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文摘
肺炎是由各种病原体和被认为是人类最常见的传染性死亡原因。小鼠急性肺部感染模型反映人类病态在许多方面和有助于我们对疾病的理解和发展新的治疗策略。尽管在其他领域的进步组织成像,组织病理学仍是最决定性的和实际读出工具小鼠肺炎的描述性和半定量的评价和治疗干预措施。在这里,我们系统地描述和比较的独特的组织病理学特征建立模型诱发小鼠急性肺炎链球菌(。肺炎),金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,鲍曼不动杆菌,嗜肺性军团菌,大肠杆菌即,中东呼吸系统综合症冠状病毒,甲型流感病毒(IAV)和重复感染IAV-incuced肺炎年代。肺炎。系统比较的模型显示显著的不同病变的分布,肺炎引起的特点,主要炎性细胞类型,邻近组织病变,在组织学部分病原体的检测能力。因此我们确定核心标准为每个模型适合实际的半定量的评分系统,考虑肺炎的病原体和模型相关的模式。其他重要影响因素实验病理进行了讨论,包括感染剂量、时间动力学,和鼠标菌株的遗传背景。模型相关的病理之间的实质性差异强调病原体——的必要性和model-adapted标准比较量化的实验结果。这些标准也允许标准化治疗策略在临床前模型的验证和比较。
引用:Dietert K, Gutbier B, Wienhold SM,瑞普K,江X,姚明L, et al。(2017)的病原体和模型相关的组织病理学在小鼠模型的急性肺炎。《公共科学图书馆•综合》12 (11):e0188251。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0188251
编辑器:Samithamby Jeyaseelan,路易斯安那州立大学,美国
收到:2017年7月21日;接受:2017年的11月5日;发表:2017年11月20日
版权:©2017 Dietert et al。这是一个开放分布式根据文章188滚球软件知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
数据可用性:内的所有相关数据。
资助:这项工作是支持的德国研究基金会(DFG) SFB-TR 84 (https://www.sfb-tr84.de/)A1, A5(狐臭),B2(萨达姆政权),B3 (H.H), C3, C6(分子量),C8 (L.E.S), Z1a (A.C.H.), Z1b (A.D.G.), DFG KFO 309 (http://www.kfo309.de/)(S.B. P2,年代。H。和C.P.), P8 (to S.H.), DFG SFB-1021 (http://www.sfb1021.de/)C5(萨达姆政权),EXC147 (http://www.eccps.de/)(萨达姆政权)和卓越Jena学校研究生院微生物通信(公司,H.S.) (http://www.jsmc.uni-jena.de)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
作为最常见的传染病之一,肺炎引起巨大的社会经济负担在工业化国家(1),是全世界儿童主要的传染性死亡原因(2]。很多种类的病原体可引起急性肺炎(3)和肺炎的风险的条件下大大提高肺受损宿主防御,包括前病毒感染(4),机械通气(5和脓毒症6]。社区获得性肺炎的主要病原(CAP)是革兰氏阳性细菌链球菌(。肺炎)(7,8)占大多数的上、下呼吸道细菌感染和负责每年数以百万计的人死亡9,10]。帽甲型流感病毒的另一个原因(IAV)感染导致肺衰竭迅速发展有限的治疗方案和频繁的致命的结果(3,11,12]。此外,IAV细菌重复感染,一般复杂的感染主要引起的年代。肺炎,导致严重的进行性肺炎与死亡率增加有关(13]。相比之下,革兰氏阴性和兼性胞内菌军团菌(左。)瞭解的病原体是严重限制退伍军人的疾病,第二个最常见的病原体检测肺炎患者承认重症监护病房(ICU)在工业化国家14,15]。然而,与机械通气相关肺炎(VAP)除了帽,也是医院icu中发病率和死亡率的主要原因(16)和病原体的频谱是转移这些形式的肺炎。在这里葡萄球菌的。)球菌,克雷伯氏菌(K。肺炎),不动杆菌(。)baumannii,大肠杆菌(E。)杆菌有被隔离不同数据大相径庭17- - - - - -19]。更具体地说,革兰氏阴性K。肺炎是一个重大机会病原体造成严重危及生命的院内呼吸道感染(20.- - - - - -22),而年代。葡萄球菌革兰氏阳性细菌,是最常见的病原体的社区之一,在人类和院内下呼吸道感染占一个重要的健康和经济负担23- - - - - -25]。一个。baumannii和E。杆菌无处不在的革兰氏阴性细菌,最近成为community-associated的主要原因,医院(26,27与机械通气相关肺炎)和(19,28)以及败血症诱导急性肺损伤(ALI) (29日,30.]。
此外,最近发现肺病原体表明小说新兴疾病可能添加到列表的高度相关的肺炎,也可能感兴趣的研究在动物模型。例如,中东的呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)由单峰骆驼骆驼传播向量(31日)已成为全球严重的人类呼吸道疾病的原因(32,33)与老年人和免疫功能不全的个人尤其是沙特阿拉伯在风险最高(34- - - - - -36]。
各种形式的肺炎在特定实验性诱导的小鼠模型已经成功地复制急性肺炎(37- - - - - -39]。这些模型大大有助于我们理解社区,院内肺炎的发病机理以及全球新兴肺部感染和小说的发展是不可或缺的治疗策略(40- - - - - -42]。
组织病理学是一个强大的、可靠的和可再生的读出的工具形态变化的评价在动物肺部感染实验几十年来(43,44]。定性诊断是基于一个求和的显微镜下可观察到的变化的形态学和细胞成分参与的组织和细胞类型。更比较包容的病理信息在生物医学研究中,评分系统已经广泛应用,允许第一次半定量的评估病变相比,控制(44,45]。此外,所有临床前模型用于发展新的治疗策略和接受监管机构需要组织病理学评估委员会认证的病理学家的黄金标准定性和半定量的评价组织改变实验动物(46- - - - - -48]。
先前的研究已经显示第一个基本病理病变差异引起的不同的病原体在老鼠的肺38,41,42]。然而,得分方案对急性肺炎小鼠迄今已有非常肤浅,解决只有少数,而非特定的参数(45,49,50]。更重要的是,他们不允许差异化角度不同病原体或集团之间的比较,例如,野生型和转基因小鼠的感染。很明显,有一种强烈的需要更精确和病原体——以及模型相关参数,以便准确描述和semiquantification炎性表型的可靠和可再生的对比实验小组在每个模型。因此,我们最近适应更具体的评分标准年代。肺炎和年代。葡萄球菌,诱导肺炎(38,42]。然而,这样的pathogen-specific评分标准没有被用于其他小鼠肺病原体。
在这里,我们系统地描述和比较峰值的组织病理学炎症和损伤的九个先前建立急性肺部感染引起的模型年代。肺炎,年代。葡萄球菌,K。肺炎,一个。baumannii,l。瞭解,E。杆菌MERS-CoV IAV和重复感染IAV和肺炎双球菌。我们提供适当的模型相关的标准,可用于组织学定量比较,例如,当不同的治疗方法评估建立在这些模型。整个鼠标肺部分被用来获得完整的概述,尤其是损伤和炎症的分布模式。不同病原体通常相当的基础上,我们确定最合适的模型相关的变化评估标准为每一个模型,允许更精确的半定量的评估肺损伤的严重性和分布。
材料和方法
道德声明
这里的肺组织检查来自实验主要进行本研究以外的任何其他目的和其他大多数已发表(38,41,42,51- - - - - -53),除了一个。baumannii和E。杆菌实验将在其他地方出版。所有动物的程序和协议的机构伦理委员会批准Charite-University柏林,李比希大学吉森,菲利普斯马尔堡大学耶拿大学医院和当地政府当局(Landesamt毛皮和一厢情愿Soziales (LAGeSo)柏林,Regierungsprasidium (RP) Gießen达姆施塔特,Landesamt毛皮Verbraucherschutz(电磁阀)图林根),分别。许可证号码是0356/10 G, A-0050/15 (年代。肺炎),G (0358/11年代。葡萄球菌),75/2011 G, G 110/2014 (K。肺炎),0299/15 (一个。baumannii),G (0175/12l。瞭解),02-049/12 (E。杆菌),114/2012 (MERS-CoV), G 0152/12,和G 0044/11 (IAV和重复感染)。所有动物实验进行了严格按照欧洲实验室动物科学协会联合会(FELASA)准则和建议的护理和使用实验动物,和所有正在努力减少动物不适和痛苦。
所有老鼠,除了MERS-CoV感染小鼠,每隔12小时监控在整个实验评估外观、行为、梳理、呼吸、体重,和直肠温度。人道的端点定义(体温< 30°C,身体减肥= 20%,笨重的呼吸,加速呼吸结合惊人,疼痛或苍白),但是没有达成任何的老鼠在指定的时间点终止实验。MERS-CoV感染小鼠每天监测一次,外观,行为,梳理、呼吸和体重是协议。在这里,一个人道的端点(> 15%)的体重损失被定义,但是没有达成任何的老鼠使用由于其良好的临床结果在感染剂量使用。
老鼠
对所有实验感染模型,除外K。肺炎岁的雌性老鼠(8 - 12周,体重17-22 g)被随机分配给组(n = 2 - 4)每笼而在K。肺炎雌性和雄性小鼠模型(第23 - 25周,重22 - 24岁g)被用于模型具体原因(41]。此外,对所有实验感染模型,specific-pathogen-free (SPF)对C57BL / 6小鼠(所有MERS-CoV除外)或BALB / c(正如前面用于MERS-CoV模型(52,54])背景使用和安置在单独通风笼防晒系数条件下的室温22±2°C和55±10%的相对湿度。12小时光/ 12小时黑暗周期维护和动物有无限制地标准颗粒食物和自来水。所有实验的细节感染模型是应用相比以前公布后,建立协议部分感染剂量、不同的感染途径和时间点考试由于病原体——或模型的具体原因,如下面。
细菌感染,除了E。杆菌、老鼠与氯胺酮麻醉腹腔内(80毫克/公斤)(Ketavet;辉瑞公司、德国柏林)和甲苯噻嗪(25毫克/公斤)(Rompun;拜耳勒沃库森,德国)。对于病毒感染实验,小鼠麻醉使用吸入异氟烷(Forene;雅培、威斯巴登、德国)。肺组织学,所有老鼠除了MERS-CoV模型通过尾被放血人道安乐死腔静脉经过预拌腹腔注射氯胺酮麻醉(160毫克/公斤)和甲苯噻嗪(75毫克/公斤)。MERS-CoV感染小鼠后,颈椎错位人道安乐死异氟烷麻醉。
细菌感染
年代。肺炎据国家反恐怖主义中心(血清型3株,7978),年代。葡萄球菌纽曼(10833年国家反恐怖主义中心的),K。肺炎(血清型2,写明ATCC 43816),一个。baumannii(RUH 2037),l。瞭解(血清组1株,小32)所描述的培养(37,38,40,55,56)和resuspended无菌PBS。小鼠麻醉腹腔内(i.p)与氯胺酮(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(25毫克/公斤)和底接种5 x 106CFU年代。肺炎老鼠(n = 14), 5 x 107CFU年代。葡萄球菌(n = 4), 5 x 108CFU一个。baumannii(n = 8) 20μl PBS。老鼠底感染l。瞭解(n = 8)收到1×106在40μl CFU PBS。小鼠感染K。肺炎(n = 16)收到3.5 x 105CFU气管内的50μl生理盐水(0.9%)通过微灌®毒素(模型IA-1b、Penn-Century Inc .)位于宾州怀因特摩尔市,PA)使用intubation-mediated气管内的滴注法通过完整的航空公司(57)曾被优化这个模型(41,57- - - - - -59]。
E。杆菌(写明ATCC 25922)从-80°C甘油股票添加到磅肉汤(卡尔·罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)和孵化12小时200 rpm和37°C公司为5%2。光密度的0.03调整磅肉汤其次是孵化midlogarithmic阶段之前1.5小时200 rpm和37°C。离心后,颗粒在无菌0.9%氯化钠resuspended 8 x 105CFUE。杆菌/ 200μl和腹腔内接种(n = 10)。
病毒感染和重复感染
首次转导人力DPP4后续感染BALB / c小鼠MERS-CoV (hCoV EMC)病毒培养和准备所描述的52,54,60]。老鼠的腺病毒载体转导与20μl底编码人类DPP4 mCherry最后一效价为2.5 x 108每剂微升(AdV-hDPP4;ViraQuest Inc .),导致hDPP4表达在上皮车厢的肺60)和底感染的最终效价7 x 104TCID5020的MERS-CoVμl DMEM (n = 17)在异氟烷麻醉(Forene;雅培、威斯巴登、德国)。
甲型流感病毒/公关/ 8/34 (H1N1);PR8)所描述的生长42)和小鼠感染100年50 PFU PR8底μl PBS (n = 4)在异氟烷麻醉。
重复感染实验,应用IAV感染过程如上所述40 PFU PR8 50μl PBS。病毒感染后8天,年代。肺炎被培养为描述(37)和resuspended无菌PBS。小鼠麻醉腹腔内和底接种1 x 103CFU年代。肺炎在20μl PBS (n = 4)。
组织病理学
老鼠人道安乐死在模型相关的时间点作为表示(表1)。2和6之间重复整个实验过程进行的每个模型相似的每个重复组大小。气管肺部都仔细结扎后删除,以防止肺泡崩溃,immersion-fixed在福尔马林溶液pH值7.0 24至48小时(MERS-CoV 7天),嵌入在石蜡,切成2μm部分和苏木精和伊红染色(他)在二甲苯脱蜡后和补液降低乙醇浓度。细菌是可视化使用染色和克(布朗和Brenn修改)污渍。显示的整个肺概述,他整个肺部分的彩色幻灯片自动数字化使用Aperio CS2幻灯片扫描仪(徕卡生物系统成像Inc .)、钙、美国)和图像文件生成使用图像软件(徕卡生物系统成像Inc .)范围。
三个均匀分布的器官水平的部分在整个肺显微镜下评估评估病理改变的分布和特征,生成一个修改面板使用的特定肺部炎症参数适应每个病原体(表1和表2)。所有考试都是由训练有素的动物实验病理学家。
免疫组织化学
的免疫组织化学检测年代。肺炎和IAV (H1N1)、抗原检索进行了微波加热在10毫米(600 W)柠檬酸(750毫升,pH值6.0)12分钟(min)。肺部分被孵化与纯化兔多克隆抗体年代。肺炎(由美国哈默施密特下,请提供)或纯化山羊多克隆抗体IAV H1N1 (1:4,000、OBT155 Bio-Rad, Puchheim,德国)在一夜之间在4°C。孵化与immuno-purified兔子和山羊在同一稀释抗体作为消极的控制。随后,幻灯片和二次孵化,碱性phosphatase-conjugated山羊anti-rabbit(1:50 0,美联社- 1000,向量,伯林盖姆,CA)抗体在室温下为30分钟。碱性色原triamino-tritolyl-methanechloride (Neufuchsin)用作磷酸酶底物显色。所有幻灯片都与苏木精复染色,通过分级乙醇脱水,二甲苯和盖玻片。
结果
肺炎链球菌
底感染的老鼠年代。肺炎血清型3导致广泛的组织损伤和免疫细胞的渗透是典型的产气的细菌性肺炎。特定的模型,病变广泛扩展到肺的边缘叶(图1)与炎症密切气管和血管周围。肺炎球菌传播导致早期免疫反应主要表现为主要intrabronchial (图1 b)和intraalveolar (图1 c)入渗的中性粒细胞引发小叶,化脓性支气管肺炎肺区域整合的影响。大面积的凝固和液化坏死(图1 d箭头)的细胞分裂,腐烂,和损失的细胞细节,积累细胞和karyorrhectic碎片以及核破裂,karyopyknosis,核溶解连续出血也在场。广泛扩张了血管周围间质水肿,由于血管渗漏(53]溢出大量的中性粒细胞招募到血管周的空间(图1 e)。此外,化脓性和坏死性血管炎伴有透明小型血管内血栓是偶尔出现,表明早期败血症的早期组织学证据。肺血管通透性增加(53]也导致扩大的地区富含蛋白质的肺泡水肿表现为同质,轻轻粉红色材料内的肺泡空间在他染色(图1 f星号)。独特的肺炎球菌病的组织病理学特征是大量的发生化脓性坏死性胸膜炎(图1克箭头)和脂肪组织炎(图1 h)广泛分散的细菌进入胸腔,可能占的痛苦和病态的临床行为影响小鼠的迅速发展。无数的肺炎双球菌是清晰可见的蓝色到紫色圆点的大小大约1μm标准他污点,大多位于胸膜表面,在纵隔脂肪组织或肺部血管周的空间内。
(a)肺组织学底感染后的老鼠年代。肺炎(5 x 106CFU /鼠标)显示广泛膨胀(A)、化脓性,坏死性支气管肺炎(模拟),主要通过渗透支气管腔内中性粒细胞(B)和肺泡(C)和大面积的坏死和出血(D,箭头)。附加功能包括中性粒细胞浸润和水肿血管周的空间(E)、严重的肺泡水肿(F,星号)和necropurulent胸膜炎(G,箭头)和脂肪组织炎(H)。(a)代表图片所示。酒吧(A), 1毫米;(罪犯F-H), 20μm;(E), 50μm。
金黄色葡萄球菌
相比之下,底感染年代。葡萄球菌导致多病灶的广泛但non-expansive支气管肺炎主要位于肺门附近图2),影响支气管、肺泡和间质。主要的炎性细胞群由中性粒细胞,主要导致化脓性(图2 b和c)病变倾向脓肿形成。与肺炎双球菌,巨噬细胞也存在尽管数量低于中性粒细胞。(图2 c)。类似于克雷伯氏菌和链球菌,大面积的坏死和出血(图2 d)。血管周的地区主要是由淋巴细胞和中性粒细胞减少(渗透图2 e)。相比年代。肺炎上述模型(53)、血管渗透性似乎稍微增加报道之前(38)和血管周围水肿(图2 e)以及富含蛋白质的肺泡水肿(图2 f星号)也存在虽然一定程度上。胸膜炎和脂肪组织炎观察符合一个相当良好的临床结果条件下使用。此外,葡萄球菌主要是检测不到他污点,可能是由于低肺内的细菌传播。
(f)底感染的老鼠年代。葡萄球菌(5 x 107CFU /鼠标)导致non-expansive (A),化脓性(B, C)坏死性(D)支气管肺炎与中性粒细胞和淋巴细胞渗透到血管周的空间(E)和富含蛋白质的肺泡水肿(F,星号)。(f)代表图片所示。酒吧(A), 1毫米;(C, D, F), 20μm;50μm (B, E)。
k .肺炎
气管内的感染的老鼠K。肺炎与病变严重程度增加导致严重的广泛的支气管肺炎肺外围(图3)。招募免疫细胞主要由中性粒细胞,导致化脓性(图3 b化脓性)(图3 c支气管肺炎出血和坏死以及中性间质性肺炎(图3 d)在受影响的地区。增加血管通透性报道(40与巨大的肺泡(相关)图3 d星号)和血管周围水肿(图3 e),混在无数的细菌容易表现为紫色点他的污点。化脓性坏死性血管炎,胸膜炎(图3 f箭头)和脂肪组织炎也是现在和与标记相关细菌传播,迅速致命的临床结果。
(f)气管内的感染的老鼠K。肺炎(3.5 x 105CFU /鼠标)导致的(A),化脓性(B)化脓性(C)支气管肺炎以及中性间质性肺炎(D)与严重的肺泡(D,星号)和血管周的(E)水肿、大量fibrinopurulent和坏死性胸膜炎(F,箭头)和脂肪组织炎。(f)代表图片所示。酒吧(A), 1毫米;(B, D, F), 20μm;(E), 50μm;(C) 100μm。
答:baumannii
底后感染一个。baumannii、老鼠开发了一个广泛的(图4)与浸润中性粒细胞为主引起化脓性支气管肺炎(图4 b)化脓性炎症在肺泡出血、间质和大面积的实质坏死以及肺泡水肿。血管周的空间有轻度至中度水肿和浸润的淋巴细胞和中性粒细胞(图4摄氏度)。血管血栓形成是一种常见的变化(图4 d箭头),小型血管。类似于葡萄球菌,不动杆菌被他看不见的污点和胸膜炎和脂肪组织炎。
(模拟)肺组织学底感染后的老鼠一个。baumannii(5 x 108CFU /鼠标)显示广阔的(A)、化脓性(B)与血管周的炎症和水肿化脓性支气管肺炎(C)和血管血栓形成(D,箭头)。(模拟)代表图片所示。栏(一),1毫米;(C, D), 20μm;(B), 50μm。
退伍军人
底感染的老鼠l。瞭解导致不同的损伤模式取决于检查感染后的时间点。在感染后48小时,non-expansive间质性肺炎被发现在靠近门(图5)和著名的肺泡壁坏死(图5 b)。在白天6点,特别是浸润的巨噬细胞的数量明显增加,从而加重了血管周的肉芽肿形成(图5度箭头)。在这里,标志着大多数血管淋巴细胞成套以及高度激活的内皮细胞(图5 d箭头)观察。在这两个时间点,胸膜炎和脂肪组织炎。细菌在他无形的彩色部分。
(模拟)底感染后48小时和6天l。瞭解(1 x 106小鼠CFU /鼠标),开发non-expansive (A),坏死,组织细胞的间质性肺炎(B)与周围的肉芽肿形成血管(C,箭头)和著名的淋巴细胞性血管周的成套与高度激活内皮细胞(D,箭头)白天6点。(模拟)代表图片所示。栏(一),1毫米;(罪犯),20μm。
大肠杆菌
腹腔内感染后,hematogeneous传播E。杆菌肺部已经导致扩散,间质化脓性肺炎、广泛地影响整个肺部,造型sepsis-induced阿里(图6)。牙槽间的间质是严重渗透,与中性粒细胞(图6 b)与血管周围最突出的聚合(图6 c通过循环),符合细菌进入。无数透明血栓出现在小型血管(图6 d箭头),暗示播散性血管内凝血病(DIC)由于细菌败血症。大,杆状细菌很容易检测到肺外,主要存在于食道周围的脂肪组织,可能是因为当地的传播E。杆菌通过腹腔。
腹腔内感染后(模拟)E。杆菌(5 x 108小鼠CFU /鼠标),发生弥漫性(A),中性间隙(B)和血管周的强调(C)肺炎有显著的血管血栓形成(D,箭头)。(模拟)代表图片所示。栏(一),1毫米;(罪犯),20μm。
MERS-coronavirus
底感染MERS-CoV adenoviral转导后人类DPP4产生了一个广阔的,(图7)与严重的肺泡上皮细胞坏死和间质性肺炎的渗透主要是巨噬细胞,淋巴细胞和中性粒细胞减少(图7 b)。只有温和的支气管旁(图7 c)和血管周的(图7 d)淋巴细胞渗入在场大多数静脉血管有明显的血管壁纤维素样变性和坏死(图7 d星号)。额外MERS-CoV感染的特点是大面积的富含蛋白质的肺泡水肿(图7 e箭头),明显出血血管周围和肺泡空间内和间质(图7 f、箭头)和透明小型血管内血栓的形成。
(f)底感染MERS-CoV (7 x 104TCID50/鼠标)导致的(A),坏死,mixed-cellular bronchointerstitial肺炎(B)和支气管旁血管周的浸润的淋巴细胞(C, D),标志着纤维素样变性的血管(D,星号)、肺泡水肿(E,箭头)和出血(F,箭头)。(f)代表图片所示。栏(一),1毫米;(B, C, E, F), 20μm;(D), 50μm。
甲型流感病毒
底IAV感染后,小鼠肺显示广泛的分布式bronchointerstitial肺炎只局限于单肺叶(图8)。肺泡坏死是突出和肺泡septae广泛浸润炎症细胞(拉长了图8 b)。支气管上皮细胞明显坏死(图8 c箭头)和广泛的支气管腔。间质和肺泡巨噬细胞和淋巴细胞作为主要的效应细胞(图8 d)和著名的血管周围淋巴细胞成套(图8 e)是一个变化特征。此外,大面积的肺泡水肿(图8 f,星号),尽管在一个小得多的程度上,地区间质和肺泡内的出血,表明血管损伤和通透性增加。
(F)底后感染,IAV(100微升/鼠标)导致扩散(A),坏死性(B), bronchointerstitial肺炎(B, C)明显坏死和脱落的支气管上皮细胞(C,箭头),lympho-histiocytic intraalveolar和牙槽间的间质浸润(D),突出血管周的成套的淋巴细胞(E)和富含蛋白质的肺泡水肿(F,星号)。(f)代表图片所示。栏(一),1毫米;(罪犯,F), 20μm;(E), 50μm。
重复感染甲型流感病毒肺炎年代。肺炎
当老鼠被感染之前IAV感染年代。肺炎组合,取幂模型观察24小时后的表型。病变广泛的肺外围,但限于单肺叶pre-damaged IAV (图9)。肺炎的特点包括大量中性粒细胞浸润到肺泡(图9 b)和支气管,严重的典型特征,化脓性支气管肺炎。支气管上皮细胞几乎完全坏死和支气管充满脓(图9 c)。血管周的空间被中性粒细胞和淋巴细胞(水肿和渗透图9 d)只有轻度淋巴细胞性血管周的成套(图9 e)是礼物。严重的富含蛋白质的肺泡水肿是看到的,类似的年代。肺炎mono-infection (图9 f)。肺炎双球菌,很难想象他污点,可能是因为这里使用的传染性低剂量mono-infection相比。
(f)重复感染年代。肺炎(1 x 103CFU /鼠标)的小鼠感染IAV (40 PFU /鼠标)早些时候导致严重膨胀(A)、化脓性支气管肺炎(B)与明显坏死的支气管充满脓(C)。此外,血管周围浸润的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞显著水肿(D)以及轻微的纯粹的淋巴细胞,血管周的密集成套在其他领域(E)和富含蛋白质的肺泡水肿(F,星号)。(f)代表图片所示。酒吧(A), 1毫米;(B-F), 20μm。
分布、扩张和对称
前处理组织病理学、小实验感染小鼠肺组织样本通常删除基因和/或蛋白的分子分析表达式或其他读出系统获得额外的信息。获取代表数据从这些样本可以与组织学变化,是至关重要的了解病变的分布的均匀性。此外,一些实验协议建议使用肺部的左右两半,分别为不同的分析方法,又期待病变同质性和对称性。但是,当我们分析了肺部病变的分布和左右对称的感染模型,我们发现了一个大范围的不同分布和不对称(图10)。原则上,病变分布遵循的路线病原体进入肺部。然而,倾向向外围扩散后的叶aerogenous不同病原体感染不同,尽管类似aerogenous感染途径。主要集中集中引起的病变年代。葡萄球菌和l。瞭解保持接近门没有外围扩张的趋势。感染年代。肺炎,一个。baumannii和MERS-CoV导致病变紧密围绕主要气道部分与离心向外围扩张。相比之下,引起的病变K。肺炎大多位于叶和航空和弱得多的外围附近门尽管aerogenous感染。Hematogenously-induced脓毒症与E。杆菌与一个完全分散的分布与无数的炎性病变影响整个肺热点地区,常见的周围血管。IAV-induced病变局限于单个肺叶只有一个影响叶内均匀分布。重复感染的年代。肺炎成一个IAV-pneumonia导致模式几乎相同的后看到IAV单独感染。除了血液传播E。杆菌肺炎一致,均匀地分布在整个肺,受灾地区在所有其他模型测试之间或多或少被随机分布不对称的左右半肺和相邻叶(图10)。
感染小鼠肺与不同的细菌或病毒的病原体导致显著的差异分布,扩张和对称性的肺损伤高度为每个病原体可再生的。主要集中分布引起的病变年代。葡萄球菌和l。瞭解保持接近门没有外围扩张的趋势。感染年代。肺炎,一个。baumannii和MERS-CoV导致气管和血管周围的病变密切接近中央主要气道部分离心向外围扩张。相比之下,引起的病变K。肺炎大多位于叶的边缘和航空公司毗邻门弱得多。造血的感染E。杆菌与完全分散分布的病变影响整个肺部炎症热点无数,一般周围的血管。IAV-induced病变局限于单个肺叶有一个相当均匀分布在叶的影响。叶被影响了,而随机的和不一致的模式。重复感染的年代。肺炎成一个IAV-pneumonia导致模式几乎相同的后看到IAV单独感染。除了E。杆菌引起肺炎,几乎所有肺部病变之间的分布不对称的左右肺部分没有趋势更通常的一半或更多的强烈影响。
病原体的可视化使用特殊染色和免疫组织化学
100多年来,各种特殊的着色剂用于病原体的组织学可视化和其他相关结构,或多或少根据他们特定的亲和力某些染料。在这里,革兰氏染色剂被布朗和Brenn用于革兰氏阳性细菌的可视化,包括年代。肺炎(图11的箭头),很容易辨认,深蓝色的球菌。相比之下,吉姆沙染色剂主要是革兰氏阴性细菌的检测等K。肺炎(图11 b箭头)然后变成浅蓝色绿色棒。
病原体是可视化使用特殊的污渍通常用于细菌检测,包括革兰氏染色剂对革兰氏阳性肺炎双球菌(深蓝色,箭头)和吉姆沙染色剂克雷伯氏菌(B,浅蓝色的箭头)。免疫组织化学染色方法用来定位特定的抗原年代。肺炎(C,红色箭头)和IAV (D,红色箭头)。Triamino-tritolyl-methanechloride (Neufuchsin)作为发色体(红色)和苏木精(蓝色)复染色。20μm酒吧(模拟)。
更具体的病原体检测的幻灯片,尤其是病毒,免疫组织化学的方法选择。在这里,年代。肺炎并通过免疫组织化学方法观察IAV使用特定的反年代。肺炎或anti-IAV抗体,分别。年代。肺炎阳性信号得到无数的红球菌主要在血管周围间质(图11 c),中性粒细胞在肺泡内和间质,在纵隔胸膜表面以及脂肪组织。此外,肺炎双球菌也可视化的边际鼻窦气管淋巴结,在巨噬细胞和细胞外地。IAV抗原是本地化的顶表面和胞质完整和支气管上皮细胞坏死(图11 d)和肺泡内巨噬细胞。
讨论
不同小鼠模型的急性肺炎差别很大,有一个明显的强烈依赖pathogen-specific毒性的特点和传播,路线的感染,感染剂量和其他因素。在这里,我们提供了一个详细的描述性的概述感染肺内病变的组织病理学特点和分布和比较他们之间的九个相关和常用的峰值损伤和炎症感染模型。这里采用的模型所有代表良好的协议优化并成功应用在先前的研究中,病原体的感染剂量模型相关的变化,路线管理和分析时间点(37- - - - - -42,51,52,54- - - - - -56]。我们的模型相关的描述参数(表2)提供一个理性选择的组织病理学量化标准,为了最好的反映了模型相关的病变和分布特征,这似乎是最相关的。很明显,病变的严重程度的量化系统的结果将取决于其他因素,必须解决分别在每个模型中,如感染剂量、时间点的检查或治疗干预措施。
组织损伤和免疫细胞浸润的model-associated特点广泛一致的属性不同的病原体。例如,破坏性和主要中性渗入在组织损伤年代。肺炎,年代。葡萄球菌,一个。baumannii与细胞外,通常是细菌表达细胞毒素毒性的因素,如pneumolysin和过氧化氢(61年从年代。肺炎或免疫原性细胞壁成分如lipoteichoic酸(LTA)年代。葡萄球菌(62年,63年]。另一方面,细胞内病原体l。瞭解这主要感染巨噬细胞(64年在48小时)导致组织细胞的渗透,发展为肉芽肿性炎症感染后6天,典型的TH对(65年,66年]。然而,一些被使用的病原体与额外的特色。例如,组织学显示胸膜炎和脂肪组织炎由于病原体入侵感染后邻近肺外组织年代。肺炎和K。肺炎。这个巨大的细菌蔓延整个胸腔是只出现在这两个模型和最有可能与脓毒症相关,负责快速临床进展和不利的结果41,67年]。然而,只有K。肺炎有脓肿形成的趋势未见在肺炎球菌肺炎。感染年代。葡萄球菌和一个。baumannii也导致了类似的损伤模式,除了不动杆菌全身的病变广泛扩张肺外围Staphyloccocus全身的肺炎是局限于肺门。第二个区别这两个的存在突出血管血栓形成一个。baumannii全身的肺炎是缺席taphylococcus肺炎。小鼠感染的临床结果一个。baumannii和年代。葡萄球菌相比是更有利的感染年代。肺炎或K。肺炎(38]这也可能被解释成缺乏细菌蔓延整个胸腔和邻近组织,甚至败血症。E。杆菌感染包括sepsis-associated阿里作为模型29日,30.,68年]因此引起广泛血管血栓形成和血管炎,最有可能由于其血液进入肺部和并发败血症弥漫性血管内凝血病和血管病变有关。血管血栓形成有或没有血管炎也观察到在其他模型,包括年代。肺炎,一个。baumanniiMERS-CoV,然而,在一个小得多的程度上,只有最强烈影响的区域内。MERS-CoV和IAV-associated病变明显反映了这些病毒的已知细胞趋向性与肺泡壁坏死或支气管上皮细胞,分别是最典型病理特征(69年- - - - - -72年]。典型的病毒诱导损伤,炎症细胞浸润MERS-CoV和IAV感染是由淋巴细胞没有或只有少数中性粒细胞。然而,两个病毒模型可以清楚的区分出额外的组织学特征。只有MERS-CoV感染导致血管坏死和变性的表型标记血管,血管炎,血管血栓形成以及连续明显出血[69年,73年]。相比之下,IAV-induced肺炎没有显示任何的这些特性,但主要是血管周围淋巴细胞成套和肺泡水肿(42,74年]。随后的重复感染与低剂量年代。肺炎强IAV-induced病变的严重程度和严重的肺炎。然而,它没有改变IAV-pneumonia的主要组织学特征。单一感染后发现的模式年代。肺炎没有重复重复感染模型,可能由于低得多的接种剂量通常从virus-naive迅速清除肺部。
当病变的分布9模型之间的比较测试,四个不同模式可以明显区分。最常见的模式,病变在哪里集中在中央气道和肺门血管近外围少或不影响可能可以解释为aerogenous路线的感染,病原体条目。相反的模式的特点K。肺炎感染的边缘叶比他们更强烈影响门地区尽管类似aerogenous路线的感染可能是由于aerosolic气管内的应用程序(75年)的这些细菌是典型的和必要的在这个模型41,57- - - - - -59]。这些差异因此更有可能归因于感染模型相关的路线而不是pathogen-specific属性。同样,非常均匀的分布E。杆菌诱导肺炎可能是血液传播的病原体进入肺部弥漫性后腹腔内感染。再次成为独一无二的病原体检测,IAV-associated模式影响整个只有选择肺叶几乎完全保留的人。这可能分布是随机的病毒的传播以及主要的航空公司,但为什么有些叶底后仍然几乎不受影响感染仍然很难解释。除了帮助理解病原体传播的差异,不均匀,经常很不对称分布有巨大的影响在实际急性肺炎小鼠分子研究采样。当信使核糖核酸或蛋白表达水平上定量数据或其他生化信息要与另一个或组织病变相比,势在必行,只有相同受灾地区进行了比较。因为这是无法预测或承认在宏观层面上对大多数模型、抽样的不同地区肺的做法不同的读出系统显得很有问题。
的另一个含义不同的病变特点、免疫细胞反应和分布在不同的模型出现高度相关的组织学评分系统,瞄准首次定量比较(45]。适当缩小参数列表为每个病原体和排除功能可能无关紧要的一些模型,我们选择23单一病理标准半定量的评分系统的设计适合每个模型。这些标准在一定程度上是由标准等参数的确定受影响的肺区,病变的分布或肺炎诱发的类型。然而,许多其他的模型相关参数确定的精确描述特定方面和允许模型之间的区别,如血管周围水肿,血管血栓形成、胸膜炎或脂肪组织炎。适当评分系统可能包括更一般的参数在不同的病原体与另一个或多个pathogen-specific参数相比,以防特定病原体特点是一个实验的重点。例如,一些参数的选择在这里已被证明有助于发现和semiquantification不同表型的基因工程后小鼠肺炎病原体或老鼠38,51,76年]。评分系统,声称普遍性所有小鼠模型的急性肺炎似乎普遍适用的和有意义的特定的实验目标。甚至23参数选择的列表可能变得不合适或者不足当病原体或主机端的基因改变可能导致不同类型的损伤,免疫细胞反应,时间课程或其他相关功能。在这些情况下,列表中选中这里可能需要调整或扩展到更好地满足每个新研究的具体挑战。
作为标准苏木精和伊红染色(他)组织部分未能想象大多数病原体,传统特殊染色以及免疫组织化学技术,根据特定的染色性能的病原体和适当的可用性抗体。而年代。肺炎,K。肺炎和E。杆菌很容易在他染色组织切片可见炎症细胞密度较低的地区,例如,在血管周的空间,他们很难确定在严重渗透和肺实质合并。相比之下,年代。葡萄球菌,一个。baumannii,l。瞭解和病毒都完全看不见他染色,因此必须被适当的可视化histotechnical污渍或免疫组织化学。这两种方法也可能会允许病原体的一个粗略的量化数字组织在适当的时候使用图像分析工具。
在这第一次的比较研究,我们检查了先前建立模型优化的感染途径,时间点,和感染剂量和卷具体为每个模型达到峰值的肺损伤和炎症。变化这些因素可能会导致不同的病变的严重性,组成细胞浸润和一些模型在不同病变在肺的扩张。然而,这里使用的条件都是基于观测期间已经进化之前广泛建立这些模型的研究(37- - - - - -39,41,42,51,52,54,56- - - - - -58,60,77年- - - - - -79年]。其中最重要的原因,大多数人类病原体不是致病的老鼠在非实验条件下和决定性因素获得有用的肺炎模型似乎是适当的感染剂量的确定和途径感染。此外,在感染后的确切时间点组织分析决定了几乎所有模型小心获得有用的模型,包括对应变的精确定义或病原体的变异使用(51,53,80年,81年]。需要考虑的另一个变量是鼠标使用。除了BALB / c小鼠MERS-CoV感染模型中使用的模型相关的原因(60),所有与C57BL / 6小鼠模型进行了最常用的鼠标应变在感染的研究,因此允许比较类似的研究。然而,应变的变化或遗传背景可能产生戏剧性的影响类型,严重程度和炎症的结果,特别是在先天免疫反应(82年- - - - - -84年]。再次,评分的标准建议程序应该允许识别和量化这些差异相关感染剂量和体积的变化,时间点的检查,使用压力和年龄的老鼠,病原体变异和其他变量。
肺组织病理学的可能是复杂的,需要在特有的解剖基础知识,生理学、瀑特异性免疫学、病理学、和histotechnical程序。此外,各种背景病变在老鼠身上,包括应变特定自发退化性或炎症条件和意外感染的可能性与实验无关的不应被混淆与实验结果。因此,尽管我们努力指定和简化模型相关的评估和量化标准相关的病变,似乎至关重要,训练有素的组织病理学专家参与小鼠肺部的镜检46,85年]。
显然,除了描述性或半定量的组织学,其他一些参数可能是有用的定量实验团体之间的比较来确定特定细胞类型的作用,分子,和治疗干预措施,根据战略和目标的研究44]。这样的参数包括流量仪免疫细胞识别和量化,ELISA或定量rt - pcr的探测细胞因子,趋化因子和基质蛋白参与肺部病理学和重构,和斑块/集落形成为病原体的识别和量化分析,这里使用先前发表的大多数模型(38,41,42,51- - - - - -53,86年,87年]。然而,所有这些方法缺乏空间分辨率,只有组织学评估报价。只有这些技术的组合将导致更好的理解疾病的复杂背景下整个肺部病理。
总之,我们已经确定了一系列的病原体——在小鼠模型和模型相关的病变特征的急性肺炎。我们的研究结果强调准确的组织病理学特征模型相关的标准的必要性和定量评估实验肺炎。这个比较绿化急性肺炎小鼠组织学为未来的研究提供了一个全面的框架在个人病原体、宿主因素的作用,复杂的疾病机制和新的治疗策略,可以帮助人类患者治疗肺炎。
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