数据
文摘
背景
多个独立的文化研究已经确定的存在铜绿假单胞菌呼吸道样本作为一个积极的闭塞性细支气管炎综合征(BOS)的危险因素。然而,文化无关微生物技术已经确定了一个负面的关联假单胞菌物种和BOS。我们的目的是调查是否可能有一个统一的解释显然二分结果。
方法
我们进行支气管镜检查和支气管肺泡灌洗(BAL)在肺移植受者(46过程33例)和26个非移植对照组。我们分析了细菌社区BAL流体使用qPCR和焦磷酸测序的16 s rRNA与临床基因扩增子和比较文化无关的数据元数据从这些学科和文化的结果。
引用:Dickson RP, Erb-Downward JR,弗里曼厘米,沃克N, BS,贝克JM, et al。(2014)肺移植后肺微生物的变化包括两个不同的假单胞菌的物种的出现有明显临床关联。《公共科学图书馆•综合》9 (5):e97214。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097214
编辑器:伊恩·c·戴维斯,俄亥俄州立大学,美国
收到:2014年1月2日;接受:2014年4月16日;发表:2014年5月15日
版权:©2014年迪克森等。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:资金由美国国立卫生研究院的资助T32HL00774921 (RPD) U01HL098961 (JMB, JLC (ghb) R01HL094622 (VNL) R01HL114447 (ghb FJM) T32AI007528 (BSS)和生物医学实验室和临床科学研究与发展服务,退伍军人事务部(CMF JMB, JLC)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
近年来,小说文化无关微生物鉴定技术允许的分析整个细菌社区内各种疾病患者的航空公司[1]- - - - - -[4]。肺移植是唯一的治疗选择许多终末期肺部疾病[5]。微生物感染和殖民与发病率和死亡率的增加有关肺移植受者由于肺炎或闭塞性细支气管炎综合征(BOS)[5]- - - - - -[8]。肺移植和免疫抑制疗法需要导致众多改变宿主防御可能改变呼吸道的微生物群[9],[10]。在最近的一项研究中使用文化无关技术对肺移植受者,维尔纳等人观察到负的丰度之间的联系假单胞菌物种(spp)。和BOS的诊断[11],一个令人惊讶的结果考虑到众多独立研究的检测证明铜绿假单胞菌在呼吸文化中是一个积极的BOS的后续发展的危险因素[6],[12],[13]。此外,移植后肺微生物有矛盾的研究对于移植对微生物多样性的影响,一项报告发现增加多样性相比,控制[14]和另一个报告多样性下降[15]。这些相互矛盾的结果的来源,以及移植后的临床意义和相关的临床因素微生物多样性,仍未确定。
在这项研究中,我们旨在解决这些矛盾的结果通过文化无关的识别微生物群落在BAL样本来自肺移植受者,分层的临床参数和非移植对照组。我们推测,移植后肺微生物会不同于移植对照组)进行的,符合这两个报告,将包含多个著名的物种假单胞菌这将与移植的健康。我们还假设的多样性在移植受者移植后肺微生物群不会统一,与临床上重要的参数。
方法
道德声明
所有临床调查根据表达的原则进行了《赫尔辛基宣言》。研究机构审查委员会批准的协议是密歇根大学的医疗体系和安阿伯市退伍军人医疗保健系统。所有的病人提供书面知情同意。协议和认证的机构审查委员会审查,“合理的风险与利益主体和知识。研究的风险已经尽可能最小化。”
样品采集和处理
患者接受有意识的镇静和喷雾利多卡因。支气管镜是通过嘴巴或鼻子,通过先进的声带。短暂气道考试后,支气管镜在右侧中部叶楔形或海豆芽的同种异体移植物(监测支气管镜检查),或者在有症状的患者可用成像,在段最影像学异常的证据。非移植对照组,支气管镜是正确的中部叶和海豆芽。落下帷幕进行滴注法的120至300毫升无菌等渗盐水。样本存储在冰,离心机在13000 RPM 30分钟(Hermle Z 231微型离心机)dolphin-nosed埃普多夫管和储存在−80°C直到DNA的提取。所有样品从移植获得受试者由密歇根大学微生物实验室处理常规微生物分析(细菌、真菌和空军基地文化)。细菌培养,BAL镀液体巧克力,羊血和MacConkey琼脂板和孵化≥72小时。细菌被确定和报告如果他们增长超过104每毫升集落形成单位(CFU),或者如果在104CFU /毫升,但一个革兰氏阴性杆菌物种和唯一可报告的病原体。
DNA隔离
基因组DNA提取360年从BAL丸resuspendedµl ATL缓冲区(试剂盒DNeasy血液和组织工具包)和均质超净粪便DNA珠管(MO-BIO,卡尔斯巴德,CA)使用修改后的协议之前隔离细菌的DNA进行验证[19]。
定量聚合酶链反应(qPCR)
量化的细菌16 s rDNA是由实时PCR运用罗氏480 LightCycler TaqMan水解探针。退化细菌16 s rDNA特定引物是针对16 s rDNA v2 v1区域的基因使用以下序列:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(向前);5′-CTGCTGCCTYCCGTA-3′(反向);(5′-FAM-TA + ACA + CATG + CA + AGTC + GA - BHQ1-3′(探测器)。[20]- - - - - -[22]。引物的探测开发BSR65/17着陆地点使用下列顺序:5′-TCGACTTGCATGTRTTA-3′。16 s克隆是从一个嗜血杆菌物种用于生成标准曲线。最初的变性后五分钟在95°C, 40放大进行周期:30秒94°C, 30秒50°C和30秒在72°C。最后一个伸长一步是在72°C。
454焦磷酸测序
的V3-V5细菌的变异度高的区域16 s rRNA基因测序V5-V3方向使用条形码底漆集对应于357 f - 926 r[23]。这些条形码引物最初Broad研究所开发的。主要PCR循环条件95°C两分钟,其次是20周期的降落PCR (95°C 20秒,随后的退火30秒开始60°C和降低1度每两周期直到50°C,和72°C的伸长45秒),然后20周期标准的PCR (95°C 20秒钟,50°C 30秒,和45秒72°C),并与72°C 5分钟完成。质量控制和排序进行了密歇根大学,使用罗氏454 GS初级根据建立协议[24]。Pre-procedure支气管镜冲洗控制,试剂水控制和模拟分析了社区标准测序作为质量控制运行。
数据分析
序列数据进行了处理和分析使用软件mothur v.1.27.0根据454年的标准操作程序序列数据(http://www.mothur.org使用最小的序列长度为250完全)[25]。共享文件和一个社区phylotyped (genus-level分组)文件是使用操作生成分类单位97%(辣子鸡)封存在身份使用dist.seqs生成,集群,。共享和分类。在mothur otu命令。没有进行二次抽样和所有后续的系统发育分析r .大量细菌的DNA检测试剂水控制小相对于BAL和模拟社区标本(下面讨论的结果)。辣子鸡检测试剂水控制从所有BAL标本分析前删除。OTU数字任意分配在装箱过程中,被称为整个手稿在协会指定级别的分类。
这些文件,这些文件包含的分类信息辣子鸡,进口,并进一步分析了在R使用R-package素食2.0 4多样性分析和圣职、R和一个自定义的脚本进行排序分类结果表。辣子鸡进行分类使用的mothur实现核糖体数据库项目(RDP)分类器和RDP分类训练集9 (= trainset9_032012.pds fasta参考。fasta分类法参考= trainset9_032012.pds.tax),可用mothur网站。平均1476±703得到了高质量的阅读/ BAL标本。1109独特的辣子鸡被确定在所有的标本。相对丰富和分类分析,样本归一化的百分比总读和我们限制分析辣子鸡,出席大于样本人口的1%;辣子鸡都包含在多样性分析。序列在网上都可以查阅,NIH序列读取存档(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra,加入编号2419687 - 2419764)。
Microbe-Specific PCR
选择BAL标本通过使用microbe-specific PCR引物进行了分析。铜绿假单胞菌有针对性的引物是PA-SS-F (5′-GGG GGA TCT TCG广汽CTC a - 3′,地点:189 - 206)和PA-SS-R(5′太极拳TTA GAG TGC CCA CCC三大′,地点:1124 - 1144)[26]。这些引物是针对16 s rDNA变量地区特有的签名序列2和8和验证在我们实验室对众多假单胞菌物种。对于这些引物,最初的变性步骤是在95 C 10分钟,其次是25 94 C周期20秒钟,58 C 20秒和72 C为40秒,最终扩展步骤在72 C的一分钟。荧光假单胞菌有针对性的引物是16 spsefluf (5′tgc ATT CAA AAC TGA CTG-3′,地点:493 - 510)和16个sps (5′aat CAC ACC GTG GTA ACC三大′,地点:1323 - 1338)[27]。对于这些引物,最初的变性步骤是在95 C 10分钟,其次是5周期为45秒94 C, 55 C 1分钟和72 C为2分钟。其次是35周期为45秒92 C, 60 C 45秒,72 C 2分钟和最后一个扩展步骤72 C 2分钟。最后冷却进行了4 C。
系统发育树的一代
细菌基因组被上传到DNASTAR SeqBuilder (Lasergene)。序列对应的V3-V5地区16 s rRNA每个基因组基因是一致的。fasta-format文档包含V3-V5序列是上传到MAFFT v。7,一个在线多重序列比对程序(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)[28]。关于树构建算法可以找到的细节http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/algorithms/algorithms.html。序列比对后,引导和1000 re-sample迭代执行之前执行一代最后的系统发育树。
统计分析
统计分析使用棱镜5 (GraphPad软件)方差分析、t检验和回归分析,和素食和R多样性、丰度和分类分析。ANOVA-like排列测试约束圣职、冗余分析(RDA)和典范对应分析(CCA),使用方差分析进行。cca R的函数包素食。显著差异在社区成员发现通过限制任命被证实使用PERMANOVA(置换多元方差分析)通过阿多尼斯功能的素食主义者。
研究人群
46支气管镜检进行33肺移植受者(表1)。6个病人接受两个支气管镜检查,两个经历了三个和一个病人经历了四个;剩下的24例接受支气管镜检查。46的标本,两人最少16 s细菌DNA信号和被排除在随后的多样性,任命,和rank-abundance分析,但包括在相对16 s rDNA qPCR比较。
26非移植对照组26日进行支气管镜检查,所有没有肺部疾病史(表2)。所有26个样本包含在所有分析。
为了分析,移植被认为是无症状的,如果支气管镜检查是执行计划监测支气管镜检查(执行例行密歇根大学的移植在六个星期后,三个月,六个月和12个月),病人没有急性咳嗽的投诉,呼吸困难,发热或增加痰生产和不接受新欣赏支气管镜检查的影像学渗透或肺功能下降。
病人的人口统计
移植受者大多数是男性,经历了两国肺移植(1)。最常见的移植前诊断肺纤维化,其次是囊性纤维化(CF)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。大部分支气管镜检查(67%)在一年内进行移植。
相比在支气管镜检查的时候,病人无症状患者症状更可能是女性和BOS史(p < 0.05,表1)。有症状和无症状的病人关于移植以来没有显著差异或移植前诊断(p > 0.05,表1)。更高分数的症状受试者近期抗生素暴露和积极BAL细菌培养(包括假单胞菌和其他),尽管这些不符合统计学意义(p > 0.05,表1,表3)。最常用的类抗生素氟喹诺酮类原料药、四环素、大环内酯类。只有三个学科获得喷雾妥布霉素落下帷幕前的时间。没有明显的差异之间的免疫抑制有症状和无症状的科目。
结果
落下帷幕的肺移植受者包含不同的细菌微生物群与非移植对照组
样本中细菌含量的各种组由量化16 s rRNA基因拷贝数在5毫升的未落下帷幕。的细菌DNA检测在pre-procedure支气管镜冲洗达到或接近检测极限(图1)。在健康、不吸烟的人(非移植控制),细菌球的数量明显高于pre-procedure控制样本。最重要的是,BAL标本中细菌含量肺移植受者均明显高于健康对照组(图1)。平均有15倍更多的细菌BAL标本移植受者比从移植对照组)进行了比较,与一些样品高1000倍(图1)。没有显著差异细菌16 s rRNA基因水平有症状和无症状的移植受者之间。因此,球从肺移植受者包含更多的细菌比非移植对照组。
副本的数量的细菌16 s rRNA每5基因的多个对比测试。
因为执行的移植患者支气管镜检查都通过鼻子和嘴巴,含有不同的微生物群,鉴于上呼吸道BAL标本污染的可能性,我们问支气管镜插入路线是否与BAL微生物群的差异有关。绝大多数(61%)的支气管镜检查进行移植受试者执行通过鼻腔插入支气管镜;其余通过口服途径进行。我们使用数据可视化技术的主成分分析(PCA)来比较这些标本的细菌社区团体。我们发现没有空间BAL标本分离获得通过鼻子和那些获得通过口(图2)。两个样品组没有统计学上不同的测试通过ANOVA-like排列测试时约束分类(包括冗余分析(RDA)和典范对应分析(CCA))或通过阿多尼斯(PERMANOVA)函数在纯素食(p = 0.90)。因此路线支气管镜插入对BAL微生物群没有明显的影响,反对通过上呼吸道微生物群重大污染。
无监督主成分分析(PCA)标记插入支气管镜的路线。组不同测试使用方差分析排列测试插入的任命受到路线。
我们的下一个目标是比较球移植对象之间的微生物群的构成和移植对照组)进行了比较,以及有症状和无症状的接受者之间。使用一个无约束所有样本的主成分分析(图3一),我们观察到的空间分离三个预先确定主题组(移植对照组)进行了比较,无症状的移植和移植受者症状),虽然位置内的每个组的成员任命是异构的。这种分离的标本由学科组明显时每组的重心是策划(图3 b),这意味着每组的集体微生物群的差异相比。测试这些结果的统计学意义,我们执行ANOVA-like排列测试约束祝圣礼,由RDA和CCA。RDA表明显著不同的微生物群落与每个主题的相关组织(控制,症状或无症状的接受者)(p < 0.005,图3 c)。这对移植前诊断意义保存时控制,移植时,残以来bronschoscopy (p < 0.005),并证实了使用阿多尼斯(PERMANOVA)函数在素食者(p < 0.005)和相应的多变量分析。当受到临床参数,只有存在BOS支气管镜检查时(p = 0.01)或BOS在任何时候(p = 0.02)与显著差异有关BAL微生物群组成分类(表4)。的意义不同的微生物群中发现受试者BOS坚持当测试使用阿多尼斯(p = 0.03),当控制了残在支气管镜检查(p = 0.02),但不是在控制时间自移植(p = 0.06)。没有发现显著差异分类时受到其他临床参数(p > 0.05) (表4)。这些分析表明,显著差异在球细菌社区可以发现在非移植,无症状和症状性科目,BOS相关显著差异BAL微生物群在肺移植受者。
无监督主成分分析(PCA):标签样本组(A)和标本组重心标记(B) C:任命受到样本组(RDA)。使用方差分析排列测试组不同测试。D: Biplot PCA分析情节与突出的辣子鸡标记。
减少细菌多样性与急性细菌感染的证据
我们还研究了微生物多样性在移植受者的落下帷幕。整个微生物多样性,以香农多样性指数来衡量,是减少在肺移植受者移植对照组)进行了比较(p = 0.001,相比图4一)。多样性的分布在移植对象没有统一的检查这个数字,与大多数科目与nontransplant对照组但12(27.2%)表现出显著降低细菌的多样性。当标本分析根据支气管镜检查显示,多样性在非移植对照组明显高于移植受者症状(p≤0.001)但不是无症状的移植受者(p > 0.05)(图4 b)。微生物多样性与暴露于抗生素无关落下帷幕的时候,七日内或者30天的矿山(p > 0.05) (图4 c)。微生物多样性明显落下帷幕嗜中性和负面的存在(p = 0.017)(图4 d),细菌的DNA负担(p≤0.0001)(图4 e)和积极的细菌培养(p≤0.001)(图4 f)。微生物多样性并不与任何其他相关临床参数进行了测试,包括移植前诊断(表4)。因此,微生物多样性不是统一的肺移植受者和与其他文化无关指数呈现负相关的急性细菌性呼吸道感染。
A - C:细菌群落多样性的比较移植状态(A),标本组(症状/移植状态)(B)和抗生素(C)的敞口。D E:细菌群落多样性与BAL嗜中性(D)和16 s DNA (E)。F:细菌群落多样性的比较中移植学科文化的结果。比较组意味着执行未配对t检验和方差分析与图基的多重比较测试。连续变量评估与线性回归关系。
落下帷幕的肺移植受者包含增加水平的假单胞菌科,肠杆菌科和Staphylococcaceae Prevotellaceae水平下降,Veillonellaceae,链球菌科
尽管在统计上有显著差异的主题之间的PCA集群组(图3),1)之间存在一些重叠之间的移植对照组)进行了比较和无症状的移植受者以及2)无症状,有症状的移植受者。探讨我们是否能够确定的微生物成分负责集群PCA的标本,我们利用PCA biplot分析(图3 d)。这表明差异的主要因素之一,在非移植移植对照组和许多无症状的受试者相比,其他学科的丰富OTU 1054 (图3 d,x)。这OTU是归类为普氏菌sp . .差异的主要因素会计异构移植接受者症状组丰富的单一OTU五的受试者(1065)。这OTU是归类为假单胞菌sp。图3 dy)。最后,PCA地区,包括最无症状和一些症状移植受者(图3 d,z)在很大程度上是由两个辣子鸡的存在(1025和1080)。1080年OTU归类为一个埃希氏杆菌属sp,而OTU 1025被归类为假单胞菌sp,不同于另一个假单胞菌OTU (1065)。因此,细菌中发现的肺移植接受者巴尔斯在我们的研究中包括至少两个截然不同的假单胞菌种虫害似乎在无症状和症状不同科目。
接下来我们分析了球微生物群的差异在我们学科组在分类级别。在门的水平和家庭分类分类,有症状和无症状的移植受者是明显不同于移植对照组)进行了比较,但区别开来(图5一个)。在非移植对照组中,最常见的观察门(降序)拟杆菌门,厚壁菌门,和变形菌门。这三个门的人也正是最常见的肺移植受者中观察到,尽管他们的相对频率检测的逆转,变形菌门最常见的观察门。最常见的细菌家庭发现在非移植对照组Prevotellaceae,Veillonellaceae,和链球菌科落下帷幕,而最常发现家庭从移植受者假单胞菌科,肠杆菌科和Staphylococcaceae(图5一个)。有最小的差异在家庭层面上有症状和无症状的移植受者之间的分类。的存在假单胞菌科在肺移植受者,罕见的对照组,是反映在biplot PCA(图3 d)。总的来说,大多数nontransplant控制受试者大于10%的落下帷幕组成的微生物群普氏菌种虫害和韦永氏球菌属spp。,这是罕见的在移植对象(表5)。相比之下,大多数的移植受试者大于10%假单胞菌种虫害和埃希氏杆菌属spp。,这是罕见的在nontransplant对照组(表5)。
家庭和辣子鸡按降序排名均值的相对丰度在所有科目。箱形图是彩色根据门(见门传说)。离群值绘制圆圈。答:相对丰富的10个最丰富的细菌的家庭。B: 20个最丰富的细菌辣子鸡的相对丰度。
两个截然不同的假单胞菌的物种可以确定在肺移植受者的落下帷幕
最丰富的OTU移植受者是症状之一假单胞菌sp。(OTU 1065),当礼物,被发现在非常高的相对丰度(表6,图5 by;图S1)。这个OTU相同的症状,定义集群移植对象在PCA分析(图3 by)。相比之下,最常发现OTU在无症状的移植受者(OTU 1025)是单独分类也假单胞菌sp。表6,图5 b,z)和同一OTU是主要因素,占无症状移植的集群对象的PCA分析(图3 b,z)。第三个OTU (OTU 1024)也被归类为假单胞菌sp.却相对较少,检测低丰度相比假单胞菌辣子鸡(表6,图S1)。第四个假单胞菌分类OTU (OTU 955)是在只有一个标本,发现它只占总额的0.19%的读取;这是排除在后续的分析。图S2显示了三个最丰富的代表序列假单胞菌辣子鸡以及他们的系统发育关系。OTU 1024不是一个重要的因素在利用主成分分析法(PCA)样本的聚类,我们集中我们的后续分析的两个最常见的和重要的假单胞菌辣子鸡,1025年和1065年。
为了更彻底地描述假单胞菌辣子鸡,我们利用国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具(爆炸)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。我们检查所有完全测序的微生物基因组在NCBI数据库中使用假单胞菌辣子鸡的97%同源代表核苷酸序列。的10种细菌菌株在NCBI数据库共享100%的覆盖率和代表序列的同源性铜绿假单胞菌OTU (OTU 1065),确定了9个铜绿假单胞菌(表7,表S1)。相比之下,种菌株分享100%的覆盖率和同源性与其他突出假单胞菌OTU (OTU 1025)是专门的成员p .荧光集团(表7,表S1,http://www.uniprot.org/taxonomy/200451)。
鉴于确定爆炸的潜在局限性分析了解分类名称使用16 s序列,我们设计了一个系统发育分析利用现有clincally-obtained和参考基因组序列的42个不同假单胞菌物种以及五个非假单胞菌物种。使用十景管家基因,我们构建了MLST种系发生树(图S3),而他们只能生成树使用16 s代表序列(图S2)。这些树与这些说明假单胞菌物种,MLST——16 s-generated系统发育树是相似的。铜绿假单胞菌始终要分开的成员p .荧光集团在这两个,这意味着足够的基因组差异存在于16 s地区来区分这两个物种。从我们的标本铜绿假单胞菌OTU (OTU 1065)集群只与先前测序铜绿假单胞菌物种。另一个著名的假单胞菌OTU (OTU 1025)集群紧密和专门的成员p .荧光组。
我们也分析了一些球样品铜绿假单胞菌和p .荧光特殊技能PCR引物[26],[27]。三BAL标本对象OTU丰度高1065(和低OTU 1025)和五BAL标本OTU丰度高1025(和低1065)进行了分析。1065是pcr阳性标本OTU丰度高铜绿假单胞菌而那些OTU 1025人的丰富的pcr阳性p .荧光。所有患者OTU 1065奇异BAL微生物群中的主要OTU也做了铜绿假单胞菌从他们落下帷幕(使用传统临床微生物学技术)。相比之下,铜绿假单胞菌没有从任何的11巴尔斯OTU 1025年是最丰富的OTU。因此,当考虑骨料,焦磷酸测序,爆炸,系统树分析,microbe-specific PCR和文化数据都支持这样的结论,OTU 1065代表铜绿假单胞菌1025年OTU repressentsp .荧光。
铜绿假单胞菌和p .荧光落下帷幕的肺移植受者与不同的临床特征
为了评估潜在临床意义的差异与这两个假单胞菌的存在,我们直接相比,所有受试者都大于10%的相对丰度突出假单胞菌OTU (图6)。不大于10%的受试者OTU (图6)。相比与超过10%的受试者p .荧光,主题铜绿假单胞菌有更高水平的BAL嗜中性(图6 b,p = 0.003),细菌的DNA (图6 c,p = 0.001),和更低的细菌多样性(图6 dp < 0.001)。所有的受试者大于10%铜绿假单胞菌也有积极的细菌培养鉴定假单胞菌,而这是真的只有15个学科之一,大于10%p .荧光(图6 e,p = 0.001)。移植前假单胞菌感染标本中不是更普遍大于10%铜绿假单胞菌(2/6,33%)比其他标本(13/38,34% (p > 0.05)。最引人注目的观察是,所有的受试者大于10%铜绿假单胞菌当时症状的支气管镜检查(表6),而大多数的受试者更大的10%p .荧光是无症状(图6 f)。
铜绿假单胞菌指OTU 1065,p .荧光指OTU 1025(参见文本)。相对数:每个OTU大于10%的移植受者。中:比较铜绿假单胞菌著名的和p .荧光突出BAL标本由BAL嗜中性(B),细菌的DNA负担(C),细菌群落多样性(D)和文化(E)的结果。F:相对丰富的p .荧光在预定义的主题组。比较组意味着使用未配对t检验和方差分析与图基的多个执行比较测试。应急测试使用确切概率法。
荧光假单胞菌有很强的正面和负面的相关性显著肺微生物
考虑到已知的能力p .荧光产生大量的抗菌分子,我们研究了其相对丰度之间的相关性和其他著名的肺部微生物。显著的积极和之间的线性关联被发现p .荧光和一个共同的埃希氏杆菌属OTU (OTU 1080) (p < 0.0001, R2= 0.37),并显著负非线性关联之间被发现p .荧光和辣子鸡普氏菌和韦永氏球菌属(分别为p = 0.003和0.01)(图7)。在移植的对象,p .荧光还有一个重要的负面和非线性协会的存在铜绿假单胞菌(未配对t检验,p = 0.05)。
组意味着相比使用未配对t检验。
荧光假单胞菌通常是孤立肺移植受者和航空公司的其他慢性肺部疾病患者
考虑到的重要性p .荧光呼吸道微生物群的肺移植受者,我们搜查了数据库的细菌培养分离出来自密歇根大学的临床微生物实验室确定的频率从呼吸道标本培养。2002年1月1日至2012年12月31日,p .荧光从242种不同的呼吸道标本细菌培养,每月大约标本。其中,59.9%是为呼吸道标本培养使用常规实验室协议;其余培养使用修改后的协议被用来标本收集的囊性纤维化患者(CF)。绝大多数(53.7%)从痰标本培养;21.1%是从咽喉拭子培养,13.2%是从bronchoscopically-obtained培养标本(BAL或刷牙)。最常见的基本条件是CF(38.8%的隔离),其次是其他慢性气道疾病(慢性阻塞性肺病、哮喘和non-CF支气管扩张:16.1%)和肺移植(7.4%,18标本)。10.7%(26)的标本来自疑似急性肺炎患者,和在所有四个实例病人慢性免疫抑制或最近的医疗风险罹患卫生保健相关肺炎病会议标准。在大多数隔离(85.1%),p .荧光被实验室co-isolated与物种分类为“口腔菌群”。Other species commonly co-isolated were铜绿假单胞菌(25.6%),金黄色葡萄球菌(15.7%)和Stenotrophomonas maltophilia(11.6%)。因此尽管显著差异观察culturability的假单胞菌在我们的研究中,一个全球数据库搜索嗯医院临床微生物实验室记录表明p .荧光通常从呼吸道标本分离。
讨论
利用文化无关技术和矿山标本59总主题,我们确定了这两种截然不同的假单胞菌物种支配球移植受者的微生物群。而铜绿假单胞菌检测到,当礼物,在丰度高,与临床急性感染的证据,p .荧光通常是在温和的丰度和很少发现急性感染的相关参数。我们观察到,减少移植后肺微生物群的多样性与功能相关的急性感染和移植受者之间并不是统一的。
我们的研究结果显示,在移植后微生物群中,至少有两个截然不同的假单胞菌物种是著名的和有广泛不同的临床协会,它提供了一个潜在的统一的解释显然两个报告之间的联系假单胞菌和BOS的发展。多个独立研究已经确定的存在铜绿假单胞菌呼吸文化中是一个积极的BOS的后续发展的危险因素[6],[12],[13]。然而在肺移植的最大迄今发表的研究对象利用文化无关微生物鉴定技术,维尔纳等人观察到负关联假单胞菌种虫害和BOS的诊断[11]。而丰富的主题在我们的研究中铜绿假单胞菌展出的证据符合急性感染(急性感染症状,BAL嗜中性,细菌增加负担,减少细菌多样性),丰富的许多学科p .荧光表现出急性感染的证据(图6 b-6e)。这些假单胞菌(之间的文化积极鲜明的差异图6 e)之间的差异可以解释之前文化研究和文化无关的研究维尔纳等人. .这两个之间的区别假单胞菌物种,而明确的临床和生物学意义,分析时不局限于家庭级别的分类名称(图5一个)。我们的研究结果强调了歧视性的力量将额外的微生物鉴定技术(如文化、爆炸、种系发生树生成microbe-specific PCR)补充提供的分类水平焦磷酸测序和其他文化无关的技术。
缺乏检测p .荧光通过文化在我们的标本是鲜明的,奇怪,特别是考虑到相对频率和它孤立的在我们的临床微生物实验室。有多种解释。P.fluorescens都可以存在于环境中的一个可行的但not-culturable状态22、23。所有临床呼吸道标本在我们机构在37孵化°C,而p .荧光的最佳生长温度低于32°C(温度范围,在航空公司[29])。p .荧光产生许多微生物代谢产物,抑制在体外增长的其他生物20、21一个报告中,只能培养后的液体含有透析[30]。因此其culture-negativity可能反映生产活动文化的抑制剂。
我们的研究是第一个描述的广泛丰富p .荧光在肺移植受者的落下帷幕。我们知道只有一个发表的报告的检测p .荧光BAL流体(一个与机械通气相关肺炎患者,发现使用16 s分析而不是通过BAL文化)[31]。的假单胞菌属大群包含一个极其多样化的细菌的基因组水平。已经完成了大量的工作在这个属的发展史,和最近的研究已经证明,p .荧光和铜绿假单胞菌描述完全不同的基因群体[32]。铜绿假单胞菌菌株,当使用多位点序列分析输入(MLST)或16 s rRNA基因序列比较,集群紧密在一个相关的组,同时分析p .荧光菌株已经确定了三种不同的遗传演化支[33]。由于这个原因,p .荧光已经提出细菌属于species-complex而不是一个单一的物种[34]。成员的p .荧光包括所有测序物种复杂p .荧光进化基因组,以及许多其他假单胞菌[33]。p . poae,在我们遇到爆炸分析(表S1),是一种内基因包括荧光假单胞菌p .荧光集团[32]和系统发育分析在我们的实验室使用MLST九选管家基因也集群内p .荧光在准备species-complex(手稿)。综上所述,使用文化分析,16 s分析、MLST和PCR表明两个突出假单胞菌在肺移植BAL代表两种截然不同的假单胞菌:辣子鸡铜绿假单胞菌和p .荧光。事实上,我们的审查p .荧光隔离从我们自己的临床微生物实验室发现有机体从呼吸道标本培养肺移植和其他慢性肺部疾病患者的相对频率。
最近其他文化无关的研究p .荧光其他aerodigestive束。最近的一次文化无关的分析人类唾液微生物发现患病率的增加p .荧光在实体器官移植受者,[35]和一个单独的研究发现p .荧光在绝大多数(93%)的患者胃窦活检取自acid-related胃肠道功能紊乱[36]。的成员p .荧光species-complex是专性需氧革兰氏阴性杆菌中无处不在的植物、土壤和水环境[37];他们是著名的植物共生体和很少被描述为人类致病[38]。他们通常发现在呼吸道疾病患者的家庭环境[39]。大量的增加p .荧光一直在观察病人的口咽微生物群感染了甲型H1N1流感病毒[40]。抗体p .荧光节段性回肠炎患者普遍吗[41],[42],但无论是标记或中介的人类疾病仍未确定。
之间的重要关联(正面和负面)丰富的p .荧光和其他著名的细菌有几个可能的解释。p .荧光积极抑制体外生长的细菌[43]。它会产生大量的抗生素(包括莫匹罗星[44])和用于农业生物防治生物[37]。因此,尽管观察到的关联可能是次要的共同有利的条件p .荧光和埃希氏杆菌属sp.和不利普氏菌和韦永氏球菌属spp。一个重要的研究方向将是决定p .荧光展品体内,在呼吸道和抗生物效应。
我们观察到细菌多样性减少落下帷幕的移植受者相比,控制和确定负BAL多样性和多种临床特征之间的关联与急性感染有关。最近的研究有不同的关于BAL中微生物多样性的变化相比肺移植受者移植对照组)进行了比较。Borewicz等人观察到移植受者中增加BAL微生物群的多样性[15]另外两个报告发表报道,多样性下降[11],[14]。在COPD和哮喘、肺疾病严重程度和微生物多样性之间的关系一直是类似的冲突[1]。大多数BAL微生物群的研究到目前为止要么排除患者积极感染或没有区别在分析症状和无症状的主题(如上面所引的肺移植研究)。我们的研究结果与观测相一致的CF文献表明多样性下降不是一个直接后果的疾病或受损的肺功能持续时间而是由其他因素驱动的[4]。
据我们所知,我们是第一个报告观察重要BAL微生物群的多样性之间的关联和其他BAL急性感染的指标。在我们的人口,这多样性似乎并未减少二次最近暴露于抗生素,病人得到的其他抗生素肺孢子菌预防剂前30天,七天,落下帷幕的时候没有落下帷幕细菌多样性指数降低。这些结果令人惊讶的和发散性囊性纤维化的文献[4]。所有移植主题在抗生素的基线肺孢子菌预防(不同于主体与其他肺部疾病如CF)可能与这种差异有关。而减少肠道细菌多样性与肥胖和地理位置有关[45],[46],它的重要性在肺除了急性感染的标志是不确定的。
本研究的潜在限制并发口腔和鼻腔的缺席抽样“lung-specific”细菌的鉴定。在文献中已经有讨论的微生物群中发现BAL反映lung-resident生物而不是oral-derived微生物捡起在sedation-related愿望或支气管镜的延滞。一项研究的六个健康受试者观察到类似的宪法上下呼吸道的细菌群落[20];然而,随后发表研究结果LHMP财团已经确定细菌物种BAL下呼吸道样本明显不成比例的代表[16],[17]。这些新的,更大的研究表明,一些细菌可能复制或殖民下呼吸道,与特定的选择性压力支持一些物种在别人。这样的优惠积累一定的辣子鸡支持lung-specific微生物群的存在。当前的研究的一个重要贡献是支气管镜检查插入的观察这条路线(鼻腔或口腔)落下帷幕微生物群(没有明显的影响图2)尽管明显不同的微生物群落中发现人类的嘴巴和鼻子[47]。这一发现表明,通过支气管镜通过这些空间几乎没有落下帷幕微生物群对检测的影响,和支气管镜的延滞的上呼吸道微生物群BAL流体是最小的。此外,强大的和重要的协会之间我们发现BAL细菌群落多样性和组成一方面,临床和生物学上重要的参数,是有关正在进行的讨论的诊断影响抽样肺部微生物群通过落下帷幕[48]。我们相信我们报告之间的关联BAL微生物群社区和显著的临床参数表明,BAL标本的微生物检测临床和生物学意义,不管他们的推导。
本研究的另一个限制,共同研究利用落下帷幕,落下帷幕化验是潜在变量的稀释效应。尽管努力规范盐水滴剂和收集的过程,球返回每个支气管镜检查是可变的。虽然这可能会导致不定地集中样本,我们的结果表明,细菌DNA的变化对象间的负担大大高于盐水返回的变化(图1),稀释的混杂效应之间的明确的相关性明显不足以压倒细菌DNA负担和重要的临床参数(图4 e,6摄氏度)。稀释BAL样本之间的变化没有影响相对大量的细菌,其中大部分研究结果来源于。40周期的使用在我们的PCR协议是一个潜在的偏见的来源,但是我们着陆协议(中描述的方法)是优化低生物质样品并产生一个虚假的分数低启动[49]。
我们的研究结果表明,未来的分析肺移植微生物应该区分铜绿假单胞菌和其他假单胞菌之间的物种,以及有症状和无症状的科目和急性呼吸道感染的证据。
支持信息
图S2。
基因组的比较著名的假单胞菌辣子鸡。答:代表三位著名的16 s V3-V5序列假单胞菌辣子鸡。B:系统发育树来自上面的序列。数据生成使用Lasergene Megalign(麦迪逊,MI)。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097214.s002
(TIF)
图S3。
系统发育树假单胞菌分类辣子鸡和Clinically-Obtained和参考基因组。MLST种系发生树创建使用DNASTAR SeqBuilder (Lasergene)。黑色数字分支长度。蓝色的数字引导信心值。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097214.s003
(TIF)
表S1。
NCBI BLAST结果突出假单胞菌辣子鸡。结果局限于序列与100%的覆盖率和身份和总分排名按照降序排列。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097214.s004
(医生)
确认
作者感谢扎卡里·布瑞特,肖恩·Crudgington妮可·法尔Dayana罗哈斯和Chinmay潘伟迪协助组织处理。作者要感谢里克·布什曼和他的实验室在宾夕法尼亚大学提供的16 s qPCR协议和杜安牛顿获取数据p .荧光隔离来自密歇根大学的临床微生物实验室。
作者的贡献
构思和设计实验:RPD JRE BSS JMB JLC VNL命。进行了实验:RPD CMF NW JMB JLC VNL命。分析了数据:RPD JRE BSS的命。造成试剂/材料/分析工具:RPD JRE FJM JLC VNL命。该报写道:RPD命。
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