数据
摘要
方法
我们研究了10名COPD吸烟者和10名肺功能正常的吸烟者对吸烟暴露的系统性生物标志物和白细胞转录组反应(Affymetrix微阵列)。我们还研究了10名健康的从不吸烟者(不接触吸烟)作为对照。由于COPD的某些方面在男性和女性中可能不同，并且男性和女性对其他应激源(感染)的炎症反应可能不同，我们按性别对参与者进行了分层招募。差异表达基因经q-PCR验证。评估本体丰富度，推断交互网络。
引用:Faner R, Gonzalez N, Cruz T, Kalko SG, Agustí A(2014)吸烟对慢性阻塞性肺疾病的全身炎症反应:性别效应的证据。PLoS ONE 9(5): e97491。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097491
编辑器:Mehrdad Arjomandi，美国加州大学旧金山分校
收到:2014年1月27日;接受:2014年4月18日;发表:2014年5月15日
版权:©2014 Faner et al。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议它允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是要注明原作者和出处。
资助:Mutua部分支持Madrileña PI041966/2012, Fundació加泰罗尼亚肺炎(Fucap)-Beca Esteve 2011，卡洛斯三世Salud Carlos iii -卫生调查fondo (FIS) 10/00523, SEPAR 133/2011。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。
简介
吸烟是慢性阻塞性肺病(COPD)的主要危险因素[1]．然而，只有一部分吸烟者，即所谓的“易感吸烟者”，会患上这种疾病[２]．每个吸烟者的遗传和表观遗传背景可能会调节他/她对吸烟的炎症反应的类型和强度[1]，[3]- - - - - -[5]．在“易感吸烟者”中，这种反应被认为是“增强的”，无论是在肺部［6］在体循环中[7]，并被认为会导致疾病恶化[1]，［6］．然而，尽管这一概念被广泛接受[1]在美国，尚未有研究实际研究易感吸烟者(即COPD患者)和耐药吸烟者(即肺活量正常的吸烟者)对吸烟的“反应”(即吸烟前后发生的特定炎症变化)。相反，现有的证据比较了这两组吸烟者“在”吸烟多年后的一些炎症标志物［6］．
为了解决这一知识差距，我们比较了易感(COPD患者)和抵抗吸烟者吸烟前后的一些系统性炎症生物标志物和循环白细胞转录组。我们假设，在这两组吸烟者中，吸烟暴露会在细胞、蛋白质和/或转录组水平上诱导不同的炎症特征。重要的是，因为之前的几份报告表明，COPD的自然史可能存在显著的性别差异[8]- - - - - -[10]一些实验观察表明，男性和女性对其他急性应激源(感染)的白细胞转录反应是不同的[11]，我们招募了性别分层的参与者。
方法
数据S1对所使用的方法进行了扩展说明。
设计、参与者和伦理
在这项前瞻性对照研究中，我们纳入了30名志愿者，按吸烟史、COPD病史进行分层[12]和性。所有COPD患者临床稳定。巴塞罗那医院诊所伦理委员会批准了研究方案，所有参与者签署了知情同意书。
急性吸烟暴露试验(ASET)
目前的吸烟者被要求在ASET前至少8小时内不吸烟。测量呼出一氧化碳浓度(SC01-STK, CO SmokeCheck Monitor, Care Fusion, San Diego, US)以确认戒烟。所有参与者都禁食了一整晚。根据之前对健康受试者的研究，在周围静脉中插入导管[13]，[14]，吸烟者被要求在一名调查员的直接监督下，在30分钟内吸2支香烟(诺贝尔焦油含量9毫克，尼古丁0.7毫克，一氧化碳9毫克，阿尔塔迪斯S.A.西班牙)。分别于吸烟前(T0)、吸烟后30 (T30)和吸烟后180分钟(T180)取静脉血。在400 g×6分钟离心后，血浆和淡黄色涂层立即分离。血浆储存在−70°C直到分析。将红细胞裂解，白细胞清洗，在RLT缓冲液中裂解，并在−70°C保存，以便稍后提取RNA。在测试期间，参与者保持休息状态。
测量
循环炎症标志物。
总白细胞计数用ADVIA-2120系统(西门子，德国)进行量化。采用超灵敏定量浊度法测定血浆c反应蛋白(CRP)浓度(拜耳诊断公司，德国)，采用高灵敏ELISA法测定白细胞介素(IL)-6 (IL-6)和IL-8 (Invitrogen公司，美国)。用Rapid Point 500血气系统(西门子，德国)测定血液碳氧血红蛋白水平。
数据分析
qPCR和全身性生物标志物结果根据情况总结为均数±标准差、比例或范围。采用非配对试验(Mann-Whitney, Kruskal-Wallis)比较各组间临床变量。采用配对检验(Wilcoxon)比较各组T0和T180结果。
用Rank Prod分析差异基因表达[18]；FDR(假发现率)值<0.05的探针集被认为是显著的。主成分分析(PartekH Pro)用于研究转录的视觉全局效应。大卫(www.david.abcc.ncifcrf.gov）[19]，[20]用于估计基因本体生物过程数据库中重要基因的功能过度表示(www.geneontology.org)。使用匠心路径分析(IPA)构建交互网络，www.ingenuity.com)基于匠心路径知识库(IPKB)[21]．Cytoscape (www.cytoscape.org)对相关结果进行分析并图形化显示[22]，[23]．
结果
参与者的特征
研究对象在性别、吸烟史及肺功能等方面均有差异(表1)。注意:(1) COPD患者和肺功能正常的吸烟者年龄相似;（2) COPD患者的气流受限程度从中度到重度不等。尽管男性和女性COPD患者的情况相似，但后者年龄较大(p = 0.02)，而且往往吸烟较少(p = 0.07);和(3.男性COPD患者的累积吸烟暴露水平高于男性对照组(p = 0.01)，但在女性中未观察到这一情况。
对吸烟的生物标志物反应
基线时，非吸烟者(NS)的碳氧血红蛋白水平低于肺功能正常(S)或COPD的吸烟者(p<0.001)，吸烟30分钟后碳氧血红蛋白水平进一步升高(p<0.001)。图1(图A)。COPD患者T0时循环白细胞计数高于对照组(p = 0.02)，任何组在T180时循环白细胞计数均无变化(图1，面板B);同样，我们没有观察到吸烟后循环中性粒细胞、淋巴细胞(CD3+)、CD4+ T细胞、CD8+ T、CD19+ B细胞或NK细胞群有任何显著变化(数据未显示)。平均CRP (图2，面板C)和IL-6水平(图1D)均在正常范围内[7]在所有组别和时间点。所有参与者在吸烟前和吸烟后的IL-8值均低于下限检出限(数据未显示)。最后，无论是吸烟前还是吸烟后，我们都没有观察到这些生物标志物的显著性别差异。
(T30)或180分钟后(T180)。有关进一步解释，请参阅文本。
板一个:对各组(COPD患者、吸烟者(S)和非吸烟者(NS))在基线(T0)时表达值变异性最大的基因进行主成分分析(PCA)。由于观察到了性别效应，进一步的分析按性别分层(右列和左列)。)面板B1(女性)及B2(男性)展示三组研究参与者从T0到T180的差异表达(DE)基因的数量。红色和绿色数字分别表示上调和下调。面板C1(女性)及C2(男性)显示BioVenn图(www.cmbi.ru.nl cdd / biovenn)与COPD、S和NS对照组之间共享的DE基因数量。有关进一步解释，请参阅文本。
吸烟对白细胞转录组的反应
主成分分析(PCA)允许可视化多维数据集中的差异。这里，基线时在所有实验组(COPD, S和NS)中表现出最大变异性的那些基因的表达值的PCA显示了白细胞转录组轮廓按性别的明显分离(图2因此，如前所述，进一步按性别进行统计差异分析[24]．图2(图B1和B2)显示了在NS、S和COPD中按性别分层的T0和T180之间差异表达(DE)基因的数量(红色和绿色数字分别表示DE升高或下降)(表S1给出DE基因的完整列表)。总体而言，转录组变化强度中等(对数比范围在0.95至0.4之间)。COPD中DE基因的无监督聚类充分分离了女性(n = 57)和男性(n = 110)中的T0和T180样本(图S1(分别为A组和B组)，表明本文使用的Rank Prod统计分析确定了与急性吸烟暴露相关的明确基因特征。
COPD与吸烟相关基因的鉴定。
BioVenn图表图2显示女性(图C1)和男性(图C2)中从T0到T180组(NS, S和COPD)之间共享(或不共享)的DE基因数量。考虑到NS不吸烟，该组中从T0到T180的DE基因(女性36例，男性63例)被认为代表了时间依赖性变化，因此被排除在任何进一步研究S或COPD对吸烟反应的分析之外。同样地，我们在操作上认为，只有在COPD患者中，DE对吸烟有反应的基因代表慢性阻塞性肺病相关基因，而这些基因DE对吸烟的反应仅在正常肺功能的吸烟者代表吸烟相关基因．据此，我们在女性中鉴定出29个COPD相关基因(男性78个)，在女性中鉴定出61个吸烟基因(男性16个)(图2、面板C1及C2)。表2按吸烟后对数比、变化方向和性别排序，列出前10位易感基因和耐药基因。
此外，我们还调查了不同组(S vs. COPD)和/或性别(男性vs.女性)之间基因表达的基线差异是否会影响对吸烟的转录反应。结果在数据S1(和表S2而且S3)，但总的来说，基线DE与吸烟的转录组反应只有轻微的相关性。
COPD和吸烟相关基因男性和女性共有。
我们确定了男性和女性共有的5个COPD相关基因:(1WIPF1(平均对数比=−0.479)，是免疫突触形成和T细胞激活的重要调节因子[25]；（2) BCL2A1(平均对数比=−0.538)，可调节p53肿瘤抑制诱导的凋亡[26]；（3.) SGK1(平均对数比= - 0.512)，其上调参与高血压、肥胖、糖尿病、血栓形成、中风、纤维化疾病、不孕症和肿瘤生长，其抑制介导骨骼肌稳态和功能[27]；（4) ZNF397(平均对数比= 0.551)，被认为在着丝粒形成和基因转录中起作用[28]；最后，(5CLK1(平均对数比= 0.589)，缺氧诱导的另一种剪接因子[29]．
同样，我们发现了男性和女性共有的两个吸烟相关基因:POU2AF1(对数比= - 0.40)，这是一种负责免疫球蛋白转录调节的核因子[30]和XYLT1(对数比= 0.45)，它是GAG生物合成的初始酶，与组织重塑有关[31]．
COPD与吸烟相关基因的相关基因本体论
我们用了DAVID[19]，[20]鉴定与上述发现的COPD易感性和耐药基因相关的富集基因本体(% FDR<25)。在女性中，本体论丰富COPD相关基因(n = 29)包括大部分下调的基因(表3)。值得注意的是，MLL5、JUN和FOS涉及到大多数本体。已知FOS和JUN二聚形成转录因子复合物AP-1, AP-1在多种生物过程的调控中起关键作用[32]．与此同时，我们观察到丰富的本体论包括转录控制的调控、核酸代谢和生物合成过程(表3)以及与免疫系统相关的本体论，如SMAD信号和对细胞外刺激的反应。另一方面，本体论丰富了吸烟相关基因在女性(n = 61)中包括上调和下调的基因，与免疫系统、细胞周期、细胞生长、凋亡和细胞运动相关(表4)。前者包括参与T细胞激活(ETS1和TNFSF14)和抗原提呈控制(CYBB和CST7)的基因。
另一方面，在男性中COPD相关基因(n = 78)与免疫系统、细胞运动和细胞激活本体相关(表5)。有趣的是，其中一些本体论与女性的本体论相似吸烟相关本体，但是使用相反的DE符号(向上和向下调节)。例如，如图所示表5在男性COPD患者中，参与细胞迁移的基因主要在吸烟时被激活，而在肺功能正常的女性S中则主要被抑制。的本体丰富分析吸烟相关基因在男性中，由于识别的基因数量较少(n = 16)，未能获得显著的术语(图2，面板C2)。
COPD与吸烟相关基因的表达相关网络
我们使用Cytoscape(插件，Expression Correlation和Bingo)[22]探讨慢性阻塞性肺病的表达是否与吸烟相关上述基因是相关的(Pearson r≥0.8)，并形成具有协调功能的网络。我们发现，在女性中，COPD相关基因确实形成了几个不同规模的相关网络(图3其中一些包含了形成功能核心的基因(箭头)，因为它们属于相同的本体。例如，MLL5、JUN和FOS定义了一个(被抑制的)基因的功能核心(Panel a)，它们属于三个本体:GO60395 (SMAD蛋白信号转导，p值= 0.0001)、GO6306 (DNA甲基化，p值= 0.0003)和GO6305 (DNA烷基化，p值= 0.0003)。另一方面，PAFAH1B1、ELMOD2和RABEP1构成了参与GO16044(细胞膜组织，p = 0.001)的上调易感基因的功能核心(B图)。总的来说，这些结果证实、扩展和支持了我们之前使用DAVID的分析。图4描述的相关网络吸烟相关基因在女性。鉴定出两个下调的网络，包含与GO44237细胞代谢过程(p = 0.015)和GO42221对化学刺激反应(p = 0.0005)等相关的本体。我们发现了一个巨大的正相关网络，包括GO7275多细胞生物发育(p = 0.0039)和GO50794细胞过程调控(p = 0.006)等几个本体。
红色和绿色分别表示表达上调和下调。箭头指向在网络中识别的形成功能簇的基因。有关进一步解释，请参阅文本。
箭头表示网络中通过基因本体分析识别的基因。红色和绿色分别表示上调和下调。有关进一步解释，请参阅文本。
在男性,COPD相关基因形式(图3):(1)属于“化学刺激反应”(GO42221, p = 0.001)的抑制基因的功能核心(箭头，C图);, (2)与GO2376(免疫系统过程，p = 0.007)和GO30097(造血系统，p = 0.0002)相关的上调基因簇(箭头)(图D)。网络分析吸烟在男性中是不可能的，因为所识别的基因数量较少(n = 16)。
COPD与吸烟相关基因的相互作用网络分析
的相互作用网络慢性阻塞性肺病而且吸烟相关我们使用了匠心路径分析(IPA)，这是一个已知分子相互作用的数据库[21]．在女性中，有61人吸烟基因(图2，面板C1) IPA确定了一个显著网络(IPA p-score 55) (图5(A)，其主要功能术语包括有机体损伤与异常、细胞死亡与存活和细胞形态。我们选择了ETS基因作为该网络的中心枢纽，通过实时PCR (qPCR)进行独立验证;后者证实了观察到的微阵列转录变化(图S2)。同样，从29慢性阻塞性肺病相关在女性身上发现的基因(图2，图C1)， IPA鉴定了一个富集于细胞死亡和存活、脂质代谢和小分子生物化学功能的网络(p-评分43)(图5在该网络中，我们选择FOS和CXCL1进行独立qPCR验证;结果(图S2)证实CXCL1 (p = 0.01)和FOS (p = 0.07)均有变化。
有关进一步解释，请参阅文本。
低数量的吸烟在男性中发现的基因(n = 16)不能在IPA分析中获得显著的网络。相比之下，从78慢性阻塞性肺病相关在男性中发现的基因(图2，面板C2)， IPA确定了两个大型网络。第一项(IPA p-score 45)以感染性疾病、细胞功能与维持、血液系统发育和功能为主要功能项(图5第二组(p-score 43)包括DNA复制、重组、细胞周期和细胞形态学术语(图5， D)。从这两个网络中，我们分别选择已知参与细胞激活、细胞迁移和细胞凋亡的HLX、TRIB1和BIRC3进行qPCR验证(图S2)。
讨论
尽管如此，吸烟引起的异常炎症反应被认为是COPD的主要致病因素[1]据我们所知，这是第一个直接比较易感(即COPD患者)和抵抗吸烟者(即肺活量正常的患者)对急性吸烟暴露的系统性生物标志物和转录组白细胞反应的研究。通过这样做，我们的结果提供了一些新颖的和潜在相关的观察。首先，我们在男性和女性中发现了不同的转录组模式，无论是在基线还是对吸烟的反应中，其影响超出了COPD，如下所述。其次，我们确定了一些COPD与吸烟相关男性和女性的基因(签名)，我们确定了它们丰富的本体论和基因相互作用网络。然而，由于研究对象数量相对较少，需要在独立和更大的COPD患者和吸烟者群体中进行重复性研究。
先前的研究
先前的几项研究调查了健康受试者急性吸烟暴露的生物学反应[13]，[14]．事实上，我们设计了ASET的剂量和时间方法)主要是基于这些以前的经验。然而，据我们所知，此前没有研究直接对比了患有或不患有COPD的吸烟者循环白细胞对ASET的转录组反应。巴尔等[33]比较了COPD患者和非吸烟者对照组的基底白细胞转录组模式，没有让受试者吸烟或考虑潜在的性别差异。在我们的研究中，在基线时，我们鉴定了19个同样被Bahr鉴定的DE基因等[33](C19orf59, ARHGAP18, C11orf75, CARD16, CLEC4D, fai3, FCRL3, GYG1, GZMM, HOPX, MAL, MAPK14, MCTP1, NELL2, RPS23, SAT1, SLC8A1, SNHG8, SPON2)。值得注意的是，MLL5, JUN, RABEP1和ZFAND6在我们的研究中被确定为慢性阻塞性肺病相关也被巴塔查里亚鉴定出来等[34]作为COPD相关基因
研究结果的解释
急性吸烟暴露后白细胞转录组变化相对较低。如果这是在COPD的自然史范围内，这可能并不令人惊讶，COPD需要数十年的吸烟暴露才能发展。与此一致的是，此前COPD的外周血转录组研究也报告了小的折叠变化差异[33]，[34]．
事实上，我们的研究涉及对患有和没有慢性阻塞性肺病的吸烟者进行干预(ASET)，包括从不吸烟者(他们作为与时间相关的生物学效应的对照组)，我们按性别对参与者进行分层，这证明是实验设计的关键方面，对识别差异至关重要慢性阻塞性肺病而且吸烟相关男性和女性吸烟者的特征。在男性中COPD相关特征包括与免疫系统(上调)和细胞运动(上调)相关的本体论，而只有少数基因(限制了本体论富集分析)相关吸烟．相比之下，在女性中吸烟签名包括与标识为的本体相似(但方向相反)的本体慢性阻塞性肺病相关在男性中，那是他们的慢性阻塞性肺病相关特征包括MLL5、FOS和JUN基因下调，这些基因均参与炎症反应。总的来说，这些观察结果表明女性对吸烟的炎症反应有更严格的控制。
白细胞转录组中的这些性别差异如何转化为临床尚不明确，但长期以来，人们已经认识到COPD中的一些临床相关性别差异[8]- - - - - -[10]．例如，我们小组之前的研究表明，男性肺功能随着年龄的增长而下降的程度明显高于女性，无论是健康的从不吸烟者还是患有COPD的吸烟者[35]．这里提出的男性和女性炎症反应的不同调节可能有助于这些观察。事实上，有趣的是，在本讨论的背景下，女性COPD患者(相对于男性)全身炎症生物标志物水平出现降低[36]．
这些观察结果与其他常见吸烟相关疾病的相关性，如心血管疾病[37]- - - - - -[39]或者肺癌[40]- - - - - -[42]，值得进一步调查。事实上，最近的出版物也支持在其他免疫相关疾病(如多发性硬化症)中存在类似的性别差异[43]自身免疫性疾病在女性中尤其普遍，这一点已得到证实[44]．因此，总而言之，这些观察结果需要仔细探索和重新分析现有的按性别划分的COPD遗传数据。
最后，我们使用了几种网络分析技术来推断被识别的对象之间潜在的相互作用COPD与吸烟相关基因，从而进一步了解疾病的病理生物学。表达相关网络结合基因本体识别差异表达基因的功能核心。IPA鉴定的差异表达基因之间可能的相互作用网络(基于已知的分子相互作用)显示了良好的IPA p-评分，并通过qPCR验证了其主要基因中枢的变化。在女性中，抗性基因网络包括与Gpcr信号(SIPR5、GPR56)、炎症和Th1反应(ETS-1、MMP9、TBX21)、凋亡(BCL2)和烟草中存在的平面芳香烃(AHR)感测相关的基因，而其敏感基因网络的主要枢纽包括对JUN和FOS的抑制，这两者也通过形成AP转录因子参与免疫反应的调节。因此，总的来说，这些观察结果再次表明，在患有或不患有COPD的女性中，免疫过程的调节存在差异。另一方面，在男性中，我们发现了两种慢性阻塞性肺病相关分别构建了平面芳香烃应答(hub基因AHR)和免疫应答(hub基因RORA)的基因网络，以及Gpcr信号通路、泛素化(TRIB1、RAD23B、USP-15)和凋亡自噬(BIRC3、TRIM13、TRIM23)的基因网络，并通过qPCR验证。有趣的是，其他研究报告了COPD中这些过程的一些改变[45]- - - - - -[47]．
优势与局限
我们的研究有优势也有局限。事实上，尽管人们普遍认为COPD的特征是对吸烟的异常反应，但这是第一个专门在转录水平上调查这种可能性的研究，这是一个明显的优势。同样，主动实验干预(ASET)的使用也超越了标准的转录组病例对照研究[48]事实上也促进了小说的鉴定COPD与吸烟相关基因对急性烟草暴露的反应。最后，网络分析的使用已经允许描述COPD患者和吸烟者对吸烟的全身炎症反应的明显性别差异，这一观察可能对其他吸烟相关疾病的COPD以外的疾病有影响。在其局限性中，我们承认ASET后的转录组变化仅在循环白细胞中测量，因此肺实质的变化可能在类型和/或强度上有所不同;不用说，在吸烟前后获取肺组织样本的伦理和后勤困难是臭名昭著的。最后，我们在研究中纳入了30名志愿者，但当按疾病、吸烟状况和性别进行分层时，每个亚组只包括5人。由于研究对象数量相对较少，结果需要在独立和更大的COPD患者队列中复制。
支持信息
图S1。
COPD DE基因的无监督聚类充分分离了女性(n = 57)和男性(n = 110)的T0和T180样本(分别为A组和B组)。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097491.s001
(TIFF)
图S2。
qPCR验证阵列结果，RQ =目的基因mRNA相对于Actin mRNA的相对定量，采用比较CT法计算。选择IPA网络中的中心枢纽基因进行验证;a) COPD男性(HLX, TRIB1和BIRC3)， b)健康吸烟者女性(ETS 1)和c) COPD女性(CXCL1和FOS1)。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097491.s002
(TIFF)
表S1。
COPD患者、吸烟者(S)和非吸烟者(NS)中按性别分层的差异表达基因(DE)的完整列表。基因ID, affymetrix探针ID，对数比和FDR。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097491.s003
(多克斯)
表S2。
COPD患者和吸烟者基线差异表达基因前10位，按性别分层。基因ID, affymetrix探针ID，对数比和FDR。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097491.s004
(多克斯)
表S3。
COPD患者和健康吸烟者中由于性别差异导致的基线前10个差异表达基因。基因ID, affymetrix探针ID，对数比和FDR。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097491.s005
(多克斯)
致谢
作者感谢所有参与研究的志愿者，感谢他们愿意为医学研究做出贡献，感谢Gemma Sunyer女士在研究期间提供的出色技术支持。来自我们医院呼吸科的Sellares, Soler和Ballester，感谢他们帮助招募COPD患者，以及资助这项研究的不同机构。这项工作是在西班牙巴塞罗那的塞莱克斯中心(Biomèdica Cellex)开发的。Affymetrix阵列在IDIBAPS的Genomics平台上进行。
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