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研究文章

差异表达等离子体小分子核糖核酸和潜在的监管功能的Let-7b慢性血栓栓塞肺动脉高压

  • Lijuan郭,

    从属关系北京重点实验室的呼吸和肺循环障碍,北京朝阳医院,首都医科大学,北京,中国公关,北京呼吸医学研究所、首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 远华杨

    从属关系北京重点实验室的呼吸和肺循环障碍,北京朝阳医院,首都医科大学,北京,中国公关,北京呼吸医学研究所、首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 杰,

    联系首都医科大学生理学系,北京,中国的公关

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  • 王磊,

    从属关系北京重点实验室的呼吸和肺循环障碍,北京朝阳医院,首都医科大学,北京,中国公关,北京呼吸医学研究所、首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 杰出的,

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  • 应王

    联系北京重点实验室的呼吸和肺循环障碍,北京朝阳医院,首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 刘燕,

    联系北京朝阳医院心内科,首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 歌谷,

    联系北京朝阳医院心内科,首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 汇丽甘

    从属关系心脏外科学系,北京安贞医院,首都医科大学,北京,中国公关,北京理工大学的心脏、肺和血管疾病,首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 小君Cai,

    联系北京朝阳医院心内科,首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 杰森X.-J。元,

    联系芝加哥伊利诺伊大学医学系,芝加哥,伊利诺斯州,美国

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  • 6月王,

    cyh-birm@263.net(CW);wang_jun@ccmu.edu.cn(JW)

    从属关系北京重点实验室的呼吸和肺循环障碍,北京朝阳医院,首都医科大学,北京,中国公关,生理,首都医科大学,北京,中国的公关

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  • 陈王

    cyh-birm@263.net(CW);wang_jun@ccmu.edu.cn(JW)

    从属关系北京重点实验室的呼吸和肺循环障碍,北京朝阳医院,首都医科大学,北京,中国公关,北京呼吸医学研究所、首都医科大学,北京,中国公关,北京医院、卫生部、中国北京、公关

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文摘

慢性血栓栓塞肺动脉高压(CTEPH)是一种进行性疾病,其特征是被误导的溶栓和肺动脉重构。小分子核糖核酸是小非编码rna参与多种细胞过程和功能。CTEPH期间,循环microRNA概要文件赋予病变细胞的特性可以识别作为生物标志物,并可能有助于识别的发病机理。因此,在这项研究中,我们比较了差异表达小分子核糖核酸的等离子体CTEPH患者和健康对照组和调查他们潜在的功能。芯片被用来识别微rna表达谱和存在进行验证。差异表达小分子核糖核酸的目标识别在网上,基因本体数据库和京都百科全书的基因和基因组途径数据库被用于目标基因的功能研究概要文件。的目标let-7b被荧光记者试验验证。目标基因的蛋白表达是由ELISA和免疫印迹。细胞迁移是由伤口愈合评估分析。结果表明:1)30 5小分子核糖核酸CTEPH患者表达有差异,其中,17个小分子核糖核酸的签名,显示出与疾病发病机理在网上分析,给诊断敏感性和特异性> 0.9的功效。2)Let-7b,理气anti-oncogenic microrna的签名,验证CTEPH患者减少到0.25折。3)ET-1和TGFBR1 let-7b的直接目标。改变let-7b水平影响ET-1和TGFBR1表达在肺动脉内皮细胞(PAECs)以及PAECs的迁移和肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)。这些结果表明,CTEPH患者异常的microRNA签名这可能为发病机理研究和生物标志物筛选提供一些线索。减少let-7b可能参与CTEPH的发病机理影响ET-1表达式和PAECs和PASMCs的功能。

引用:杨郭L, Y,刘J,王L,李J,王Y, et al。(2014)差异表达等离子体小分子核糖核酸和潜在的监管功能的Let-7b慢性血栓栓塞肺动脉高压。《公共科学图书馆•综合》9 (6):e101055。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055

编辑器:南卡罗来纳医科大学的卡罗尔·Feghali-Bostwick美利坚合众国

收到:2013年12月18日;接受:2014年6月3日;发表:2014年6月30日

版权:©2014郭et al。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是由中国国家自然科学基金的基金(81070041,81070041,81070041,81228001,81370152,81228001)。URL:http://www.nsfc.gov.cn。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

慢性血栓栓塞肺动脉高压(CTEPH)的特点是不断增加肺血管阻力由于未解决的主要肺动脉栓子干道和/或肺微血管重建[1]- - - - - -[3]。最近的流行病学研究表明,幸存者CTEPH在急性肺血栓栓塞的发生率约为2.7% - -8.8%[4]- - - - - -[6],2年生存在未经治疗的患者平均肺动脉压力大于50毫米汞柱低至10%[7]。然而,识别CTEPH进展困难的隐性发病之前,缺乏有效的生物标志物。

小分子核糖核酸(microrna)小内生非编码rna抑制基因表达转录通过绑定到“种子序列”3′未翻译区(utr) mrna的目标。失调的microrna被发现在不同的疾病和生物过程[8]。最近的研究表明,microrna参与肺血管重建和CTEPH的易感性[9],[10],以及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs) malproliferation肺动脉高血压(PAH)[11]- - - - - -[12]。

microrna流传,被称为稳定的microrna在血清或血浆中游离,是由各种被动和选择性地释放到血液细胞,并可能作为发射机或信使细胞通讯[13],[14]。在疾病,microrna表达异常的病变细胞中释放到循环,循环microrna的概要文件是赋予疾病属性[15]。最近,循环microrna都已经被广泛地研究过了作为潜在blood-based疾病诊断生物标记,特别是恶性肿瘤和心血管疾病。等离子体mir - 134已被证明是一个特定的生物标志物对急性肺血栓栓塞[16]。

多个病理生理的进程已报告CTEPH的发展作出贡献[17]- - - - - -[19],包括不平衡endothelin-1 (ET-1),一氧化氮和内皮功能障碍的肺动脉内皮细胞(PAECs)和PASMCs malproliferation。ET-1是一个关键的血管收缩剂特别是肺循环和能引起许多细胞参与血管重建的扩散。CTEPH患者ET-1水平升高[18],内皮素受体拮抗剂(贱民)申请CTEPH治疗[20]。转化生长因子(TGF) -β扮演重要的监管角色平衡的细胞增殖和细胞凋亡。异常激活TGF-β/转化生长因子β受体1 (TGFBR1)信号参与特发性肺动脉高压的发展[21],[22]。澄清microrna候选人之间的关系,这些已知的机制会加剧疾病发病机理的认识。

CTEPH复杂的病理生理学和microrna的广泛监管功能考虑在内,我们假设循环microrna的配置文件可能反映CTEPH的microrna参与发病机理更全面,因此可以作为候选生物标志物和阐明CTEPH发病机理的认识。在这项研究中,我们确定了17个microrna的签名在CTEPH等离子体和调查这个签名的潜在功能在网上。Let-7b microrna的关键之一,是影响显示ET-1 PAECs迁移和PASMCs水平。

材料和方法

主题

研究过程是医学伦理委员会批准的北京朝阳医院隶属于首都医科大学,并获得书面知情同意从每个主题。微阵列的队列由10 CTEPH患者和健康对照组。为进一步验证,另一个40对受试者进行。患者在近似4年(从2007年3月到2010年11月)。诊断CTEPH先前描述的基于标准协议成立[23]。大多数CTEPH患者接受右心导管术。排除标准包括恶性肿瘤、心血管疾病,从未收到任何治疗肺动脉高压的患者除了抗凝。

等离子体收集和RNA提取

全血(2毫升)卷入真空采血管(与EDTA anti-coagulated, BD,新泽西,美国),和等离子体隔离在2小时内完成在1000 g离心10分钟。总RNA的等离子体是收获三试剂(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)。实时PCR的内部控制5 fmol合成Syn-cel-miR-39(试剂盒,瓦伦西亚,CA)添加到等离子体与三试剂混合后,如前所述[24]。

microrna的微阵列和在网上分析

miRCURY LNA数组(14.0版本,Exiqon Vedbaek, DK)在微阵列组执行。微阵列的数据集已提交到存储库中基因表达的混合,加入和号码是GSE56914。随机方差模型(RVM)t以及应用于筛选差异表达microrna。贪婪的搜索、启发式算法进行局部最优选择在每个阶段希望找到全局最优,被送往找到不同的标志组合,每个组合和在对角交叉验证样本,七个诊断方法应用[25]。可以找到更多的细节文件S1。TargetScan和miRDB总和为目标预测。基因本体论(去)数据库[26]和KEGG数据库路径[27]用于功能的调查目标基因差异表达的microrna。的途径分析使用DIANA-miRPath let-7b独自完成[28]。

实时定量逆转录聚合酶链反应

茎环结构实时定量逆转录(qRT)聚合酶链反应(PCR)是用于验证数据通过微阵列在肿大的独立的队列。TaqMan MicroRNA化验,TaqMan微rna逆转录装备,和TaqMan基因表达主混合(美国应用生物系统公司,培育)。实时PCR进行ABI PRISM7500系统(应用生物系统公司、福斯特、美国)。

荧光记者分析

本机3′utr ET-1碎片和包含预测hsa-let-7b TGFBR1结合位点被放大的人类肺纤维母细胞cDNA健康供者和subcloned pcDNA3.1 /增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构造不我和Xba我随后(内,伊普斯维奇,美国)。点突变所产生的控制结构的预测“种子序列”hsa-let-7b使用豆类MutanBEST工具包(豆类、大连、中文)。引物组表S1中所示文件S1。

西方墨点法和酶联免疫吸附试验

目标基因的表达TGFBR1 ET-1是被西方墨点法和酶联免疫吸附试验(ELISA)。

伤口愈合实验

人类PAECs和迁移PASMCs(加州ScienCell我们)被伤口愈合试验评估[29]。

统计分析

人口统计学和临床特点的实验对象被描述为平均数±标准差,或非正态分布数据的中位数。的Mann-WhitneyU测试,测试,两个示例Kolmogorov-Smirnov考试是用来检验两组之间的差异。多重比较是由双向方差分析与事后Student-Newman-Keuls方法测试。接受者操作特征(ROC)曲线分析也对CTEPH候选人miRNA级别执行。单变量线性和物流进行了回归分析来评估候选人microrna和临床相关指标之间的关系。年龄和性别被认为是作为控制变量。SPSS 16.0统计分析和使用P< 0.05(双尾)被认为是具有统计学意义。

其他详细信息是可用的文件S1。

结果

临床特点的主题

十CTEPH患者和10健康对照组在年龄和性别匹配参与微阵列群,和另一个40对验证队列。显示在基线和临床特征表1。在微阵列队列,所有CTEPH患者接受心脏导管插入术,和急性血管反应测试是积极的在1的9 (11.1%)。平均肺动脉压力为54.6毫米汞柱,肺血管阻力为1071.2达因·s·厘米−5。在验证组,36 CTEPH患者接受心脏导管插入术,和急性血管反应是积极的在6科目(16.7%)。平均肺动脉压力为51.5毫米汞柱,肺血管阻力是1079.4达因·s·厘米−5。之间没有区别CTEPH微阵列和验证组的患者血流动力学指标、深静脉血栓形成,功能类,6分钟步行距离,急性血管反应和n端pro-brain利钠肽除了c反应蛋白(表S2文件S1)。

缩略图
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表1。临床特点的学科。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.t001

异常表示循环microrna CTEPH病人

确定微分循环CTEPH microrna的状况,我们采用miRCURY LNA数组(版本14.0)系统与等离子体中提取RNA 10 CTEPH患者和健康对照组。显示在表S3文件S1、循环microrna的概要CTEPH患者和健康对照组之间显著不同。1700调查这个数组,我们发现15上调20理气miRBase包括microrna CTEPH患者与健康对照组相比P< 0.05。

为了进一步确定CTEPH的分子签名,贪婪搜索应用。基于35个差异表达的microrna从微阵列,我们确定了17个microrna的组合显示最好的诊断效果。诊断模型构建与他们给的诊断敏感性和特异性> 0.9(表S4的7个方法文件S1)。分层集群的microrna签名所示图1。的前五名中包含的microrna microrna表达六上调mir - 1260, mir - 602, mir - 129 - 5 - p, mir - 1908和mir - 483 - 5 - p foldchange,虽然11抑制microrna的前五名mir - 140 - 3 - p, mir - 93, miR-22, mir - 106 - b和let-7b。

缩略图
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图1所示。循环microrna签名CTEPH患者和健康对照组。

阶层式聚类和最佳循环microrna的热图图签名来自贪婪搜索。RNA分离从CTEPH EDTA-coagulated等离子体(n = 10)患者和健康对照组(n = 10)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.g001

预测调查的microrna的签名功能

说明差异表达的潜在作用microrna在疾病的发病机理,途径分析,分析应用,重要途径和前10%显著类别一致的重量所示图S1和图S2。

考虑到可能的CTEPH病理生理学,我们过滤这些重要的途径和类别最重要的功能。是显示在表2,与增殖相关的途径是最重要的,和与免疫相关的通路被上调,而一些心血管相关通路被抑制。在类别(表3),细胞功能监管类别被上调,而钙运输监管和负调控细胞增殖的类别被抑制。

缩略图
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表2。过滤途径CTEPH的潜在发病机理。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.t002

缩略图
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表3。过滤去类别CTEPH的潜在发病机理。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.t003

循环Let-7b CTEPH患者明显减少

确认这些发现从microrna的概要,并试图找到获得候选microrna的进一步调查其在疾病中的作用,经过详细的文献综述(表S5文件S1),我们选择性测量3 microrna的表达一个独立的大群CTEPH (n = 40)患者和健康对照组(n = 40)使用TaqMan存在。3中包括microrna,上调mir - 602是致癌,而理气let-7b和miR-22 anti-oncogenic参与肺病或细胞的迁移和增殖(表S5文件S1)。所示图2一个符合microrna的概要,let-7b miR-22 CTEPH病人血浆水平显著降低(P< 0.001)。然而,老年病mir - 602的群签名中没有观察到验证。CTEPH患者的验证组,let-7b水平不同病人之间的积极的和消极的急性血管反应,而与纤溶酶原激活物抑制剂1水平呈正相关,肺动脉栓塞,并与心脏指数负相关(表S6文件S1和图S3)。ROC曲线分析显示,let-7b和miR-22温和CTEPH诊断价值曲线下的面积为0.769(95%置信区间CI: 0.664 - -0.874)和0.751(95%置信区间:0.645—-0.857)分别为(图2 b)。

缩略图
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图2。差异表达microrna的独立验证。

三个候选人microrna (mir - 602、let-7b和miR-22)芯片的验证中存在的一个独立的群CTEPH (n = 40)患者和健康对照组(n = 40)。(一个(2)相对表达式-ΔCT)规范化cel-miR-39是显示为中位数和四分位。P价值被Mann-Whitney计算U测试。* * *P< 0.001。(BROC曲线分析和AUC 2验证microrna (let-7b和miR-22) CTEPH的诊断。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.g002

ET-1和TGFBR1 Let-7b的直接目标

为了研究的功能验证microrna在CTEPH,首先我们预测他们的目标基因在网上分析。结果表明,ET-1和许多重要的受体在TGF-β和增殖蛋白激酶通路包含let-7b结合位点的3′-UTRs,这表明他们可能let-7b的潜在目标。因此我们选择let-7b作为候选人microrna在以下研究。最具有高度针对性的途径和let-7b包含在这些途径的潜在的目标是显示在表S7文件S1。十大通路,TGFBR1是包含在其中的5,这个结果表明TGFBR1可能let-7b的核心目标。

直接目标确定let-7b ET-1或TGFBR1正如预测的那样,我们构造了一个EGFP记者携带假定的let-7b结合位点3′utr ET-1或TGFBR1。控制结构分别来自野外的点突变(图3 a和b)。Co-transfection HEK293细胞与野生型3′utr TGFBR1记者构造和2′- ome修改let-7b模仿导致减少约45%的EGFP荧光与控制转染(图3 c)。抵消了部分减少种子结合位点突变时(图3 c)。所预测的Targetscan RNAhybrid,有两个let-7b结合位点的3′utr ET-1 (图3 b)。减少大约40%的EGFP荧光结构包含一个野生型3′utr ET-1的检测与控制转染与结合位点突变构建(图3 d)。的结合位点的预测RNAhybrid (ET-1-mut2),似乎比另一个更强大的。这些数据表明,TGFBR1和ET-1 let-7b的直接目标。

缩略图
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图3。ET-1和TGFBR1 let-7b的直接目标基因。

EGFP记者试验申请目标验证HEK 293个细胞。寡核苷酸模仿和消极的控制(数控)let-7b co-transfected记者质粒和突变控制,分别。(一个)&(B)预测双TGFBR1 let-7b及其目标地区和ET-1分别与实验种子序列的突变。表明该地区数量在其3′-UTRs。所示的核苷酸突变是红色,和最初的核苷酸是互补的。(C)&(D)let-7b理气EGFP表达通过预测种子序列3′-UTRs ET-1 TGFBR1。P价值是由两个示例计算Kolmogorov-Smirnov测试。*P< 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.g003

Let-7b CTEPH患者血浆ET-1水平呈负相关

如上所述,ET-1是let-7b的直接目标之一。文献表明,ET-1肺循环的关键血管收缩剂,并在肺动脉高压的病理生理学包括CTEPH表示[18]。进一步确定ET-1表达和let-7b之间的关系,验证组的血浆ET-1水平被ELISA检测。所示图4一,等离子ET-1水平显著升高CTEPH患者与健康对照组相比P< 0.001)。这是与以前的报告一致[18]。此外,ET-1水平呈负相关,适度的等离子let-7b级别(r=−0.456,P< 0.001)(图4 b)。这些数据表明,let-7b下调的可能与CTEPH ET-1水平升高的患者。

缩略图
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图4。等离子体ET-1水平升高与let-7b CTEPH患者及其相关。

(一个)等离子体endothelin-1 CTEPH水平(n = 40)患者和健康对照组(n = 40)衡量ELISA。P价值被Mann-Whitney计算U测试。P< 0.001。(B斯皮尔曼相关和散点图的等离子体endothelin-1和let-7b (n = 80)。X轴和y轴log10转换。相关系数和P值被显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.g004

改变监管Let-7b ET-1 PAECs TGFBR1表达式

为了进一步说明let-7b的函数,let-7b拮抗剂慢病毒或者let-7b模拟被用来减少或增加人类PAECs let-7b表达式。感染复数20实现对手慢病毒的感染率超过90%和80% -90% let-7b模仿(数据未显示),而let-7b水平降低了大约45%,增加2倍(图5一个)。引起let-7b PAECs, TGFBR1表达显著增加,相反的结果中看到let-7b过度细胞(图5 b)。类似的结果还发现ET-1水平PAECs培养基(图5 c)。ET-1表达式是一个复杂的过程受多种细胞因子,包括TGF-β。先前的研究表明,TGF-β刺激的表达通过TGFBR1 ET-1优先[30]。目标TGFBR1 let-7b也可以,效果TGFBR1 let-7b监管的ET-1应该澄清。因此,我们沉默TGFBR1引起let-7b PAECs核。所示图5 d,let-7b ET-1水平的增加与PAECs逆转接近正常水平。这些数据表明,TGFBR1参与ET-1 let-7b监管,这似乎是在直接定位的影响。

缩略图
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图5。改变监管let-7b ET-1 PAECs TGFBR1表达式。

人类肺动脉内皮细胞(PAECs)感染let-7b拮抗剂/ \模仿慢病毒或空的控制。(一个)内源性let-7b被对手慢病毒水平下降约55%,增加到2折的模仿。(B)经过β-actin规范化,TGFBR1表达增加半let-7b拮抗剂感染PAECs和稍微降低let-7b vegf蛋白免疫印迹细胞。(C)培养基收集连续培养48 h后,和ET-1水平被ELISA检测。ET-1水平的培养基let-7b过度PAECs明显减少,并增加引起let-7b PAECs。(D与核)引起Let-7b细胞转染TGFBR1分别和控制核。沉默与核TGFBR1可能扭转ET-1水平导致增加了let-7b拮抗剂(n = 5)。P价值是由两个示例计算Kolmogorov-Smirnov测试。* * *P< 0.001。*P< 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.g005

Let-7b监管PAECs并通过TGFBR1和ET-1 PASMCs迁移

肺血管重建是CTEPH至关重要的病理变化,并激活迁移PAECs和/或PASMCs有助于这一过程。我们调查的可能作用let-7b PAECs迁移和PASMCs后,伤口愈合实验减少或增加其表达式使用对手慢病毒或者let-7b模仿分别图5。PASMCs显示类似的效率PAECs一样,所示图5一个。事后考验后,所示图6,迁移PAECs轻视抑制let-7b过度时,但当PAECs拮抗剂显示没有影响正常培养基培养。TGFBR1和ET-1 let-7b被认定为直接目标,我们认为他们可能参与let-7b调控细胞迁移。然后TGF-β(10 ng / mL)添加到培养基。结果表明,TGF-β可能诱发let-7b数控PAECs的迁移,而在介质培养TGF-β,迁移引起let-7b PAECs进一步提升。类似的结果观察PASMCs除了感应的TGF-βlet-7b PASMCs (图6 b)。上述结果表明TGFBR1参与let-7b PASMCs迁移和PAECs监管。

缩略图
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图6。Let-7b监管PAECs和PASMCs迁移。

人类PAECs或PASMCs与let-7b拮抗剂慢病毒转染或let-7b模仿,和迁移是由伤口愈合评估分析。照片拍摄在0 h、12 h, 24小时和48小时。受伤的区域表示为复苏的百分比。(一个)Let-7b模仿抑制PAECs迁移,其拮抗剂提升TGF-β诱导PAECs迁移在24小时(n = 5)。(B)。Let-7b模仿抑制PASMCs迁移,其拮抗剂提升TGF-β诱导PASMCs迁移在24小时(n = 5)。P值是由双向方差分析计算,事后测试是由Student-Newman-Keuls方法。* * *P< 0.001。*P< 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.g006

ET-1,因为没有pro-migration效果观察到let-7b拮抗剂诱导ET-1增加(图5 c和图6),选择性内皮素受体拮抗剂(η,bq - 123,西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)被用来观察的影响脱抑制ET-1 PAECs迁移。所示图S4A埃塔(1纳米)会抑制正常PAECs迁移,并通过let-7b拮抗剂抑制效应被削弱。PASMCs,他们不是首席细胞内源性ET-1表达式,外生ET-1 PASMCs迁移被用来观察其影响。我们看到ET-1可以促进迁移let-7b数控和let-7b引起了PASMCs (图S4B)。以上这些结果表明尽管ET-1不是let-7b和PAECs迁移之间的主要中介,脱抑制的ET-1 let-7b部分参与了PAECs迁移,ET-1升高也可能诱发PASMCs迁移。

讨论

在本研究中,我们表明,CTEPH病人有不同表达microrna的概要文件。和17个microrna的签名证明相关疾病发病机理和给敏感性和特异性的诊断效果> 0.9。Let-7b, microrna的关键之一,可能参与了发病机理的CTEPH影响PAECs迁移和PASMCs ET-1表达式。

尽管许多研究都集中在相关的风险因素,遗传易感性,CTEPH病理学、治疗、预后[2],[7],[10],[31]近年来,仍然有许多需要进一步认识,特别是对其发病机理。早期治疗前右心不足通过肺部动脉内膜切除术或适当的治疗是改善预后的关键[32]。这强调了需要开发敏感和可靠的生物标志物CTEPH的早期诊断。

目前,可能由于复杂的病理生理学CTEPH, CTEPH报道候选人分子生物标记,包括不对称dimethylarginine[33],肺动脉栓塞[34]心肌脂肪酸结合蛋白[35]和脑利钠肽[36]仍然没有足够可靠的临床应用。因此,一些生物标记的组合代表不同的病理生理方面的疾病可能会倾向于未来的生物标志物的筛选。新兴的微阵列技术已经使人们有可能达到数万相应基因表达作为筛选的基础。在许多疾病生物标志物特征研究[37],[38],包括癌症,心血管疾病。microrna是公认的有限监管大多数蛋白质编码基因表达转录。因此,它似乎更实际探索microrna作为疾病生物标志物与复杂的病因和病理生理学。研究microrna的签名在最近几年急剧增加[39],[40]。这些研究表明,某些疾病诊断和microrna的签名有满意的疗效评价。

作为理想的诊断的生物标志物,microrna拥有许多维持属性。首先,循环microrna是非常稳定甚至暴露于恶劣的环境[15],[24]这个特点使检测重复性良好。第二,pathognostic microrna的细胞资源[14]确定循环microrna的高特异性疾病诊断。第三,microrna是小分子,缺乏后处理改性。他们可以检测到一个极度敏感的方法开始以非常低的浓度[41]。虽然人口众多的验证结果仍然需要在我们的研究中,循环microrna CTEPH诊断提供一种很有前途的前景。在验证过程中,签名可以进一步简化为临床应用和疗效和精度可以提高。

自2008年以来,许多研究表明,循环microrna是功能分子可能在细胞通讯和抑制目标基因在受体细胞的翻译。最近的一项研究[15]表明,在健康受试者中,循环microrna的概要文件是类似于血液细胞的轮廓,但这种相似性干扰患病的主题,和循环microrna的概要文件赋予细胞参与了疾病的特征。在这项研究中,我们观察到的差异表达循环microrna在CTEPH发病机制有重要的管理功能,如肺部血管的重塑、血管张力不平衡或炎症。其中许多被认为是参与CTEPH病因。然而,其中的一些已经彻底解释。监管的功能异常的microrna的签名的线索CTEPH发病机理的全面了解。基于这些在网上结果,我们选择性地关注let-7b研究其细胞功能相关的疾病,因为它的预测目标可能参与CTEPH发病机理。Let-7b据报道是一个anti-oncogenic microrna经常迷失在许多肿瘤[13],[42]。CTEPH初步相关分析与临床特点的病人,我们发现循环let-7b水平减少负面AVR的病人,这是通常被认为是与严重的肺血管重建。这种照明结果表明可能let-7b在肺血管生物学CTEPH发病机理。在进一步的机制研究中,我们发现let-7b可以目标ET-1 TGFBR1,据报道已CTEPH的发病机制密切相关。let-7b作对可能会上调ET-1 TGFBR1表达式,推广PAECs和PASMCs迁移。这些影响会导致肺血管床的持续收缩或重建,促进CTEPH发展。之间的正相关关系也发现let-7b和PAI-1或肺动脉栓塞,这被认为是提高血栓性疾病。因此,正相关关系没有直接表明CTEPH let-7b在凝固过程中所扮演的角色。的确切机制仍需进一步研究。

ET-1是一个强有力的endothelium-derived血管收缩剂[43]。主要由内皮细胞分泌,调节血管收缩和PASMCs扩散通过内皮素A和B受体[44],[45]。在CTEPH病人,增加ET-1临床特征有显著相关性[10]。此外,升高血清ET-1被证明是坏的预测肺动脉内膜切除手术的结果[46]。内皮素受体拮抗剂已成为治疗基石PAH超过10年了[47]。CTEPH患者,尤其是不能动手术的,贱民也血液动力学的好处[20]。ET-1表达式是一个复杂的生物学过程。在目前的研究中,我们展示了一个新的方面ET-1 microrna的表达调控在转录后水平。let-7b的下调是与海拔等离子ET-1水平,这可能是通过两种方式来实现的。首先,ET-1 let-7b的直接目标,实行去阻遏当let-7b衰减。第二,TGF-βET-1表达的是最有效的监管机构之一[48]。强烈增加ET-1 mRNA和蛋白表达在内皮,特别是,TGF-β诱导ET-1表达式优先通过TGFBR1 / Smad3途径[30],[49]。我们的研究结果表明,let-7b上调TGFBR1的表达下降,这反过来可能参与ET-1 CTEPH海拔高度的病人。此外,ET-1促有丝分裂的生长因子尤其是肺循环。伤口愈合实验,进一步说明脱抑制的ET-1 let-7b部分参与了PAECs迁移,和高架ET-1可能诱发PASMCs迁移。PAECs异常迁移和PASMCs进一步CTEPH患者的肺血管重建有关。

除了监管ET-1表达式,TGFBR1和下游信号肺血管的生物学中发挥了重要作用。野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型,TGFBR1肺中高度表达[11]。在孤立PASMCs PAH患者,TGFBR1被激活,与前导和抗凋亡的表现型[21]。在TGF-β1研究和相关受体外周血白细胞,TβRI / TβRII比例是多环芳烃的显著增加[50]。这些研究表明TGFBR1在肺动脉高压的激活状态,在这项研究中,我们提供了一个间接证据的潜在作用通过let-7b CTEPH TGFBR1。上调造成的TGFBR1 let-7b,尽管其他受体TGF-β通路,可能导致增生性血管疾病。在实验中,我们发现了一个现象,即使没有影响促进PASMCs迁移通过TGF-β或let-7b对手,他们的组合治疗明显促进了PASMCs的迁移。我们认为可能的原因是:首先,先前的研究表明,TGF-β双重角色在血管平滑肌细胞表型转换[51],[52]。它不仅诱导smc收缩表型分化,但也促进了smc去分化和诱导血管重建。所以我们认为这种现象可能是一个可能的性能下的正常PASMCs TGF-β治疗。第二,TGFBR1老年病已被报道与肺动脉高压有关[11],[21],[50],我们发现了TGFBR1 let-7b的直接目标。因此我们认为let-7b拮抗剂可能参与细胞迁移通过调节TGFBR1表达式。let-7b不是TGF-β本身的目标,let-7b拮抗剂独自没有诱导没有外生TGF-βPASMC迁移。在组合治疗let-7b拮抗剂和TGF-β的实行去阻遏TGFBR1 let-7b拮抗剂引起的被其配体TGF-β强调,它导致了异常迁移let-7b拮抗剂PASMCs中观察到。

还有一些限制在我们的研究中。首先,这些结果来自相对小的人口,和签名仍需验证和调整。第二,microrna现有等离子体在相对低浓度,一些低丰度microrna也许不能可靠地检测到芯片队列。这可能导致一些选择性偏差的microrna CTEPH的发病机制研究。然而,随着CTEPH是一种多病因疾病,不同来源的循环microrna的配置文件可能更便于理解疾病相比,依靠单一的概要文件从单一的病变组织或细胞。第三,监管,microrna发生在网络层。在这项研究中,我们选择了let-7b功能,但其他microrna与let-7b导致疾病和他们的沟通,尤其是对上游信号在CTEPH let-7b及其作用,仍然需要进一步的研究和评估。第四,我们之前研究的microrna PASMCs文化从肺的动脉内膜切除术组织还发现let-7d let-7家族的另一个成员,是减少和参与细胞增殖[9],这表明let-7家庭在CTEPH发病机理的重要性。一个假设的机制导致减少let-7家庭仍需要我们进一步的研究。我们也应该多注意其可能的针对未来的治疗效果。

我们最好的知识,这是第一次报告的循环CTEPH microrna的状况。这项研究的结果为我们提供了一些线索,进一步调查发病机理和临床生物标志物筛选候选人的其他疾病。

支持信息

图S1。

的重大目标路径的microrna签名。十七岁的候选人microrna在签名包含在目标预测和KEGG途径分析。定义的意义P< 0.05,体重(lg通路进行排名P)。(一个)重要targetgene相关通路CTEPH患者的microrna表达的上调。(B)重要targetgene相关通路CTEPH衰减microrna的病人。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.s001

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图S2。

前10%显著目标类别microrna的签名。十七岁的候选人microrna在签名包含在目标预测和分析。定义的意义P< 0.05,10%显著类别排名的重量(lgP)。(一个)前10%显著targetgene相关类别的差异microrna在CTEPH病人。(B)前10%显著targetgene相关通路抑制microrna CTEPH病人。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.s002

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图S3。

散点图的循环microrna的浓度CTEPH患者常见的临床特点。两个验证候选人microrna进行了分析,该指数显示有统计学意义。(一个)等离子体let-7b CI (n = 35)。(B)等离子体let-7b PAI-I (n = 19)。(C)等离子体let-7b对肺动脉栓塞(n = 37)。(D)等离子体miR-22总同型半胱氨酸(血浆总高半胱氨酸水平)(n = 28)。(E)等离子体miR-22 CI (n = 35)。(F)等离子体miR-22 PAI-I (n = 19)。(G)等离子体miR-22对肺动脉栓塞(n = 37)。(H)等离子体miR-22与c反应蛋白(n = 29)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.s003

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图S4。

通过ET-1 Let-7b监管PASMCs / PAECs迁移部分。两个验证候选人microrna进行了分析,该指数显示有统计学意义。(一个)转染PAECs治疗内皮素受体拮抗剂(η1海里)。埃塔可以抑制控制PAECs迁移,抑制作用被削弱let-7b拮抗剂(n = 5)。(B)正常和治疗引起let-7b PASMCs ET-1(1纳米)。ET-1迁移的细胞有明显的促进作用,并没有观察到不同的促进细胞间(n = 5)。P价值是由双向方差分析,计算和事后测试是由Student-Newman-Keuls方法。* * *P< 0.001。*P< 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.s004

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文件S1。

支持材料和方法和表。表S1,荧光记者试验中使用的引物序列。表S2,临床特点差异微阵列研究小组和验证。表S3, microrna的属性CTEPH患者和健康对照组差异表达的微阵列。表S4,诊断效果七17 microrna的签名的方法。表S5,文献综述的候选microrna的函数签名。表S6,循环miRNA级别之间的差异不同条件的临床特点。表S7 DIANA-miRPath let-7b十大有力的目标路径。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101055.s005

(医生)

确认

作者感谢江Dian-hua杜克大学医学院的教授,他这手稿准备的援助和技术支持工作。

作者的贡献

构思和设计实验:JW CW JC。进行了实验:LJG YHY JL LW JFL YW YL SG回龙观。分析了数据:LJG。该报写道:LJG JW连续波。主要修订手稿:JXJY。

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