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研究文章

人肺固有淋巴细胞亚群的鉴定与定量

  • 凯瑟琳·c·德·格罗夫，

    对这项工作有同样贡献的有:Katrien C. De Grove, Sharen Provoost

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯
  • 莎兰Provoost，

    对这项工作有同样贡献的有:Katrien C. De Grove, Sharen Provoost

    sharen.provoost@UGent.be

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯
  • Fien M. Verhamme，

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯
  • 肯·r·布雷克，

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯
  • 盖伊·f·乔斯，

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯
  • 塔尼亚梅斯,

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯
  • Guy G. Brusselle

    联系比利时根特根特大学医院呼吸内科，阻塞性肺疾病转化研究实验室

    ⨯

摘要

背景

先天淋巴样细胞(ILC)是一种新的先天免疫细胞家族，作为组织内稳态和炎症的重要调节因子而出现。然而，有关人类肺中ILC的相对丰度和特征的资料有限。

方法

本研究的目的是通过多色流式细胞术描述和列举人肺中ILC的不同亚群。

结果

在CD45内+林-CD127+我们利用特异性表面标记(分别为IL12Rβ2、CRTH2和CD117)和关键转录因子(分别为T-bet、GATA-3和RORγT)鉴定了1组(ILC1)、2组(ILC2)和3组(ILC3)先天淋巴样细胞。基于NKp44的存在，ILC3在自然细胞毒性受体(NCR)中进一步细分。+和NCR-ILC3。此外，我们还证实了肺ILC人群中标志性细胞因子IFN-γ、IL-5、IL-17A、IL-22和GM-CSF的产生。有趣的是，我们观察到NCR的频率有升高的趋势-慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺中ILC3含量与对照组比较

结论

我们发现ILC的三个主要亚群存在于人类肺中。重要的是，与对照组相比，COPD患者ILC亚群的相对丰度趋于改变。

引用:De Grove KC, Provoost S, Verhamme FM, Bracke KR, Joos GF, Maes T，等(2016)人肺固有淋巴细胞亚群的表征和定量。科学通报11(1):e0145961。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961

编辑器:R.基思·里夫斯，美国哈佛医学院

收到:2015年9月25日;接受:2015年12月10日;发表:2016年1月4日

版权:©2016 De Grove等人。这是一篇开放获取的文章188滚球软件创作共用授权协议它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源

数据可用性:所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资助:该项目得到了比利时国家-比利时科学政策大学间吸引极地计划(IUAP)、根特大学协调研究行动(BOF/GOA, 01G02714)和弗兰德斯科学研究基金(fvo - vlaanderen, G.0897.12)的支持。SP是弗兰德斯科学研究基金的博士后研究员。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决定或稿件准备方面没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

先天淋巴样细胞(ILC)是先天免疫系统的一个新特征的异质家族，已成为组织内稳态、免疫和炎症的重要调节因子。ILC在形态学上与适应性免疫系统的对应物T细胞和b细胞相似。尽管它们缺乏特异性的重组抗原受体，这是适应性免疫系统的标志，但这些先天免疫细胞可以产生一系列细胞因子，以应对各种危险信号和内稳态的变化[1，2]。与t细胞类似，根据其表型、功能和转录调节，ILC被分为三个亚群——第1组(ILC1)、第2组(ILC2)和第3组(ILC3)先天淋巴样细胞。ILC1亚群包括自然杀伤(NK)细胞和无毒的ILC1细胞。这些无毒的ILC1的特征是转录因子T-bet的表达和对白介素(IL)-12反应产生IFN-γ。ILC2的功能和发育依赖于转录因子GATA-3，并产生2型细胞因子IL-5和IL-13，以响应IL-25和IL-33。最后，ILC3亚群被划分为自然细胞毒性受体(NCR，即NKp44, NKp46和NKp30)+ILC3和NCR-ILC3。后者是一个异质性人群，也包括淋巴组织诱导细胞(LTi)。这些ILC3表达转录因子RORγT，并能够产生IL-17A, IL-22或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以响应IL-23和IL-1β [3.，4]。

在过去的几年里，人们在包括皮肤和肠道在内的多个组织中研究了人类ILC亚群[4]。为了描述这些ILC，基于肠道研究提出了几种表面标记[3.]。据我们所知，目前对人类呼吸系统中ILC的研究仅限于ILC2 [5- - - - - -10]。最近，一项研究表明，ILC亚群存在于肺癌背景下的人类肺组织中[11]。然而，ILC1、NCR的相对丰度+ILC3和NCR-在慢性阻塞性肺疾病(COPD)等炎症条件下，人类肺组织中的ILC3尚未被表征。慢性阻塞性肺病是一种慢性炎症性肺病，与肺气肿和淋巴滤泡的发展有关。已有研究表明，除了适应性免疫系统外，先天免疫细胞也在COPD的发病机制中起重要作用[12]。

在本文中，我们鉴定并定量了无毒的ILC1, ILC2, NCR+ILC3和NCR-基于几种表型标记和标志性转录因子的流式细胞术检测人肺ILC3亚群。进一步，我们检查了肺ILC人群中特异性细胞因子的表达。最后，我们比较了对照组和COPD患者ILC亚群的相对丰度。

材料与方法

肺组织

肺组织取自在根特大学医院因孤立性肺肿瘤接受手术切除的患者。病理学家在离肺病变最远的地方收集组织，没有发现后阻塞性肺炎或肿瘤侵袭的迹象。本研究纳入16名受试者，分为2组:5名对照组和11名COPD I期或II期患者。根据全球慢性阻塞性肺病(GOLD)分类，采用术前肺活量测定法确定慢性阻塞性肺病的诊断和严重程度:所有对照受试者使用支气管扩张剂后1秒用力呼气容积比(FEV)1)到强迫肺活量(FVC)超过70%，而所有COPD患者都有FEV1/植被覆盖度比低于70%。患者在FEV时诊断为COPD GOLD I1≥80%的COPD GOLD II患者有FEV1预计在50 - 80%之间[13]。根据根特大学医院医学伦理委员会批准的方案，获得所有受试者的书面知情同意。患者特征见表1．

缩略图
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表1。主题特点。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.t001

取自肺组织的单细胞悬浮液

如前所述，对肺切除标本进行处理，以获得单细胞悬液[14]。简单地说，用生理水(0.9% NaCl)冲洗肺组织，去除残余血液。肺组织切成细块，在37°C消化培养基(罗斯威尔公园纪念研究所培养基(RPMI) 1640中添加5%胎牛血清(FCS)， 2 mM l -谷氨酰胺，0.05 mM 2-巯基乙醇(all Invitrogen)， 100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素(Sigma-Aldrich)， 1 mg/ml 2型胶原酶(Worthington生化)，0.02 mg/ml DNase I (II级来自牛胰腺;勃林格殷格翰集团))。细胞在10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)中室温摇床上重悬5分钟。然后用40 μm细胞滤网过滤细胞，用Ficoll-Paque分离单个核细胞TM加上(通用电气医疗)。最后，将细胞进行红细胞裂解(S1无花果)．

流式细胞术

单细胞悬液与人IgG预孵育以减少非特异性结合。用于表面染色，使用以下单克隆抗体:异硫氰酸荧光素(FITC)共轭抗cd45 (HI30)，围花素叶绿素蛋白-菁5.5 (PerCP)共轭抗cd3 (OKT3)，抗cd19 (HIB19)，抗cd11c(3.9)，抗cd11b (M1/70)，异藻蓝素(APC)共轭抗nkp44 (P44-8)， PE/吲哚碳菁(Cy7)共轭抗cd117 (104D2)，艳紫421TM-共轭抗cd127 (A019D5)，亮紫605TM-共轭抗cd56 (HCD56)(均来自Biolegend);藻氰菊酯(PE)共轭抗il12r β2 (305719;研发系统)，生物素化抗crth2 (BM19;与链霉亲和素(SAV)-APC或SAV-APC- cy7 (BD Biosciences)联合使用。为了进行细胞质细胞因子染色，在37℃下，用醋酸肉豆蔻酸酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)模拟细胞15小时，并添加brefeldin A和莫能菌素(eBioscience)。细胞内固定和渗透缓冲装置(eBioscience)用于固定和细胞渗透。使用了以下抗体:pe-偶联抗il - 17a (eBio64CAP17)、抗ifn -γ (4S.B3)、抗il -22 (22URTI)、抗il -5 (TRFK5)、抗gm - csf (GM2F3)和同型匹配对照抗体(均为eBioscience)。对于核染色，Foxp3/转录因子染色缓冲液(eBioscience)集与以下抗体联合使用:pe偶联抗t -bet (eBio4B10)，抗gata -3 (TWAJ)，抗rorγ t (AFKJS-9)和同型匹配的对照抗体(所有eBioscience)。

数据采集与分析

数据采集在运行DiVa软件(BD Biosciences)的LSRFortessa上进行。使用FlowJo软件对细胞子集进行分析。采用SPSS 22.0版本(SPSS, Chicago, USA)进行统计分析。根据标准统计标准，采用非参数检验(Mann-Whitney-U)比较对照组与COPD组ILC的不同子集。p值< 0.05被认为是显著的。患者特征用平均值±标准差(SD)表示。流式细胞术数据用均数±均数标准误差(SEM)表示。

结果

人肺固有淋巴样细胞亚群的特征

在人类中，已经在血液、肠道和皮肤中研究了ILC亚群的存在。为了描述人类肺组织中的ILC亚群，我们分析了手术切除的肺标本(n = 16;患者特征见表1)．单细胞悬浮液染色以鉴别不同的ILC亚群。荧光- 1对照设置流式细胞门(S2无花果)．ILC表现为CD45+细胞，一种存在于所有造血细胞上的标记物。此外，ILC缺乏特定谱系(Lin)标记物的表达(即CD3 (t细胞)，CD19 (b细胞)，CD11b(中性粒细胞/嗜酸性粒细胞)和CD11c(树突状细胞/巨噬细胞))，但表达CD127 (IL-7Rα)， IL-7的受体。我们进一步参考这些CD45+林-CD127+如肺ILC细胞群(图1)．

缩略图
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图1所示。人肺固有淋巴样细胞亚群的特征。

用流式细胞仪检测消化后的人肺单细胞悬液ILC亚群(n = 16)。荧光- 1对照用于设置门。一个肺ILC人群的特征为CD45+,林-(即CD3, CD19, CD11c, CD11b)和CD127+细胞。根据特定的表面标记进一步定义子集。B、无毒ILC1进一步检出CD56-, IL12Rβ2+细胞。C， ILC2子集表达CRTH2。D,NCR+ILC3为CD117+, NKp44+，而NCR-ILC3表达为CD117+, NKp44-细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.g001

为了区分肺部ILC人群中的不同ILC亚型，我们使用了特异性表面标记。由于NK细胞可以污染ILC1亚群，我们使用CD56标记来排除NK细胞，并将无毒的ILC1亚群描述为CD56-IL12Rβ2+肺ILC (图1 b)．ILC2亚群被鉴定为肺ILC，表达T上表达的趋化受体同源分子H2个细胞(CRTH2)，类似于先前在上呼吸道检测到的ILC2 (图1 c)．ILC3亚群，NCR+ILC3和NCR-ILC3，以CD117命名+(c-kit)肺ILC和NKp44进一步区分，NKp44是一种天然细胞毒性受体(图1 d)．使用这些染色组合，我们能够区分人类肺组织中的三种ILC亚群。此外，我们证明了我们的染色组合是特异性的，因为用于表征一个特定ILC子集的表面标记在其他ILC子集上不表达(S3无花果)．有趣的是，包含额外的谱系标记(即CD1a, CD14, CD34, CD123, TCRαβ， TCRγδ， BDCA2和FcεR1)导致不同ILC亚群的相同百分比(S4无花果)．

肺ILC亚群转录因子的细胞内染色

除了基于表面标记的表征外，也可以使用特定的转录因子来表征ILC亚群。为此，我们使用细胞内流式细胞术评估了ILC不同亚群中关键转录因子的表达。T-bet表达在无毒的ILC1子集中检测到，有趣的是，在ILC3子集中也检测到，但在ILC2子集中没有(图2)．转录因子GATA-3在ILC2亚群中明显表达(图2 b)，而在ILC1和ILC3亚群中未发现GATA-3水平有限(图2 b)．最后，在ILC3亚群中发现了RORγT的特异性表达;这与转录因子RORγT均为阴性的ILC1和ILC2亚群形成对比(图2 c)．

缩略图
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图2所示。肺ILC亚群转录因子的细胞内染色。

在消化后的人肺单细胞悬浮液上测定ILC特异性亚群中的发育转录因子。一个,T-bet(黑线)与同型对照(灰线)在ILC1 (CD45)中的表达+,林-CD127+、CD56-, CRTH2-, CD117-)， ilc2 (cd45+,林-, CD127+, CRTH2+)， ilc3 (cd45+,林-, CD127+, CD117+人口)。B,不同ILC子集中GATA-3表达(黑线)与同型对照(灰线)的比较。C,在ILC1, ILC2和ILC3人群中RORγT(黑线)与同型对照(灰线)的表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.g002

肺ILC人群中细胞内细胞因子的产生

为了通过细胞内流式细胞术评估标志性细胞因子，我们用PMA/离子型霉素(+蛋白转运抑制剂)刺激肺单细胞悬液15小时。由于人类肺中ILC个体亚群的缺乏，在肺中ILC人群中检测了标志性细胞因子(即CD45+林-CD127+细胞)。此外，由于NK细胞能够产生1型细胞因子，在IFN-γ分析中，CD56被用作额外的排除标记。我们观察到IFN-γ的产生，指示ILC1在人肺组织(图3)．类似地，我们可以确定2型细胞因子的产生，特别是IL-5的表达，这表明在人类肺组织中存在肺ILC2 (图3 b)．最后，ILC3产生的细胞因子如IL-17A (图3 c)、il-22 (图3 d)和GM-CSF (图3 e)出现在肺ILC人群中。图3 f显示ILC人群中细胞因子阳性细胞的频率。值得注意的是，未受刺激的肺ILC没有基础细胞因子的表达(数据未显示)。

缩略图
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图3所示。肺ILC人群中细胞内细胞因子的产生。

肺ILC中的几种标志性细胞因子(门控为CD45)+,林-CD127+(n = 8)。由于NK细胞可以污染无毒的ILC1亚群，CD56+细胞被排除以研究IFN-γ的产生。为了产生这些细胞因子，首先用PMA/离子型霉素(+转运抑制剂)刺激肺细胞15小时。一个,IFN-γ在ILC中的产生。B,肺ILC人群中IL-5的产生。C,ILC中IL-17的产生。D,ILC生产IL-22。E,ILC人群中GM-CSF的产生。底部的面板代表特异性细胞因子染色的同型对照。F,ILC中IFN-γ、IL-5、IL-17A、IL-22和GM-CSF阳性细胞的频率(CD45+,林-CD127+)人群(n = 8，平均值±SEM)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.g003

对照组与COPD患者的ILC亚群

利用上述表面标记，我们定量了ILC1, ILC2, NCR的百分比+ILC3和NCR-肺单细胞悬液中的ILC3亚群。由于肺ILC亚群的相对丰度可能在COPD等疾病中发生改变，我们在对照受试者(n = 5)和COPD患者(n = 11)中调查了不同ILC亚群的频率。虽然在对照组和COPD组之间没有观察到ILC特异性亚群的相对丰度有显著差异(可能是由于患者数量较少)(图4)，发现了一些有趣的发现。对照组ILC2和NCR均为阴性-ILC3是最丰富的ILC亚群。有趣的是，在COPD患者中，ILC的分布倾向于向NCR的更多分布转移-ILC3与其他ILC子集的比较(图4 b)．此外，当分析细胞因子阳性ILC时，我们观察到，与对照组相比，COPD患者中IL-17A和IL-22表达的ILC有增加的趋势，而IFN-γ和IL-5表达的ILC相似(S5无花果）

缩略图
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图4所示。对照组与COPD患者的ILC亚群。

一个,ILC1 (CD45+,林-, CD127+、CD56-, IL12Rβ2+)， ilc2 (cd45+,林-, CD127+, CRTH2+), NCR+ILC3 (CD45+,林-, CD127+, CD117+, NKp44+)及NCR-ILC3 (CD45+,林-, CD127+, CD117+, NKp44-流式细胞术检测正常人(n = 5)和COPD患者(n = 11)消化后肺组织中的)。ILC数以CD45的百分比(%)表示+总体(平均值±SEM)。B,ILC1, ILC2, NCR的相对丰度饼图+ILC3和NCR-对照组和COPD患者的ILC3亚群。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.g004

讨论

我们证明了ILC在人肺中的所有亚群的存在(图5)．利用特异性表面标记和关键转录因子，我们对ILC1、ILC2、NCR进行了表征+ILC3和NCR-多色流式细胞术检测人肺单细胞悬液中ILC3亚群。此外，我们评估了肺ILC人群中标志性细胞因子的产生。此外，我们的数据表明NCR的频率-ILC3在COPD患者中有升高的趋势。

缩略图
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图5所示。人类肺组织中先天淋巴样细胞亚群概述。

CD45的存在+,林-(即CD3, CD19, CD11c, CD11b)和CD127+肺组织显示ILC。这些ILC在CD56中进一步细分-IL12Rβ2+ILC1子集，CRTH2+ILC2子集，CD117+NKp44+(NCR+) ILC3子集和CD117+NKp44-(NCR-) ILC3子集。此外，特异性ILC亚群中特征转录因子(即T-bet、GATA-3和rorr γ t)的表达以及肺ILC人群中细胞因子的产生(即IFN-γ、IL-5、IL-17A、IL-22和GM-CSF)得到证实。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.g005

为了表征人体组织中ILC亚型，文献中提出了特异性的表面标记。在肠粘膜组织中，ILC1人群中可以检测到更高比例的IL12Rβ2转录本[15]。使用这个特定的标记，以及CD56排除污染的NK细胞[3.，16]，我们鉴定肺ILC1为CD45+林-CD127+CD56-IL12Rβ2+细胞。然而，应该注意的是，在ILC1子集(人和小鼠)的描述上仍然存在一些争议。至少在肠道中，有一个额外的上皮内CD127低CD103+ILC1亚群已经被发现，这将相当于细胞毒性CD8+t细胞(4]。最近，这样一个CD127低CD103+在人类肺组织中也发现ILC1亚群[11]。与肠道及鼻腔息肉的研究结果一致[10]，我们确定肺ILC2为CRTH2+肺ILC细胞群内的细胞根据NCR (NKp44)来区分肠道和皮肤中的ILC3亚群[17，18]。因此，在人类肺标本中，我们显示了两种NCR的存在+ILC3和NCR-ILC3在CD117内+肺ILC。然而，人们应该意识到NCR-ILC3亚群仍然是一个异质性群体，也包含lti细胞。

除了基于表面标记的表征外，发育转录因子的表达是鉴定ILC亚群的一个重要特征。我们证实了GATA-3在ILC2亚群和RORγT在ILC3亚群中的明确表达，这表明我们基于表面标记的染色能够充分区分ILC亚群。有趣的是，除了ILC1子集中的T-bet表达外，我们还在ILC3子集中发现了高T-bet表达。先前的研究表明，在IL-12的刺激下，肠道NCR-ILC3可能失去RORγT的表达并上调T-bet，提示ILC3可分化为ILC1 [15，19]。因此，我们在ILC3亚群中观察到的T-bet信号可能表明人类肺部ILC3的可塑性，尽管这需要进一步的研究。

在刺激下，ILC能够产生几种效应细胞因子。我们观察了肺ILC人群中IFN-γ、IL-5、IL-17A和IL-22的表达，提示ILC1、ILC2和NCR存在活化+ILC3和NCR-ILC3。此外，我们还观察到GM-CSF的产生，这将是有趣的进一步探索，因为RORγT+ILC3能够在小鼠肠道中产生GM-CSF，促进t细胞稳态[20.，21]。然而，应该强调的是，细胞因子的表达在肺ILC人群中进行了调查。通过特异性肺ILC亚群评估细胞因子的产生可以提供额外的功能见解。此外，在未来的实验中研究人类肺ILC2产生双调节蛋白是有价值的。至少在小鼠中，除了2型细胞因子外，ILC2还能产生双调节素，这是一种表皮生长因子，与伤口愈合和组织(肺)重塑有关[5]。

根据组织的不同，人类ILC亚群的组成可能不同[4]。例如，在健康的皮肤中，ILC2和NCR的数量更高-ILC3被发现[17]，而NCR+ILC3是肠道中最丰富的ILC亚群[22]。在我们的对照受试者中ILC亚群的数量相对较低，但与之前在非炎症鼻组织中观察到的ILC2数量一致[10]。此外，已有研究表明，ILC亚群的相对丰度可能取决于疾病状态，如克罗恩病、牛皮癣和慢性鼻窦炎[10，15，17]。虽然对照组和COPD组之间无统计学差异，但NCR呈较高相对丰度的趋势-ILC3可在COPD患者中观察到。然而，需要指出的是，研究的患者数量很少，我们的发现需要在更大的研究人群中得到证实。

在COPD患者中，与疾病严重程度相关的对照组相比，发现了更多的淋巴样滤泡[23，24]。重要的是，由NCR生产的IL-17A和IL-22-ILC3，对淋巴滤泡的形成至关重要[25，26]。因此，研究NCR增加的作用将是有趣的-慢性阻塞性肺疾病患者淋巴滤泡形成中的ILC3亚群。此外，在其他慢性肺部疾病(如肺纤维化、支气管扩张、滤泡性细支气管炎、淋巴间质性肺炎)中也可观察到淋巴滤泡[24]，也值得研究NCR的相对丰度-ILC3在这些疾病的情况下。除了参与淋巴滤泡的形成，NCR-ILC3也可能通过促炎细胞因子的产生参与慢性阻塞性肺病患者的持续炎症。或者，也可能是NCR的积累-慢性阻塞性肺病中的ILC3与宿主保护性免疫相关，以应对慢性阻塞性肺病患者中经常发生的细菌性呼吸道感染[24]。探讨NCR作用的进一步功能研究-因此，ILC3在COPD中的作用是有保证的。ILC3在肺内稳态和疾病背景下的(保护和病理)作用还知之甚少。最近,NCR-研究发现ILC3在人类非小细胞肺癌组织中积累，它们可能有助于保护性肿瘤相关的三级淋巴样结构的形成[11]。

到目前为止，呼吸系统的研究主要集中在ILC2亚群。尽管一些动物研究已经描述了ILC2在蠕虫感染中的重要作用[27，过敏性气道炎症[28- - - - - -31和气道高反应性[32，33]， ILC2在人类肺中的功能仍未完全研究。迄今为止，已证实慢性鼻窦炎患者鼻息肉中ILC2的数量增加[9，10]，提示ILC2在上呼吸道嗜酸性粒细胞性炎症中发挥作用。此外，在哮喘全基因组相关研究中发现的基因(rar α， IL-13, IL-33, IL-1RL1;它们都与ILC2有关)表明ILC2在哮喘中的关键作用[34]。我们最近假设ILC2可能在非过敏性嗜酸性粒细胞性气道炎症中发挥重要作用[35]。为了支持这一观点，在哮喘实验模型中的研究表明ILC2对皮质类固醇具有高度耐药性[36]，这可以解释为什么重度嗜酸性粒细胞性哮喘对皮质类固醇相对具有耐药性[35]。

综上所述，基于表面标记物和关键转录因子的表达，我们证实了ILC1, ILC2, NCR+ILC3和NCR-ILC3亚群存在于人类肺中。此外，肺ILC在刺激后能够产生标志性的细胞因子。有趣的是，我们显示了肺NCR-ILC3倾向于在COPD患者的肺中积累，尽管这需要在更大的研究人群中得到证实。然而，ILC亚群在肺内稳态和肺部疾病中的功能作用仍有待充分阐明。因此，需要进一步研究ILC亚群的功能，以确定ILC是否可能成为(慢性)肺部疾病新疗法的靶点。

支持信息

S1无花果。肺切除标本单细胞悬液制作工艺。

肺组织取自接受外科肺切除术的患者。将组织切成细块，在37°C添加2型胶原酶和DNase i的消化培养基中消化45分钟，然后加入EDTA停止消化，用40 μm细胞滤网过滤肺细胞。用Ficoll-Paque分离肺单个核细胞TM优先。最后，将细胞进行红细胞(RBC)裂解并进行流式细胞术染色。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.s001

(TIF)

S2无花果。荧光减1 (FMO)控制，以建立适当的ILC门控策略。

FMO对照用于消化的人肺单细胞悬液，流式细胞术分析。FMO控件包含ILC面板中除被调查的特定氟铬外的所有着色。该图显示了特定ILC子集(图1)，并与不同FMO对照进行比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.s002

(TIF)

S3无花果。ILC联合染色的特异性。

一个,肺ILC1人群中CRTH2、CD117的表达。B,ILC2亚型细胞表面标记物IL12Rβ2、CD117的分析。C,肺ILC3亚群中IL12Rβ2、CRTH2的表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.s003

(TIF)

S4无花果。ILC鸡尾酒中包含额外的谱系标记。

用流式细胞术检测消化后的人肺单细胞悬浮液中ILC鸡尾酒中附加的谱系标记。使用我们的“经典”谱系混合(即CD3, CD19, CD11c, CD11b)(填充符号)和带有额外标记的谱系混合(即CD3, CD19, CD11c, CD11b, CD1a, CD14, CD34, CD123, TCRαβ， TCRγδ， BDCA2和FcεR1)(开放符号)显示消化人类肺中ILC1, ILC2和ILC3的频率。N = 3。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.s004

(TIF)

S5无花果。细胞因子阳性ILC在对照组和COPD患者中的频率。

IFN-γ、IL-5、IL-17A、IL-22阳性ILC的频率(门控为CD45+,林-, CD127+对照组(n = 2)和COPD患者(n = 6)消化后的人肺中细胞)，采用细胞内流式细胞术染色(平均±扫描电镜)测定。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145961.s005

(TIF)

致谢

我们感谢Indra De Borle、Ann Neesen、Katleen De Saedeleer、Anouck Goethals、Lien Coelembier、Marie-Rose Mouton和Greet Barbier(呼吸医学部，比利时根特市根特大学医院阻塞性肺疾病转化研究实验室)提供的技术援助。

作者的贡献

构思并设计了KDG SP KRB GFJ TM GGB实验。进行实验:KDG SP FMV。分析数据:KDG SP FMV KRB GFJ TM GGB。撰写论文:KDG SP GFJ TM GGB。

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