蛋白质释放中介代表执行的临界点凋亡级联(29日]。透化作用的线粒体被认为发生在两个机制,提出进行渗透transition-dependent或独立的方式(16,17]。机制并不是相互排斥的,人们普遍认为,两个线粒体诱导的细胞凋亡中发挥作用,即每个机制的贡献依赖于凋亡刺激和/或微分组织监管(17]。

一些病毒和细菌蛋白质已被证明通过直接影响不同诱导或抑制细胞凋亡的线粒体组件(10,11]。疱疹病毒家族的病毒进化到由不同的机制,调节细胞凋亡与编码bcl - 2家族的一些成员同源染色体(30.]。孔蛋白的蛋白质奈瑟氏菌属和乙肝病毒X蛋白与VDAC [31日- - - - - -33]。巨细胞病毒vMIA蛋白质和艾滋病毒蛋白质冲程体积影响渗透过渡通过瞄准ANT3 [34,35),和粘液瘤病毒的蛋白质M11公路目标外围苯二氮受体,另一个组件的复杂孔隙(36]。还是其他病毒蛋白质发挥其影响线粒体通过未知的机制(10,11]。

了解流感病毒PB1-F2蛋白质在细胞凋亡中的作用,我们决定阐明其作用机理和作用蛋白在病毒感染。PB1-F2-expressing细胞的凋亡敏感性是极大地增强了针对不同细胞凋亡刺激,如DNA损伤,女性,通过死亡受体信号(见图1)。类似的发现以前报道的乙肝病毒X蛋白(37]。因为BH3家族的蛋白质如报价已经涉及内在和外在凋亡信号(20.,22,38),我们假设PB1-F2可能使敏感线粒体proapoptotic投标的影响。事实上,治疗与重组tBid纯化的线粒体的存在PB1-F2导致增强的细胞色素c的释放(见图4)。此外,proapoptotic PB1-F2对细胞的影响,以应对TNFα被Bcl-xL(见图2),它可能通过抑制Bcl-xL外部或内部的线粒体膜透化作用。有趣的是,Bcl-xL过度不抑制线粒体的PB1-F2-induced无序图3A)。这表明,线粒体的改变组织PB1-F2可能继续通过不同的机制,可能通过与微管蛋白的相互作用(见图5一个)。

由于不稳定的本质PB1-F2蛋白质和低细胞中的表达水平,上述研究进行在细胞系转染效率好,如A549和293 t细胞。这种策略的主要缺点是转换的本质,这些细胞,这可能会改变他们的凋亡反应。特别是,从图1和2,这些细胞通常是抵抗proapoptotic TNFα的影响,表明生存/促炎通路激活TNFα发挥主导作用。然而,PB1-F2蛋白的表达改变这种平衡向proapoptotic通路细胞系。

我们进一步评估PB1-F2-induced线粒体透化作用的机理和确定PB1-F2蛋白直接诱导线粒体内膜的细胞色素c的释放和损失潜在的在纯化小鼠肝线粒体图4一个和4B),这表明PB1-F2可能在渗透率transition-dependent表演方式。这个猜测是进一步支持当蛋白质PTPC ANT3和确定VDAC1 PB1-F2互动屏幕。

确认PB1-F2-induced线粒体透化作用所得通过毛孔ANT3-dependent地复杂,我们使用两个已知ANT3阻滞剂,英航和CsA。这些抑制剂PB1-F2-induced损失减毒的线粒体膜电位在纯化的线粒体(图7),在活细胞(图7B)。此外,英航抑制PB1-F2-mediated敏感的细胞凋亡TNFα(图8)。这表明,尽管同样的蛋白bcl - 2家族,PB1-F2蛋白可能permeabilize膜是非(6,8,9),它可以诱发内线粒体膜的渗透过渡ANT3-dependent方式。

ANT3局部内线粒体膜,导致细胞凋亡诱导形成特异性的毛孔,导致损耗的内在的线粒体膜电位。直接交互ANT3与几个细胞和病毒蛋白(包括艾滋病毒蛋白质冲程体积)已被证明导致线粒体透化作用,导致细胞凋亡(10,11]。ANT3参与细胞凋亡的重要性的观点最近被质疑发现基因敲除的小鼠同源染色体ANT3不改变细胞凋亡的诱导的39]。工作然而结果表明ANT3有至关重要的作用在调节渗透通过调节气孔的敏感性复杂过渡到Ca2 +激活和ANT配体(39]。类似于HIV冲程体积,流感病毒PB1-F2蛋白质可以作为直接配位体ANT3 [40]。

交互的PB1-F2蛋白质ANT3和VDAC1是一个令人惊讶的发现,因为据我们所知这是第一个病毒蛋白与组件的交互显示孔隙复杂位于线粒体膜内外。我们进一步确定,虽然与ANT3 PB1-F2蛋白发生相互作用通过其c端域(见图6),与VDAC1 PB1-F2蛋白质的相互作用是通过N - c端地区介导的。总的来说,这些数据表明VDAC1之间可能的复杂地层,ANT3, PB1-F2,即PB1-F2可能桥VDAC1 ANT3,促进形成PTPC(见图8B)。需要进一步的实验来确定是否如此复杂确实是在细胞内形成的。在这项研究中,我们没有进一步确定PB1-F2蛋白质残留ANT3和VDAC1负责交互。在先前的研究中,针对信号映射到内部的线粒体膜蛋白质的两性分子的螺旋在c端地区,符合我们发现PB1-F2 c端区域与内膜ANT3 [4]。两性分子的螺旋本身足以消除线粒体膜电位,和突变蛋白质的两性分子的螺旋废除了线粒体定位(4]。在这一点上,然而,我们无法单独mitochondrial-targeting PB1-F2 ANT3-binding域的蛋白质,因为缺乏线粒体定位也废除了PB1-F2-ANT3交互。支持我们的研究结果,PB1-F2蛋白质的氨基端区域目标与异种的线粒体内线粒体膜目标序列未能与ANT3交互,确认与PB1-F2 ANT3交互的特异性糖基。

渗透过渡的感应PB1-F2可以继续通过三种可能的机制(图8B)。通过其互动ANT3和VDAC1 PB1-F2可能作为两个蛋白质之间的桥梁,提高孔隙的形成复杂的机制(1)。另外,蛋白质可以单独行动的内在和外在的线粒体膜,分别结合ANT3和VDAC1(机制2)。后者模型支持的证据表明PB1-F2已被证明本地化内外线粒体膜和直接诱导膜透化作用[3,6]。最近的研究也表明,类似于bcl - 2家族的成员,PB1-F2蛋白能够形成multimeric复合物,它可能是负责membrane-permeabilizing活动(7]。因此,直接透化作用PB1-F2的线粒体膜蛋白复合物可以解释第三个可能机制。

我们选择我们的研究关注VDAC1和ANT3蛋白质主要是因为这些蛋白质被确定在我们的互动屏幕,而其他蛋白质局部线粒体内外膜和线粒体基质(Tom20、COXIV Tim44)被排除在外。此外,这些蛋白亚型是专门参与线粒体渗透性转换。然而,我们不能排除这样一种可能性,即PB1-F2蛋白也可能与其他亚型的蚂蚁和VDAC交互。尤其值得一提的是,最近的一项研究表明,VDAC2同种型与抑制线粒体凋亡[41]。ANT3-specific抑制剂的英航没有完全抑制PB1-F2-induced内膜透化作用表明,额外的玩家可以参与(图7A)。此外,虽然我们工作的结果提出的角色在PB1-F2-induced ANT3内线粒体膜透化作用,还需要进一步的实验来确定VDAC1蛋白质的作用和功能PB1-F2外膜蛋白。我们的研究目前受限于缺乏特定抑制剂对VDAC1蛋白质。实验正在进行中单独描述VDAC1在PB1-F2-induced线粒体透化作用。

自从PB1-F2蛋白质相对短暂和表达主要在后期感染周期的(3),其proapoptotic效应最有可能不是抑制病毒复制。根据我们的研究结果,我们提出以下模型模式PB1-F2蛋白质细胞内的行动(图8)。在感染周期的早期,PB1-F2定位线粒体,但不引起渗透率过渡由于其低水平呈现在细胞内。这允许维护细胞的生存能力,支持正常的病毒复制。在感染的后期,当足够PB1-F2蛋白质合成或细胞线粒体凋亡信号通路被激活时,线粒体进行渗透过渡。

虽然由流感病毒诱导细胞凋亡可能起初似乎违反直觉的有效的病毒生产,它已被证明是重要的在流感病毒复制。首先,流感病毒生产抑制稳定细胞系overexpressing bcl - 2,而激活半胱天冬酶3已被证明是重要的流感病毒的复制和传播12- - - - - -14,42]。此外,激活凋亡级联的建议在处理中发挥作用的流感病毒蛋白和成熟的病毒粒子43]。此外,我们推测,敏感的细胞死亡TNFα而不是直接诱导细胞凋亡的PB1-F2病毒可能有几个额外的有利影响。TNFα已被证明对流感病毒(施加强有力的抗病毒作用44],它很可能继续通过核转录因子kappa-B c-Jun n端kinase-dependent激活的抗病毒基因表达和分泌的抗病毒细胞因子,如I型干扰素(45]。敏感的细胞TNFα将最小化的proapoptotic影响抗病毒信号到其他细胞。支持这个理论,诱导细胞凋亡,流感病毒已被证明限制的释放促炎细胞因子(46]。正在研究分析可能的微分影响细胞因子诱导的野生型和突变病毒PB1-F2。最后,根据以前的工作建议,免疫细胞似乎更敏感PB1-F2诱导细胞凋亡,表示的发现PB1-F2 -淘汰赛流感病毒诱导细胞死亡比野生型病毒感染人类单核细胞。这个观察表明蛋白质可能在下调宿主的免疫反应中发挥作用感染(3]。有趣的是,ANT3各级和VDAC1蛋白表达在多种组织和细胞类型,包括淋巴细胞(47- - - - - -50]。因此这些蛋白质可能发挥作用的微分调节凋亡反应感染流感病毒后在不同的细胞类型。需要进一步的动物实验评价的功能PB1-F2蛋白质调制的免疫反应和其整体在流感病毒感染的发病机理中的作用。

材料和方法

细胞系、抗体、试剂。

293 t, A549和海拉细胞被从写明ATCC获得和维护在DMEM培养基(Gibco,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)补充10%胎牛血清(Hyclone,南洛根,犹他州,美国),100 U /毫升的青霉素G钠和100μg /毫升的硫酸链霉素(Gibco)。A549细胞稳定overexpressing Bcl-xL通过逆转录病毒集成使用pLNCX2向量生成系统与新霉素选择标记从Clontech(美国加州帕罗奥多市)。山羊多克隆抗体ANT3和VDAC1获得圣克鲁斯生物技术(美国加州圣克鲁兹);Bcl-xL单克隆抗体,细胞色素c、Tom20 Tim44和PARP获得Pharmingen(美国加州圣地亚哥);兔多克隆抗体从Clontech GFP得到;M30抗体裂解细胞角蛋白是罗氏公司(瑞士巴塞尔);抗体标记和HA抗原表位从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。人类anti-mitochondrial血清获得Immunovision(美国亚利桑那州,美国)。单克隆anti-PB1-F2小鼠的抗体生成(克隆26 d3)与全身免疫PB1-F2重组蛋白生产的大肠杆菌。多克隆血清anti-PB1-F2生成与全身免疫兔子PB1-F2重组蛋白质。英航、顺铂和重组tBid从σ获得;从Calbiochem G418和CsA(美国加州圣地亚哥);Mitotracker红色和JC-1染料,DAPI单克隆抗体anti-COXIV,二级fluorochrome-conjugated抗体获得分子探针(尤金,俄勒冈州,美国)。

构造和克隆。

pCAGGS向量表达的蛋白质控制鸡β-actin子一直在前面描述的51]。长篇ANT3互补,VDAC1 Bcl-xL,贝克,伯灵顿通过逆转录oligo-dT底漆与RNA从A549细胞。为每一个基因与gene-specific引物进行PCR。氨基端公顷或国旗标签被引入每个构造通过PCR 5′gene-specific引物具有标记序列。每个标记基因是哺乳动物引入pCAGGS向量表达pcDNA 3.1+向量(表达载体,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)体外转录。Bcl-xL基因被克隆到pLNCX2除了逆转录病毒载体(Clontech)稳定融入A549细胞。的PB1-F2基因是reverse-transcribed和放大gene-specific rt - pcr引物的流感病毒的病毒RNA / PuertoRico / 8/34的压力。介绍了氨基端HA国旗标签通过PCR上面列出。标记和未加标签的结构被克隆到pCAGGS向量为哺乳动物表达和pGEX6P-1向量(Amersham,小都,联合王国)的细菌表达GST融合蛋白。pCAGGS-GFP向量生成由pEGFP subcloning GFP基因向量(Clontech)。的HA-tagged PB1-F2-GFP融合构建被插入的长篇HA-tagged生成PB1-F2基因植入pCAGGS-GFP向量。HA-tagged结构表达C -或氨基端截断PB1-F2-GFP融合蛋白(分别HA-nF2-GFP和HA-cF2-GFP)是由扩增C -菌进行基因或氨基端域插入pCAGGS-GFP向量(见图4)。HA-MTS-nF2-GFP构造生成的三分子结扎HA-tagged细胞色素氧化酶MTS A549细胞的克隆序列(序列可以从Clontech)和n端结构域PB1-F2使用pCAGGS-GFP向量。每个生成的构造序列经自动测序进行西奈山测序核心设施。所有的引物序列可按照客户要求定制。

重组蛋白纯化的大肠杆菌。

主管胃俞细胞(Stratagene拉霍亚,加利福尼亚,美国)与pGEX6p-1向量转化培养OD600年2月份0.6的xyt媒介。2 h细胞诱导的37°C和1毫米IPTG,收集在PBS,冻结。GST融合蛋白的纯化进行了使用谷胱甘肽琼脂糖树脂(Amersham)根据制造商的协议。与谷胱甘肽纯化蛋白要么是筛选了缓冲区(Amersham) GST融合蛋白,或裂解销售税在列Prescission蛋白酶(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)和PBS筛选了。

转染本地化和细胞凋亡检测。

A549和海拉细胞生长在盖玻片转染24-well菜1μg向量的利益使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。24小时后,细胞被固定为5%甲醛在PBS和permeabilized Triton x - 100年的1%。感兴趣的蛋白质被间接免疫荧光可视化。细胞探测与特定的主要抗体在室温下2小时,洗净,用二次抗体标记结合到特定的荧光团。用激光扫描共焦显微镜观察标记细胞(TCS-SP;徕卡,位于德国)与TCS-SP软件图像捕获。德国蔡司(从)Axiovert 200与蔡司显微镜Axiovision软件被用于活细胞的荧光分析。描述了协议的评估,他们其他地方(22]。简单地说,细胞转染24 h,使胰蛋白酶化,resuspended在无血清培养基。细胞形态学分析起泡和碎片在相差显微镜下接下来的小时。

线粒体细胞色素c的释放试验的净化。

新孤立Balb / c小鼠肝脏是均质和分馏根据前面描述的协议52]。纯化的线粒体在MRM-S resuspended缓冲区(250毫米蔗糖,消息灵通的10毫米,1毫米ATP,琥珀酸5毫米,0.08毫米ADP, K和2毫米2HPO4[pH值7.4])的最终浓度10毫克/毫升的蛋白质。线粒体细胞色素c的释放化验,50μg(通过总蛋白)与重组PB1-F2孵化或tBid蛋白1 h在30°c 25μl的总量。孵化后,线粒体是颗粒状和上层清液对细胞色素c的释放是收集和分析通过免疫印迹细胞色素c,而线粒体Tom20颗粒是由免疫印迹分析。

与JC-1荧光测定线粒体膜电位。

纯化的线粒体(50μg)与蛋白质的兴趣表示孵化时间如上所述。孵化后,1毫升的200 nM JC-1染料在MRM-S缓冲区添加到线粒体和孵化RT 10分钟。JC-1荧光测量在Bio-Rad(大力神,加利福尼亚,美国)荧光计的励磁过滤器490 nM和590 nM的排放过滤器。

体内GST-fusion蛋白质表达和销售税下拉。

细胞识别的扶少团团员,在15厘米的菜肴被转染293 t细胞15μg哺乳动物表达载体编码GST-fusion感兴趣的蛋白质。细胞收集30 h post-transfection和细胞溶解coimmunoprecipitation缓冲区(见下文)。溶菌产物与谷胱甘肽珠子4 h,孵化和珠子是旋转下来洗十次裂解缓冲。蛋白质与谷胱甘肽洗脱筛选了珠子的缓冲区,由制造商推荐的指示(Amersham)。

质谱和蛋白质鉴定。

筛选了蛋白质的部分最初由sds - page(10%)和分析了银染色。质谱分析,筛选了蛋白质在sds - page分离(10%)和可视化Coomassie蓝染色。乐队的利益被削减从凝胶,使退色,减少,烷基化,用胰蛋白酶消化。Micro-HPLC胰蛋白酶的多肽的分析是由使用一个LCQ电喷雾离子阱质谱计(ThermoFinnigan沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)耦合到一个在线MicroPro-HPLC系统(Eldex实验室、纳帕,加利福尼亚,美国)。蛋白质被确定通过肽分子质量及其MS / MS片段数据搜索的国家生物技术信息中心nonredundant DNA和蛋白质序列数据库与程序KNEXUS(基因组的解决方案,安阿伯市密歇根,美国)。

免疫沉淀反应。

coimmunoprecipitation实验,293 t细胞在35 mm菜肴。每个合适的表达载体转染1μg使用Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司)根据制造商的协议。细胞收集30 h post-transfection和细胞溶解coimmunoprecipitation缓冲:NP-40 0.5%, 150毫米氯化钠,20毫米玫瑰(pH值7.4),1毫米EDTA, EGTA 1毫米,1毫米德勤,10%的甘油,完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和PMSF(罗氏)。蛋白质在一夜之间被孵化在4°C 1μg适当的抗体,和蛋白质复合物沉淀了G琼脂糖珠(罗氏)2 h。珠洗五次裂解缓冲和resuspended蛋白质样品缓冲。随后分离蛋白质12% sds - page和免疫印迹检测。

体外转录/翻译和销售税下拉。

蛋白质是由使用体外转录和翻译T7-coupled兔网织红细胞系统(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)35蛋白质标记组合(珀金埃尔默,韦尔斯利,加利福尼亚,美国)根据制造商的协议。结合实验,35S-labeled蛋白质是孵化与5μg GST-PB1-F2或销售税glutathione-Sepharose珠子在4°C 2 h绑定缓冲(PBS NP-40 0.25%和0.1% BSA)和用绑定缓冲三次。蛋白质样品的珠子被resuspended缓冲区,12% sds - page分离,荧光照相术和分析的蛋白质。可视化35荧光照相术S-labeled蛋白质的凝胶是固定的,在放大(Amersham)孵化,干之前接触的电影。

确认

我们感谢Domenico Tortorella博士帮助代稳定细胞系和Heike Dorninger帮助细胞凋亡检测。显微镜和质谱进行了西奈山医学院的核心设施(显微镜共享资源设施和质谱蛋白质组学实验室,分别),和支持的部分资金来自美国国立卫生研究院(NIH)国家癌症研究所资助(:R24 CA095823和CA88325)共享资源。这部分工作是由国家卫生研究院的基金(PP和AGS)和美国国立卫生研究院培训格兰特AI007647 (DZ)。页是一个埃里森在全球传染病医学基金会学者。

作者的贡献

DZ、AGS和PP的构思和设计实验。DZ, XX, PP进行了实验。AGS DZ, XX, RW和PP分析数据。DZ, CC、RW和PP贡献试剂/材料/分析工具。DZ和页写道。

引用

  1. 1。Garcia-Sastre interferon-mediated抗病毒反应的(2001)抑制甲型流感病毒和其他节段RNA病毒。病毒学279:375 - 384。
  2. 2。Garcia-Sastre,起来,Matassov D,布兰德年代,莱维德,et al .(1998)甲型流感病毒缺乏interferon-deficient NS1基因复制的系统。病毒学252:324 - 330。
  3. 3所示。陈W,卡尔沃PA, Malide D,吉布斯J,舒伯特U, et al。(2001)一种新型甲型流感病毒线粒体蛋白诱导细胞死亡。Nat地中海7:1306 - 1312。
  4. 4所示。Hornung吉布斯JS, Malide D, F, Bennink JR Yewdell JW(2003)流感病毒PB1-F2蛋白质通过预测目标内线粒体膜基本两性分子的螺旋破坏线粒体功能。J微生物学报77:7214 - 7224。
  5. 5。山田H, Chounan R,东Y, N,栗原君Kido H(2004)线粒体靶向序列的甲型流感病毒PB1-F2蛋白质和其在线粒体的功能。578年2月列托人:331 - 336。
  6. 6。Chanturiya, Basanez G,舒伯特U, Henklein P, Yewdell JW, et al。(2004) PB1-F2,一个流感病毒编码proapoptotic线粒体蛋白质,产生大小不等的毛孔平面类脂膜。J微生物学报78:6304 - 6312。
  7. 7所示。Henklein P,布鲁斯K, Nimtz M,雷V, Tessmer U, et al。(2005)甲型流感病毒蛋白质PB1-F2:合成和表征生物活性的完整蛋白质和肽有关。J Pept Sci 11: 481 - 490。
  8. 8。维埃拉霍奇金淋巴瘤,博雅P,科恩,El哈默尔C, Haouzi D, et al。(2002)细胞渗透BH3-peptides克服cytoprotective bcl - 2和Bcl-X效果(L)。致癌基因21:1963 - 1977。
  9. 9。Basanez G,张J,洲BN, Maksaev GI, Frolov VA, et al。(2001) Pro-apoptotic乳沟Bcl-xL形式细胞色素c-conducting毛孔的产品纯脂质膜。276年J临床生物化学:31083 - 31091。
  10. 10。博雅P, Roumier T, Andreau K, Gonzalez-Polo RA, Zamzami N, et al。(2003) Mitochondrion-targeted监管机构病毒起源的细胞凋亡。Biophys Res Commun 304: 575 - 581。
  11. 11。博雅P,罗克·B,获得G(2001)新EMBO成员的评:病毒和细菌蛋白调节细胞凋亡的线粒体水平。EMBO J 20: 4325 - 4331。
  12. 12。Nencioni L, Iuvara Aquilano K, Ciriolo先生,Cozzolino F, et al。(2003)甲型流感病毒复制是依赖于一个涉及谷胱甘肽抗氧化途径和bcl - 2。美国实验生物学学会联合会J 17: 758 - 760。
  13. 13。奥尔森CW, Kehren JC, Dybdahl-Sissoko NR,梦幻号和bcl - 2(1996)改变流感病毒产生,传播和血凝素糖基化。J微生物学报70:663 - 666。
  14. 14。梦幻号VS,奥尔森CW Dybdahl-Sissoko N,埃文斯D(1994)细胞凋亡:一种机制甲型和乙型流感病毒的细胞死亡。J微生物学报68:3667 - 3673。
  15. 15。范Gurp M, Festjens N, van厕所G,该项X,凡P(2003)线粒体膜间隙蛋白质在细胞死亡。Biophys Res Commun 304: 487 - 497。
  16. 16。Zamzami N,获得G(2001)细胞凋亡的线粒体:潘多拉的盒子打开。Nat牧师摩尔细胞生物2:67 - 71。
  17. 17所示。Martinou JC,绿色博士(2001年)打破了线粒体的障碍。Nat牧师摩尔细胞生物2:63 - 67。
  18. 18岁。特纳G,普通人一个,Riede B, Brdiczka D(1998)孔蛋白之间的复合体,己糖激酶、线粒体肌酸激酶和腺苷酸转运蛋白的显示属性孔隙渗透率过渡。监管的含义渗透过渡的激酶。Biochim Biophys学报1368:7 - 18。
  19. 19所示。Vyssokikh我,Brdiczka D(2003)复合物的功能之间的线粒体外膜孔隙(VDAC)和腺嘌呤核苷酸移位酶调节能量代谢和细胞凋亡。Acta Biochim波尔50:389 - 404。
  20. 20.Valentijn AJ, Gilmore美联社(2004)易位的长篇,线粒体在女性。279年J临床生物化学:32848 - 32857。
  21. 21。Puthalakath H, Villunger A、O ' reilly拉博蒙特詹,Coultas L, et al。(2001) Bmf:一个proapoptotic BH3-only蛋白质受交互与肌动蛋白肌凝蛋白V汽车复杂,激活女性。科学293:1829 - 1832。
  22. 22。弗里希SM(1999)证据death-receptor-related的函数,在女性death-domain-containing蛋白质。咕咕叫杂志9:1047 - 1049。
  23. 23。清水,Tsujimoto Y (2000) Proapoptotic BH3-only bcl - 2家族成员诱导细胞色素c的释放,但不是线粒体膜电位的损失,并且不直接调节压敏电阻器阴离子通道的活动。97年《美国国家科学院刊年代:577 - 582。
  24. 24。Halestrap美联社,Brennerb C(2003)腺嘌呤核苷酸移位酶:线粒体通透性转换孔的中心组件和细胞死亡的关键球员。咕咕叫地中海化学10:1507 - 1525。
  25. 25。Vyssokikh M, Brdiczka D (2004) VDAC和外围将复合物在健康和疾病。学生物化学摩尔细胞。256 - 257 (2):117 - 126。
    • 26岁。清水,成田M, Tsujimoto Y (1999) bcl - 2家族蛋白质调节释放apoptogenic VDAC线粒体细胞色素c的频道。自然399:483 - 487。
    • 27。睡梦中R, Brini M,华人P, Murgia M, Pozzan T(1995)嵌合绿色荧光蛋白作为可视化工具在活细胞亚细胞的细胞器。咕咕叫杂志5:635 - 642。
    • 28。亨德森PJ,拉迪哈(1970)Bongkrekic酸。线粒体的腺嘌呤核苷酸移位酶的抑制剂。245年J临床生物化学:1319 - 1326。
    • 29。丹尼尔NN, Korsmeyer SJ(2004)细胞死亡:关键控制点。细胞116:205 - 219。
    • 30.获得G(1997)原癌基因bcl - 2在调节细胞凋亡及其作用。Nat地中海3:614 - 620。
    • 31日。了P,何鸿燊Y, Wetzler LM (2000)脑膜炎奈瑟氏菌孔蛋白PorB与线粒体和保护细胞免受细胞凋亡。97年《美国国家科学院刊年代:9070 - 9075。
    • 32。穆勒,冈瑟D, Brinkmann V,赫维茨R, Meyer TF, et al。(2000)针对pro-apoptotic VDAC-like孔蛋白(PorB)淋病奈瑟氏菌感染细胞的线粒体。EMBO J 19: 5332 - 5343。
    • 33。Z,压力啊千瓦,堰R,西迪基(2000)乙肝病毒X蛋白colocalizes线粒体与人类压敏电阻器阴离子通道,HVDAC3,改变其跨膜电位。J微生物学报74:2840 - 2846。
    • 34。Goldmacher VS,巴图LM, Skaletskaya迪翁CA, Kedersha问,et al。(1999) cytomegalovirus-encoded mitochondria-localized bcl - 2细胞凋亡结构无关的抑制剂。96年《美国国家科学院刊年代:12536 - 12541。
    • 35。Jacotot E,费里KF, El哈默尔C,布兰诺C, Druillennec年代,et al。(2001)控制线粒体膜透化作用由腺嘌呤核苷酸转运蛋白与hiv - 1病毒蛋白质交互rR和bcl - 2。J Exp 193: 509 - 519。
    • 36。埃弗雷特H, Barry M,太阳X,李科幻,弗朗茨C, et al。(2002)粘液瘤痘病毒蛋白质,M11L,防止细胞凋亡与线粒体通透性转换孔直接交互。J Exp 196: 1127 - 1139。
    • 37岁。苏F,施耐德RJ(1997)乙型肝炎病毒HBx蛋白质糖分会让细胞凋亡导致的肿瘤坏死因子α。94年《美国国家科学院刊年代:8744 - 8749。
    • 38。Rytomaa M,马丁斯LM,向下J (1999) FADD的参与和caspase-8 detachment-induced凋亡信号。咕咕叫杂志9:1043 - 1046。
    • 39岁。Kokoszka我Waymire公斤,利维,斯莱我,Cai J, et al。(2004) ADP / ATP转运蛋白线粒体渗透性转换孔是不重要的。自然427:461 - 465。
    • 40。Jacotot E, Ravagnan L,吕弗勒M,费里KF,维埃拉霍奇金淋巴瘤,et al .(2000)的hiv - 1病毒蛋白R通过直接影响凋亡的线粒体渗透性转换孔。J Exp 191: 33-46。
    • 41岁。程呃,Sheiko电视,费舍尔JK, Craigen WJ, Korsmeyer SJ (2003) VDAC2抑制贝克激活和线粒体凋亡。科学301:513 - 517。
    • 42。威廉姆斯WJ Planz O, Ehrhardt C,杜松子酒,Silberzahn T, et al。(2003)激活半胱天冬酶3对高效的流感病毒传播至关重要。EMBO J 22: 2717 - 2728。
    • 43。罗伊RJ(2003)流感病毒诱导细胞凋亡的内在和外在机制。Int牧师Immunol 22: 425 - 449。
    • 44岁。Seo SH,韦伯斯特RG(2002)肿瘤坏死因子α施加强大的抗流感病毒在肺上皮细胞的影响。J微生物学报76:1071 - 1076。
    • 45岁。莱维德,Garcia-Sastre(2001)病毒战斗:干扰素诱导的抗病毒状态和病毒逃避机制。细胞因子生长因子牧师12:143 - 156。
    • 46岁。Brydon表示电子战,史密斯H,甜蜜的C(2003)甲型流感病毒诱导细胞凋亡在细支气管上皮细胞(NCI-H292)限制炎性细胞因子释放。J创84:2389 - 2400。
    • 47岁。Doerner, Pauschinger M, Badorff Noutsias M,吉森年代,et al。(1997)组织转录模式的腺嘌呤核苷酸移位酶亚型。414年2月列托人:258 - 262。
    • 48。Stepien G, Torroni涌AB,霍奇是的,华莱士直流(1992)腺嘌呤核苷酸的微分表达式转运蛋白亚型在哺乳动物组织和肌肉细胞分化。267年J临床生物化学:14592 - 14597。
    • 49。凯塞H, Kratzin高清,Thinnes FP, Gotz H,施密特,et al .(1989)[人体名叫鉴定。二世。的特征和主要结构31-lDa孔蛋白从人类B淋巴细胞(孔蛋白31 hl)。]。临床生物化学霍普Seyler 370: 1265 - 1278。
    • 50。Yu WH Blachly-Dyson E, Zambronicz EB,亚当斯V, McCabe呃,et al .(1993)克隆和功能在酵母表达的两个人类亚型外线粒体膜通道,压敏电阻器阴离子通道。268年J临床生物化学:1835 - 1841。
    • 51。丹羽宇一郎H, Yamamura K,宫崎骏J(1991)有效选择高表达与小说真核转染子向量。基因108:193 - 199。
    • 52岁。魏MC, Lindsten T,而VK,维勒年代,总值,et al。(2000) tBID membrane-targeted死亡配体,oligomerizes BAK基因释放细胞色素c。Dev 14: 2060 - 2071。