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研究文章

通过小分子校正和转互补拯救CFTR的NBD2突变体N1303K和S1235R

  • Daniele Rapino,

    从属关系美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院医学系，美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生理学系

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  • Inna Sabirzhanova,

    从属关系美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院医学系，美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生理学系

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  • Miqueias Lopes-Pacheco,

    从属关系美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院医学系，美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生理学系

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  • 拉胡尔·格罗弗,

    从属关系美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院医学系，美利坚合众国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生理学系

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  • William B. Guggino，

    联系美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生理学系

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  • Liudmila Cebotaru

    lcebotaru@jhmi.edu。

    联系美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院医学系

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摘要

虽然，囊性纤维化最常见的突变，ΔF508，在囊性纤维化跨膜调节。(CFTR)，位于核苷酸结合结构域(NBD1)，致病突变也发生在NBD2中。为了提供关于NBD2突变的潜在治疗策略的信息，我们使用生化方法和新创建的细胞系的组合，研究了两种致病NBD2突变体N1303K和S1235R。令人惊讶的是，它们都没有被低温拯救。用MG132抑制蛋白酶体或用tubacin抑制聚合体挽救了N1303K和S1235R未成熟的B和成熟的C条带，表明降解是通过蛋白酶体和聚合体进行的。我们没有发现溶酶体抑制剂E64的影响。因此，我们的结果表明这些NBD2突变体是具有独特特征的加工突变体。开发了几种已知的纠正子来拯救ΔF508-CFTR，当单独或联合应用时，显著提高了NBD 2突变体的B带和C带的成熟度。C4 + C18或C3 + C4的矫正效果最好。将截短的CFTR(∆27-264)共转染到稳定转染的细胞中也能挽救它们。 This demonstrates for the first time that transcomplementation with a truncated version of CFTR can rescue NBD2 mutants. Our results show that the N1303K mutation has a more profound effect on NBD2 processing than S1235R and that small-molecule correctors increase the maturation of bands B and C in NBD2 mutants. In addition, ∆27-264 was able to transcomplement both NDB2 mutants. We conclude that differences and similarities occur in the impact of mutations on NBD2 when compared to ΔF508-CFTR suggesting that individualized strategies may be needed to restore their function. Finally our results are important because they suggest that gene or corrector molecule therapies either alone or in combination individualized for NBD2 mutants may be beneficial for patients bearing N1303K or S1235R mutations.

引用:Rapino D, Sabirzhanova I, lope - pacheco M, Grover R, Guggino WB, Cebotaru L(2015)通过小分子校正和转互补挽救NBD2突变体N1303K和S1235R。公共科学学报10(3):e0119796。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796

学术编辑器:Klaus Brusgaard，丹麦欧登塞大学医院

收到:2014年9月12日;接受:2015年1月30日发表:2015年3月23日

版权:©2015 Rapino et al.。这是一篇开放获取的文章188滚球软件，根据创作共用署名许可协议它允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是要注明原作者和出处

数据可用性:所有相关数据都在论文中。

资助:由美国CF基金会、意大利基耶蒂大学(Rapino)和巴西国家科学和技术发展委员会(CNPq) (Lopes Pacheco)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)突变引起的隐性常染色体疾病，CFTR是一种atp结合盒蛋白(ABC，亚家族C，成员7)，由两个跨膜结构域、两个核苷酸结合结构域和一个独特的调节结构域组成。CFTR在上皮细胞中起氯离子通道的作用，根据组织的不同，将氯离子输送进或输送出细胞[1］．这一功能对于控制气道、消化系统和生殖系统粘膜中的水平衡非常重要。囊性纤维化最常见的临床表现为反复肺部感染、胰腺功能不全、糖尿病及男性不育[2］．

许多致病突变(超过1000个)已被描述;最常见的是NBD1结构域508位苯丙氨酸(ΔF508)的缺失，[3.]从而导致严重的CF。这种氨基酸缺失降低了NBD1的热稳定性及其与跨膜结构域适当相互作用的能力[4］．ΔF508-CFTR保留在ER中，因此它只是核糖基化[5］．它在蛋白酶体中迅速降解[6］．最近，FDA已批准Kalydeco (VX-770)用于患有G551D突变的患者，这也与严重CF有关[7］．与ΔF508-CFTR不同，G551D是一个门控突变体，可传输到质膜，但需要增强其缺陷通道活性[8］．服用Kalydeco的患者，这源于对G551D突变通道功能增强的需求的基本理解[9]，其疾病的大部分临床表现均有显著改善[7］．然而，事实证明，纠正ΔF508-CFTR非法交易更为困难[10］．例如，为拯救ΔF508-CFTR加工和贩运而开发的小分子VX-809，已用于ΔF508-homozygous患者的IIa期临床试验，但临床疗效有限[11］．因此，要么必须确定一种新的校正剂，要么必须将VX-809与其他小分子结合以达到治疗水平。

人们对NBD1中的门控和传输突变(如G551D和ΔF508-CFTR)非常感兴趣。我们最近证明了另一种NBD1突变体A455E可以被拯救[12］．然而，问题是针对NBD1突变开发的治疗方法是否对NBD2突变有效。NBD1和2形成密切的相互作用，这对ATP结合和水解至关重要，从而最终调节通道门控[13］．NBD1的突变通常也表现为NBD2的变化[14，15］．然而，NBD2被转译并达到成熟构象的时间远晚于NBD1 [15，16］．由于这种时间差异，目前尚不清楚用于拯救NBD1突变的策略是否也能拯救NBD2。为了解决这个问题，我们现在专注于两个NBD2突变，N1303K和S1235R。

N1303K在欧洲的发病率很高，据报道，它是意大利第二常见的突变(4%)。在某些地区，这种突变的发病率甚至更高，例如，在法国西南部地区达到7.8% [17］．N1303K被归类为胰腺方面的严重突变(导致胰腺功能不全和糖尿病)[18];它也与早熟和严重的肺部症状有关，例如新生儿气胸[19］．S1235R的发病率约为1%(东欧为3.3%)，显著高于其他罕见突变。表型表现似乎比与N1303K相关的表现更温和，更多变，主要与慢性胰腺炎相关，与汗液氯化物检测结果相关[20.- - - - - -23]，这两种突变加在一起，占CF突变(ΔF508除外)的很大比例。

我们现在测试了两种挽救NBD2突变体的策略，小分子校正或转互补。除了VX-809，还有一些校正器已经确定，并可通过CF基金会治疗(CFFT)获得。在本研究中，我们研究了C3和C18(均由Vertex标识)[24]和C4(由皮蒂蒙特和他的合作者确定)[25];以及CFFT-003及004 [26］．此外，我们的团队一直在开发一种基于转互补的纠正CFTR加工突变体的新的基因治疗方法，其中与ΔF508-CFTR共表达的截断形式的CFTR能够通过形成双分子复合物或取代突变体ΔF508-CFTR的伴侣来拯救它。这一策略允许CFTR传输到质膜，恢复其功能[27］．我们的数据表明，小分子校正器可以挽救NBD2突变体，但它们在联合使用时比单独使用时功能更好。此外，我们还证明了转互补方法也可以挽救NBD2突变体。

方法

细胞培养

用青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)和10%胎牛血清在Dulbecco改良Eagle 's培养基(DMEM)中培养非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系(COS-7)。人胚胎肾(HEK) 293细胞(目录#CRL-1573, Life Technologies)用青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)、水霉素B (100 μg/ml)和10%胎牛血清维持在DMEM高葡萄糖1x中。人胚胎肾Flp-In-293细胞系用于产生两个表达PBI CMV的稳定细胞系2N1303K CFTR和PBI CMV2S1235R CFTR质粒(由Phil Thomas (U. Texas, Southwestern)提供。稳定细胞系的使用使得在每个实验中个体样本中的突变体表达一致。

质粒和转染

通过瞬时转染Cos-7细胞或使用HEK Flp-In-293细胞稳定表达对突变体进行研究。PBI巨细胞病毒2N1303K CFTR, pc-DNA Δ27-264, PBI CMV2S1235r cftr, pbi CMV2CFTR和PBI CMV2ΔF508质粒使用Lipofectamine 2000进行瞬时转染。按照Invitrogen协议进行转染。细胞在常规DMEM培养基中培养，转染时融合度达到70-90%。Lipofectamine 2000在Opti-MEM培养基中稀释。DNA在DMEM培养基中被稀释。在室温孵育5分钟后，将洗脱的脂质体与洗脱的DNA混合。该溶液在室温下孵育20分钟。在此期间，用于培养细胞的培养基被Opti-MEM培养基取代。孵育20分钟后，将含有DNA和脂质体的溶液倒入6孔培养皿中，在37℃下孵育。5小时后，将含有稀释Lipofectamine和DNA的Opti MEM培养基替换为普通DMEM培养基。 48 hours after transfection, cells were harvested and used for western blotting.

西方墨点法

使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(50 mM NaCl, 150 mM Tris-HCl, pH 7.4和1% Nonidet P-40)收集细胞(Roche Applied Science)。裂解物在15000 rpm下离心20分钟。将颗粒丢弃，收集上清液用于western blotting。CFTR检测使用针对R结构域(aa 807-819)的单克隆小鼠IgG1 217，稀释1:100，或针对NBD2 (aa 1204-1211)的单克隆小鼠IgG2b 596(217和596来自北卡罗来纳大学教堂山分校的Jack Riordan)，稀释1:100。以Ezrin蛋白为负载对照，采用小鼠单克隆抗体(Santa Cruz)检测。二抗:小鼠IgG1(稀释1:10000;圣克鲁斯)。用Pierce ECL Western Blotting Substrate增强信号。化学发光是由富士影业的LAS-4000 plus系统和冷却CCD相机捕获的。使用Image Gauge 3.2版软件(富士胶片)在线性范围内进行量化。

Co-Immunoprecipitation

蛋白提取完成后进行免疫共沉淀:80 μl蛋白A/ g -琼脂糖珠(SantaCruz Biotechnology)用裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂预洗4次。细胞裂解液(2000 μg)与抗cftr抗体M3A7 (Millipore)和A/G珠在4℃下旋转4 h。样品在高速台式离心机上以2000 rpm离心2 min，弃上清，用裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂洗涤a /G珠4次。将样品缓冲液2X + β-巯基乙醇与微珠1:1加入。按照上述方法，对每个单独的共免疫沉淀蛋白使用适当的抗体进行western blotting。以CFTR沉淀(抗体M3A7下拉，596 blot)作为对照。兔多克隆抗体用于VCP和HDAC6 (1:200);小鼠HSP27 (1:2000)， HSP40和70(1:1000)和HSP90(1:50 00)单克隆(Santa Cruz Bioltechnology)

生物素酰化

表面蛋白用生物素(Thermo Scientific)在4°C下标记20分钟，然后用甘氨酸200mM冲洗3次。细胞裂解后，将1500 μg蛋白与亲和素珠(NeutrAvidin Ultra Link Resin, Thermo Scientific)在4℃下孵育1 h，分离表面标记蛋白。用裂解液洗涤样品4次。丢弃上清液，将Laemmli样品缓冲液2X + β-巯基乙醇1:1加入亲和素珠中。样品用于western blotting。作为内对照，使用小鼠单克隆抗体检测ezrin。

小分子校正和抑制剂

我们测试了化合物C3, C4和C18，从CFFT面板库(www.cftrfolding.org)，以及从Martin Mense (CFFT)获得的CFFT-002和CFFT-003。此外，我们使用了化合物C3, C4和C18的组合。还研究了蛋白酶体、聚合体和溶酶体抑制剂(MG132、tubacin和E64)对N1303K和S1235R突变的影响。首先进行了增加剂量的剂量反应实验:3种校正剂和tubacin分别为1、5、10和20 μM, E64为1、10、50和100 μM。最好的两剂至少重复三次。

短路电流测量

短路电流(ISC)使用六通道简易安装室系统(生理学仪器，圣地亚哥，CA)进行测量。CFBE410-细胞(加利福尼亚大学旧金山分校Dieter Gruenert博士的礼物)使用Flp-In技术稳定转染N1303K。一旦细胞系建立并通过western blotting验证含有N1303K，细胞就在Snapwell过滤器上生长(Corning Costar, Acton, MA;3407)。用含有Δ264-CFTR (8-9 X 1012矢量基因组/ml，由佛罗里达大学的CF矢量核心使用标准技术生产[28])持续3 d，感染后1周测定Isc。我SC使用VCCMC6多通道电压电流钳位放大器(生理学仪器公司)进行测量。数据采集在一台1.71 ghz的PC机上，运行Windows XP (Microsoft, Redmond, WA)，配备DI-720 (DATAQ Instruments, Akron, OH)，并使用2.3.159版本的Acquire and Analyze (physiological Instruments)软件。细胞单层分别用含120 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl的溶液浸泡2， 2 mM CaCl2、10 mM d -葡萄糖和10 mM HEPES(用NaOH调整到pH 7.3)。溶液保持在37°C，并与空气轻轻起泡。稳定后，将10 μM forskolin和50 μM染料木素)加入两个腔室，然后加入CFTR通道抑制剂[29CFTRinh-172 (10 μM)。

统计数据

Western blot检测采用独立样本、t检验和单因素方差分析，LSD事后检验。P≤0.05为有统计学意义，数据以均数±2SEM表示。所有实验都归一化到相应的对照组和Ezin。采用SPSS (version 17.0 SPSS, Inc, Chicago, III)进行数据分析

结果

N1303K和S1235突变的特征

将N1303K和S1235R、野生型CFTR和ΔF508的cDNA转染到Cos-7细胞系中，比较N1303K和S1235R两种突变与CF最常见突变wt CFTR和ΔF508的蛋白表达。密度分析显示，N1303K表达了与ΔF508相似的未成熟B带，以及几乎检测不到的成熟C带。S1235R表达了B带和C带，与wt CFTR相比，表达水平较低(图1)．众所周知，在降低温度下生长细胞(称为温度拯救)可以拯救ΔF508-CFTR [5］．这确实是我们观察到的ΔF508-CFTR:当我们在24°C而不是37°C培养细胞时，未成熟B带和成熟C带都有所增加(图1)．与之形成鲜明对比的是，NBD2突变体的结果不同:温度拯救对N1303K或S1235R的C带的成熟没有影响(图1)．唯一显著的影响是，当细胞在低温下生长时，S1235R的成熟B带增加。

缩略图
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图1所示。N1303K和S1235R的表征和温度校正。

(一)用野生型(wt) CFTR、ΔF508、N1303K或S1235R转染Cos7细胞，然后在37°C或25°C连续培养24小时。数据总结在(B和C)。在较低的温度下生长的细胞显著增加ΔF508的B和C波段，表明温度拯救。25°C处理后N1303K的B带和C带均未增加。对于S1235R, B带有所增加，c带无明显影响。因此，本研究的NBD2突变体均不响应低温。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g001

接下来，我们应用蛋白酶体、聚合体和溶酶体抑制剂来研究N1303K和S1235R突变体的降解途径(图2)。2而且3.)．当我们使用蛋白酶体降解的非特异性抑制剂MG132时[12]， N1303K CFTR中B带和C带的表达明显增加，说明该突变在蛋白酶体中被降解。当我们使用HDAC6的抑制剂tubacin来阻止向聚集体的运输时，效果更加显著[30.］．另一方面，当我们应用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64时[31]，在表达N1303K的细胞中，我们发现B带和C带都没有明显变化，这表明该突变体在溶酶体中没有降解(图2)．我们发现，当应用管杆菌素时，N1303K的未成熟B带和成熟C带都有更大的增加，这种强烈的影响，特别是对未成熟B带的影响，表明在聚合体形成中起主要作用[32]在这个突变体的退化过程中。

缩略图
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图2所示。N1303K突变的降解途径。

稳定表达N1303K的HEK 293细胞株经(一)溶酶体抑制剂E64(B)蛋白酶体抑制剂MG132或(C)侵袭抑制因子。(D)从图中可以看出，N1303K突变体主要由蛋白酶体和聚集体降解;溶酶体处理后无影响。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g002

缩略图
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图3所示。S1235R突变的降解途径。

稳定表达S1235R的HEK 293细胞株经(一)溶酶体抑制剂E64， (B)蛋白酶体抑制剂MG132，或(C)侵袭抑制因子。（D)从图中可以看出，S1235R突变体主要通过蛋白酶体和聚合体进行降解;溶酶体处理后无影响。细胞在37°C下培养16小时，加入或不加入指定的抑制剂(E64, MG132, tubacin)。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g003

与N1303K一样，S1235R突变不受E64抑制的影响。有趣的是，当我们将MG132应用于表达S1235R突变体的细胞时，我们看到未成熟B带增加了6倍(图3)．当应用管杆菌素时，也注意到类似的效果。在这两种抑制剂的情况下，只有一个适度的影响成熟C带。我们使用抑制剂的结果表明，细胞处理这些突变体的方式完全不同。

应用小分子校正剂对N1303K和S1235R的蛋白表达水平有显著的挽救作用

许多校正分子已被证明可以挽救ΔF508-CFTR [33，我们在这里问的问题是他们是否会拯救NBD2中的突变体。为了解决这个问题，我们将细胞与以下化合物分别孵育16小时:C3, C4, C18, CFFT-002和CFFT-003 (图4A, C)．在N1303K突变的情况下，大多数校正器都增加了B和C带。而C3+C4和C4+C18复合处理效果最为显著。这两种组合都显著增加了N1303K的B和C带水平，至少增加了2到3倍。以S1235R为例，所有校正器似乎都有类似的效果，无论是单独使用还是联合使用，在B和C波段都增加了大约两倍(图4B, D)．

缩略图
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图4所示。小分子校正对N1303K和S1235R的拯救作用。

HEK 293细胞株稳定表达(一)N1303K或(B)单用化合物(C3, C4, C18, CFFT 002, CFFT 003)或两种化合物(C3+C4, C4+C18，或C3+C18)处理S1235R。(C及D)从图中可以看出，所有化合物都能显著增加N1303K和S1235R的B带和C带。C3+C4和C4+C18组合效果最显著。细胞在37°C下培养16小时，有或没有校正器。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g004

经校正化合物处理后，N1303K和S1235R的B、C带稳定性均显著高于对照组

用环己亚胺处理细胞以抑制蛋白质合成[34]，然后在时间0或1、2、4、8、24 h后收获。Western blot分析显示，N1303K的C带半衰期约为4 - 8 h (图5A, C)．有趣的是，N1303K的B带可以在24小时检测到。类似的测量表明，wt-CFTR的成熟C带是一种相对稳定的蛋白质，半衰期长，而ΔF508-CFTR的未成熟B带半衰期短，表明降解迅速[35，36］．N1303K的成熟C带半衰期较wt-CFTR的半衰期短，说明虽然加工了部分C带，但其稳定性不如wt-CFTR的成熟C带。在温度挽救的情况下也得到了类似的观察，它促进了ΔF508-CFTR的不稳定成熟C带的处理，与wt-CFTR的成熟C带相比，该C带迅速退化[36］．与ΔF508-CFTR的未成熟B带半衰期非常短不同，N1303K的未成熟B带在24小时后仍然可以检测到。这种稳定性可能表明N1303K突变体的加工在ER中被阻止，并且可以通过适当的校正子组合，如C3+C4或C4+C18 (图4)．另一方面，S1235R突变体的半衰期超过24小时(图6A, C)，其半衰期更接近于wt-CFTR [36］．当化合物C3和C4(浓度为5μM)作用于突变体(5B,D和6B,D)时，各时间点B和C条带水平均较高;24小时后，用这两种化合物处理的细胞显示出B带和C带的水平仍然高于相应的未处理对照组。因此，似乎校正化合物通过增加S1235R中C和B带的数量来发挥其作用，而在N1303K突变体中，半衰期也增加了。

缩略图
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图5所示。N1303K的半衰期有或没有化合物处理。

用环己亚胺(25μg/ml)处理稳定表达突变体的HEK 293细胞株，1、2、4、8、24 h后收获(A, C)N130K突变体C带的半衰期比B带的半衰期短得多，B带的半衰期长得惊人。当添加C3+C4 5 (μM)时，各时间点的B和C波段水平均较高(B, D)N1303K。校正器组合的主要影响是延长了N1303K的C带半衰期。细胞在37°C下培养16小时，有或没有校正器。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g005

缩略图
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图6所示。用和不用化合物处理的S1235R的半衰期。

用环己亚胺(25μg/ml)处理稳定表达突变体的HEK 293细胞株，1、2、4、8、24 h后收获(A, C)S1235R突变体C条带的半衰期超过24小时。当C3+C4 5 (μM)处理时，S1235R突变体各时间点B和C条带的含量均较高(B, D)。细胞在37°C下培养16小时，有或没有校正器。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g006

小分子化合物增加了定位于质膜的成熟CFTR的数量

进行生物素化，以确定用N1303K和S1235R小分子校正器处理是否可以增加这些CFTR突变体中存在于质膜上的C带数量。当使用5 μM的化合物C3 + C4时，与两种突变体的对照相比，它们能够使成熟CFTR到达细胞表面的数量增加两倍以上(图7)．

缩略图
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图7所示。化合物对CFTR向质膜传递的影响。

稳定表达突变株或突变株的HEK 293细胞株用对突变株效果最好的化合物组合处理。化合物C3+C4 (5 μM)能够显著增加完全糖基化蛋白向质膜的传递，以N1303K (A和C)及S1235R (B和D)突变。细胞在37°C下培养16小时，有或没有校正器。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g007

校正子减少质量控制蛋白的结合

ΔF508-CFTR与ER质量相关蛋白质的相互作用已被广泛研究，已知该途径中的许多关键分子与错误折叠的CFTR相互作用[37］．目前对NBD2与突变体的相互作用知之甚少。如图所示。8而且9，包括热休克蛋白(HSP) 27、40、70和90在内的许多伴侣蛋白与N1303K和S1235R突变体结合。HSP70和90是ER的核心伴侣，有助于wt-CFTR的折叠和ΔF508-CFTR [38，39］．HSP40是HsP70的共同伴侣[40］．VCP蛋白参与突变蛋白向蛋白酶体的易位[41］．最后，HDAC6是一种参与突变蛋白向聚集体转运的蛋白质[32］．重要的是，所有涉及降解途径的相互作用，包括伴侣、VCP和HDAC6，在使用校正剂组合治疗后都减少了(图8)，大大加强了我们的观点，即C3+C4的组合拯救了两个突变体(图4)．同样值得注意的是，与S1235R突变体相比，N1303K突变体结合的减少更大(图8 b)．考虑到N1303K比S1235R引起更严重的CF形式，这些结果可能表明N1303K更积极地参与降解过程。结合数据恰好与N1303K成熟C带解救的增加相平行，与S1235R相比，C3+C4联合处理的解救增加了2倍以上(图8 b)．

缩略图
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图8所示。CFTR, HSPs, VCP和HDAC6在N1303K和S1235R细胞系中共免疫沉淀与化合物处理或未处理。

用C3+C4 (5μM)处理稳定表达突变体的HEK 293细胞株，用抗CFTR抗体M3A7免疫沉淀CFTR。（一)样品进行western blot分析，用不同抗体进行免疫印迹，如图所示。（B)对免疫沉淀样品中检测到的CFTR总量进行了调整(y轴表示每个样品与该样品中CFTR总量的比值)。控件被设置为100%绑定)。结果表明，在5 μM浓度下，C3+C4化合物处理能够显著降低与突变体结合的HSPs VCP和HDAC6的数量。细胞在37°C下培养16小时，有或没有校正器。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g008

缩略图
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图9所示。N1303K和S1235R细胞系中CFTR、HSPs、VCP和HDAC6的总裂解物水平。

（一)样品用于western blot分析，用图中所示的各种抗体进行印迹。(B)与对照组(没有任何CFTR突变的HEK 293细胞株)相比，总裂解液的主要差异是S1235R的HSP27总量显著增加，HSP27与N1303K的结合显著但略有减少。曲线图显示，无论用这些化合物处理还是不处理，携带S1235R突变株的HSP27比对照组和N1303K细胞株高4倍。所有其他测试蛋白(hsp40,70,90, VCP和HDAC6)均未发现差异。HSPs、VCP和HDAC6在单独突变和复合物C3 + C4处理之间没有发现差异。细胞在37°C下培养16小时，有或没有校正器。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g009

在两种突变中，总裂解液显示出相似水平的HSPs, VCP和HDAC6。与对照组相比，总裂解液的主要差异是S1235R的HSP27总量显著增加，N1303K的HSP27总量显著但略有下降(没有任何CFTR突变的HEK 293细胞株)(图9)．

Δ27-264的转互补能够拯救NBD2突变体

我们之前已经证明截断形式的CFTR如Δ264和Δ27-264-CFTR可以挽救NBD1突变体ΔF508-CFTR和A455E CFTR [27，42]，但仍不清楚NBD2突变体是否也能被转补。将Δ27-264质粒瞬时转染到N1303K和S1235R HEK Flp-In-293稳定细胞系中能够挽救N1303K突变，与对照组相比，C带表达增加了3倍(图9)．CFTR截断型Δ27-264的处理也能够挽救S1235R的C带，使其增加2倍以上(图9 b)．重要的是，当在稳定表达该突变体的CFBE中测量N1303K突变体的氯离子转运能力时，我们看到感染含有Δ264-CFTR的AAV1的细胞中Isc显著增加。我们之前已经证明Δ264-CFTR本身不会产生氯通道电流，但它可以挽救ΔF508-CFTR中的氯通道电流[27］．因此，转化互补可以挽救贩卖(图10A, B)和N1303K突变体的氯离子转运(图11)．

缩略图
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图10所示。Δ27-264转互补对N1303K和S1235R突变体的影响。

将Δ27-264-CFTR转染稳定表达突变体的HEK 293细胞株。Δ27-264-is能够显著增加C波段的(一)N1303K及(B)S1235R。图表显示完全糖基化的蛋白质增加了3倍C)N1303K和2次以上(D)S1235R。细胞在37°C下培养48小时，包括或不包括截断的构建物(Δ27-264)。数据用3次独立实验的平均值±标准差表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g010

缩略图
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图11所示。转互补挽救了N1303K CFTR电流。

稳定表达N1303K-CFTR的CFBE细胞在Transwell载体上生长，用10 μl含有Δ264 CFTR的AAV1处理材料与方法。图中，在染料木素中加入10 μM forskolin，在第二个箭头处加入10 μM CFTRinh-172，以表明电流来自CFTR。请注意，与未暴露于病毒的细胞相比，电流大幅增加(代表三个实验)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119796.g011

讨论

在这里，我们研究了NBD2中的两个突变，S1235R和N1303K，并表明两者都可以通过组合使用的小分子校正剂和使用CFTR截断版本的转互补来挽救。N1303K突变与严重CF相关，是NBD2中的加工突变，在大鼠Fischer甲状腺细胞(FRT)和HeLa细胞中评估时，细胞表面具有最小的氯导和成熟的C带[43］．天冬酰胺位于第1303位，位于α -螺旋亚域，也位于NBD1残基505位，3个位于缺失的苯丙氨酸508位氨基酸上。有趣的是，天冬酰胺在ABC转运蛋白家族成员中也高度保守，包括pgp1, mrp1, HisP和TAP1 [44］．考虑到天冬酰胺在氢键中的作用，它可能在野生型CFTR中稳定NBD2以及NBD2与跨膜结构域之间的相互作用中发挥关键作用。另一方面，赖氨酸残基是破坏性的，这表明N1303K的功能和运输较差;它也可能成为异常泛素化的场所，进一步破坏CFTR的正常贩运。相比之下，S1235R与轻度或轻微疾病有关[43］．这个位置的丝氨酸虽然存在于人和小鼠体内，但并不是高度保守的[44］．在NBD1中，等效的氨基酸是谷氨酸，因此S1235R中的精氨酸替代似乎具有轻度破坏性;在FRT细胞中测量到的电导约为wt-CFTR的79%，蛋白质加工几乎相当于在G551D突变体中测量到的[43］．显然，位于NBD2不同部位的这些突变将对CFTR的最终组装产生不同的结构和功能影响。

NBD2突变体的惊人之处在于它们对温度拯救的反应不同。与ΔF508-CFTR和A455E不同的是，它们都经历了大量的未成熟波段B向成熟波段C的迁移[12]， N1303K和S1235R的成熟带在低温下生长时没有增强。在NBD2突变体中缺乏温度拯救可能表明每个结构域实现其最终结构构象的方式不同。当CFTR被翻译时NBD1被折叠[15]，有证据表明NBD2在翻译后折叠是CFTR实现成熟构象的最后一步[45］．其他证据表明，CFTR的所有结构域在翻译过程中都是折叠的[15］．无论CFTR如何折叠，NBD2中的这些突变显然没有实现成熟构象。这两种突变都对蛋白酶体和聚集体抑制剂敏感，这表明它们是通过参与膜蛋白降解的过程降解的。S1235R对结核杆菌素(一种侵袭体抑制剂)特别敏感。S1235R的这种反应与A455E形成了鲜明的对比，后者对管杆菌素不敏感。令人惊讶的是，溶酶体抑制作用很小，尤其是对S1235R突变体，尽管该突变体在质膜上确实有大量的成熟C带。当蛋白翻译被环己亚胺抑制时，N1303K的未成熟B带比ΔF508-CFTR更稳定，其降解迅速，消失得相当快(见[42])。另一方面，加工的少量成熟C带寿命短，表明成熟带不稳定。这些结果表明，与NBD1中的两个突变A455E和ΔF508-CFTR相比，这些NBD2突变体的处理存在差异。

那么，问题是，考虑到这些差异，设计用于拯救NBD1的校正子能否拯救NBD2突变体?为了研究小分子对NBD2突变体的校正，我们测试了许多化合物的效果:C3, C4, C18, CFFT 002和CFFT 003;C3 C4和C18。后三者也被结合使用。当应用小分子校正剂时，N1303K的B带和C带显著增加，当它们一起使用时，具有加性效应。在S1235R上也发现了类似的结果;所有化合物单独给药均有不同程度的疗效。然而，当它们同时施用时，我们看到的效果不如我们观察到的N1303K显著。为了研究这种效应是否只与CFTR稳态有关，还是与氯离子通道的成熟程度增加有关，我们用效果最好的化合物(5μM时C3+C4)进行了生物素化实验。结果表明，当C3+C4作用于细胞表面时，N1303K和S1235R完全糖基化带的存在显著增加。 Thus, combined corrector therapy was able to increase their CFTR maturation and the delivery to the plasma membrane.

最近，我们在这里使用的校正器被分为不同的类别:C3和C18被分配到I类，这是稳定NBD1- CL1-4接口的校正器。C4被分配到II类，即恢复NBD2或其接口的校正器。校正器cfft002及003不包括在分类方案内[33］．有趣的是，尽管C4据称会影响NBD2或其界面，但在我们手中，它对两种NBD2突变体都有影响，但效果不如我们尝试的其他突变体那么显著。当我们将I类校正器与II类校正器结合使用时，N1303K的影响最为深远，这表明NBD2的突变也可能对CFTR的其他部分产生影响，这些部分本身也必须得到纠正。有趣的是，C3+C4的组合对N1303K与ERAD相关蛋白的相互作用有很大影响，这是它们联合有效性的另一个迹象。

在过去的几年里，我们的团队已经证明了ΔF508的转互补可以挽救它的处理和功能。特别是，我们已经证明，缺少前264个氨基酸的CFTR Δ264能够增加ΔF508中未成熟B带的水平，导致其加工增强到成熟c带。在这种情况下，主要作用机制是干扰VCP-HDAC6/CFTR复合体，促进成熟ΔF508转位到细胞表面[42］．后来，通过将wt-CFTR的前27个氨基酸添加到Δ264结构(Δ27-264)的n端，对该结构进行了修改。这一改进使Δ27-264-CFTR利用了与Δ264相同的机制，但也促进了新结构与ΔF508的直接结合，从而增加了质膜上成熟蛋白的数量，并挽救了氯通道的门控功能[27］．我们在这里表明，转染Δ27-264质粒确实导致N1303K和S1235R完全糖基化带的拯救。有趣的是，Δ27-264的效果与大多数测试的化学校正器相当。由于Δ27-264能够通过双分子相互作用与ΔF508相互作用，我们认为类似的机制也可能拯救NBD2突变体，让Δ27-264 CFTR作为分子伴侣帮助NBD2突变体实现更原生的状态[27，42］．另一方面，考虑到Δ264 CFTR对ERAD通路中的关键分子的影响，NBD2突变体的转互补可能是通过ERAD对其加工的破坏发生的，从而允许更多的c带到达质膜。

总之

我们的研究结果表明，N1303K突变对CFTR过程的影响比S1235R更深远，这与N1303K导致严重CF而S1235R仅导致轻度至边缘性疾病的观察结果一致[19，23，46］．我们在这里表明，CFTR的这两个NBD2突变体可以被小分子校正器拯救，这些校正器不仅在提高NBD2突变体中B和C带的水平方面有效，而且在显著增加成熟蛋白到质膜的输送方面有效。这两种NBD2突变体都能与CFTR的截断形式进行转互补。最后，我们的结果表明，N1303K或S1235R突变的患者可能是小分子校正剂结合CFTR截断形式的转互补治疗的良好候选者，Δ27-264。

致谢

作者感谢黛比·麦克莱伦对手稿的编辑。

作者的贡献

构思并设计实验:WBG LC。进行实验:DR IS MLP RG LC。分析数据:DR IS MLP WBG LC。撰写论文:DR IS MSP WBG LC。

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