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研究文章

在线生存分析软件评估生物标志物的预后价值使用非小细胞肺癌中的转录组数据

在线生存分析软件评估生物标志物的预后价值使用非小细胞肺癌中的转录组数据

  • Balázsgyőrffy，
  • Pawel Surowiak,
  • 1月Budczies，
  • 安德拉斯Lanczky
公共科学图书馆
X

修正

2014年10月22日：PLOS一名工作人员（2014年）校正：在线生存分析软件，以评估生物标志物的预后价值使用非小细胞肺癌中的转录组数据。PLOS一个9（10）：E111842。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111842观点修正

抽象的

在过去的十年中，非小细胞肺癌的优化治疗导致预后提高，但整体存活仍然很短。为了进一步了解疾病的分子基础，我们必须鉴定与存活相关的生物标志物。在这里，我们展示了适用于出版肺癌微阵列数据集的实时荟萃分析的在线工具的开发，以鉴定与生存相关的生物标志物。我们搜索了Cabig，Geo和TCGA存储库，以识别具有已发布的基因表达数据和生存信息的样本。单变量和多变量COX回归分析，计算危险比和Logrank P值的Kaplan-Meier存活曲线，并绘制在R中。可以在线访问完整的分析工具：www.kmplot.com/lung.．总共有1715个样本的10个独立数据集集成到系统中。作为演示，我们使用该工具验证了之前发表的21个生存相关的生物标志物。其中，腺癌中CDK1 (p<1E-16)、CD24 (p<1E-16)和CADM1 (p = 7E-12)以及所有NSCLC患者中CCNE1 (p = 2.3E-09)和VEGF (p = 3.3E-10)最有利于预测生存率。其他与生存率显著相关的基因包括RAD51、CDKN2A、OPN、EZH2、ANXA3、ADAM28和ERCC1。综上所述，我们建立了一个集成的数据库和一个在线工具，能够进行单变量和多变量分析在Silico.非小细胞肺癌新生物标志物候选的验证。

引文：Győrffyb，苏克克尔P，Budczies J，Lánczkya（2013）在线生存分析软件评估使用非小细胞肺癌中的转录组数据的生物标志物的预后价值。Plos一个8（12）：E82241。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.

编辑：Srikumar P. Chellappan，H. Lee Moffitt癌症中心研究院，美利坚合众国

已收到：2013年7月27日;公认：2013年10月22日;发表:2013年12月18日,

版权:©2013 Győrffy等。这是一篇开放获取的文章根据创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，但须注明原作者和来源。

资金：预测项目的Otka PD 83154授予支持作者工作（欧盟健康的259303号授予259303 .2010.2.4.1.-8）和kti u_bonus_12-1-2013-0003授予。资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。

利益冲突:作者宣布没有存在竞争利益。

介绍

尽管肺癌的治疗方案在过去的十年里有了显著的改善，使得各个阶段的患者存活率都有所提高，但它仍然是美国癌症相关死亡的主要原因，每年有16万人死于肺癌[1]．在大约85%的病例中，最常见的肺癌类型是非小细胞肺癌(NSCLC)，包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和细支气管肺泡癌[2]．与其他癌症实体类似，我们可以期待未来出现新的分子亚型，因为现在人们普遍认为，基于光镜的组织学细分仅使用肺癌发展基础的基因变化的众多表型表现之一[2]．

鉴定表达改变的基因与生存差异有关可能包含知识，以确定那些可以用作肿瘤生物学状态的指标的知识。实质上有两个可能的场景：这种生物标志物可以是单个基因或包含一组基因的签名。虽然在过去的三十年中发表了许多与生存相关的个体基因，但在过去的十年中只出现了使用基于基于微阵列的多姻分子预后模型[3]那[4]那[5]那[6]那[7]那［8］那［9］那[10]那[11]那[12]那[13]那[14]那[15]那［16］那[17]那［18］那［19］．这种基因组签名的可重复性的一个先决条件是原始数据的可获得性，这只是通过最近6年的出版物来确保的［9］那[10]那[11]那[12]那[13]那[14]那[15]那［16］那[17]那［18］．值得注意的是，在两个案例中，并不是作为一个整体的签名，而是作为每个单独的重要预后标记的基因已经被鉴定出来[15]那［19］．

预后标志的最初发现必须经过几项验证研究。然后，这些结果通常在荟萃分析中进行综合，荟萃分析包括大量最好超过1000名患者。在这里，通过联合几项研究的相关数据，可以提高统计能力，并实现更准确的估计。之前的几项荟萃分析试图对包括VEGF在内的孤立候选基因进行这样的荟萃分析[20], MMP9[21]，Cyclin E.[22]，survivin[23]和CDK1[24]．

在这里，我们集成了可用的基因组转录组数据集，然后使用该数据库进行先前建议的生存相关生物标记候选的荟萃分析。我们还为此类Meta分析设立了全球门户网站，可以在自动框架中无需大规模生物信息努力的新候选人进行快速验证。

材料和方法

肺癌施工微阵列数据库

我们探讨了癌症生物医学信息网格（Cabig，http://cabig.cancer.gov/，微阵列样本发表在caArray项目中)，基因表达综合(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和癌症基因组图集（TCGA，http://cancergenome.nih.gov)来识别肺癌数据集，使用关键词“lung”、“cancer”、“small-cell”、“NSCLC”、“survival”、“GPL96”、“GPL3921”和“GPL570”(以及其他微阵列平台的名称)。搜索仅限于同时获得微阵列基因表达数据和已发表的临床特征(包括生存率)的出版物。为检验随机性，对WinStat 2013中收集的所有患者的年龄、性别、吸烟史、组织学、分期、分级、手术成功、放疗及化疗等临床资料进行两两秩级检验。为进行两两排序检验，首先对样本按数据集进行排序。然后，将序列中的每个样本(“X”)与所有样本列表中后面出现的所有值(“Y”)进行比较——假设为随机性，X>Y的概率为1/2。研究人员调查了临床变量与生存率之间的相关性，并使用WinStat 2013绘制了这些变量的Kaplan-Meier曲线。在不同的微阵列平台中，Affymetrix的HG-U133A (GPL96)、HG-U133 Plus 2.0 (GPL570)和HG-U133A 2.0 (GPL3921)被包括在内，因为这些是经常使用的，而且这些阵列共有22277个探针集。使用相同的探针组可以以相似的精度、相对规模和动态范围测量相同的基因。

为了避免由于阵列错误而产生的潜在偏差，我们对所有阵列进行了质量检查。在这个实验中，我们检查了背景(19和218之间)、原始Q(0.5和14之间)、当前调用的百分比(超过30%)、bioB-/C-/D-峰值的存在、GAPDH 3 '到5 '的比率(低于4.3)和beta-actin 3 '到5 '的比率(低于18)。阈值对应于前面描述的数组的95%范围[25]．GSE4573不可能为此数据集进行质量控制，仅MAS5标准化数据可用。将过滤添加到数据库中以排除可能偏置的阵列。此外，我们使用所有基因的排名表达将所有微阵列文件与在不同研究中重新发布的拍摄微阵列进行比较。

用于在线生存计算的服务器设置

未处理的.cel文件是在R环境中标准化的MAS5（http://www.r-project.org.）使用SimpleAffy库（http://bioinformatics.picr.man.ac.uk/simpleaffy/)．我们选择了MAS5以进行标准化，因为它在我们以前的研究中的RT-PCR测量结果对比时排名最佳的正常化方法[26]．此外，MAS5可以应用于单个阵列，从而实现未来数据库的无缝扩展。对于完整的数据库，仅保留在所有三个阵列平台测量的常用探针(n = 22277)。然后，进行第二次尺度归一化，将每个数组的平均表达式集中到1000，该技术可以显著减少批处理效应。使用开放源码对象关系数据库系统PostgreSQL集成基因表达和临床数据(http://www.postgresql.org/)．

为了评估基因的预后值，计算下四分位数和上四分位数之间的每个百分位数（表达），并且使用最佳性能阈值作为单变量Cox回归分析中的最终截止。组织学，等级，阶段，性别和吸烟历史可用于多变量分析。然而，多变量分析使用较少的患者作为单变量分析，因为并非每个患者都有所有临床信息。Kaplan-Meier生存图和危害比率与95％置信区间和Logrank P值的危险比使用“存活”生物导体封装的“Survpot”函数在R中计算并绘制。软件使用的R脚本执行Kaplan-Meier分析并识别最佳截止值R脚本S1．

在Debian Linux上运行的一个平台独立的在线可用软件(http://www.debian.org）由Apache提供支持的服务器（http://www.apache.org.)．服务器端上的脚本是在PHP中开发的，这些控制用户界面，请求和结果传递。RODBC包在R和PostgreSQL数据库之间提供中间件层。可以通过互联网达到此平台http://www.kmplot.com/lung．

验证先前公布的生存相关生物标志物

使用关键词“肺癌”，“NSCLC”，“腺癌”，“鳞状细胞癌”，“生存”，“基因表达”，“签名”，“签名”，识别肺癌存活相关生物标志物。“元分析”。只包括英语的研究。资格标准还包括至少50名患者的生物标志物调查 - 仅省略了实验模型中描述的生物标志物。For each gene/signature the exact conditions in which it was identified have been retrieved, and these have been used as filtering when selecting the patients for the survival analysis.

为了可视化包括不同数量的患者的数据集中各种生物标志物的性能，我们已经产生了描绘横轴上的危险比（和置信区间）的漏斗图。每个数据集的垂直轴上的样本大小。我们还添加了在线界面的选项，以便在每个单个数据集中同时执行分析。最后，在P <0.01设定了意义。

结果

肺癌组合微阵列数据库的构建

我们总共鉴定了1715名患者，其中1120名来自7个GEO数据集，133名来自TCGA, 462名来自caArray。没有重复发表的样本。一个样品(GSM370984)在质量控制中有两个参数不合格-该阵列被排除在所有分析之外。此外，在215个数组中，有一个参数超出了所有数组的95%范围——通过在在线界面中选择“排除离群数组”，可以将这些数组排除在分析之外。发表了1405例患者的总生存期和764例患者的首次进展时间。我们收集了所有患者的年龄、性别、吸烟史、组织学、分期、分级、手术成功程度、放疗和化疗——这些参数在显示数据随机分布的两两秩检验中均不显著。本文对所使用的每个数据集的这些临床特性进行了总结表格1．按分型、性别、吸烟史、分期等进行生存率分析图1．

缩略图
下载:
图1。患者的生存特征包括腺癌(adeno)、鳞状细胞癌(SCC)、大细胞癌(large)、性别、分期(只有总生存期)和吸烟史。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.g001

缩略图
下载:
表1。分析中包括数据集的临床特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.t001

建立在线生存分析平台

我们雇用了Kaplan-Meier曲线，以在调查和生存下可视化基因之间的关联。在分析之前，使用可用的临床参数过滤患者仅包括基因相关性评估的患者。除了针对临床参数特定的过滤选项外，我们实现了一种算法，包括使用较低和上四分位数之间的所有百分比来识别最佳的执行截止。

据我们所知，目前的开发是第一个能够实时多变量生存分析现有转录组组基因的系统。

验证以前公布的NSCLC生物标志物

我们鉴定了21例先前公布的生存相关的个体基因和7个基因表达签名（列入表S1)．这些生物标志物候选者中的每一个都被研究了与最初描述的患者具有与其类似的临床特征相似的临床特征的群体。对于通过微阵列上的几种探针组测量的基因，使用质量最高（高质量：平均表达超过500或最大表达超过1000，低质量：平均表达低于100，中间：所有其他探针）。如果存在几种高质量探针，则使用最佳表现。分析结果呈现在表2.和图2.．

缩略图
下载:
图2。验证29个之前发表的NSCLC生物标志物。

在各自的样本队列中对这些基因和签名进行meta分析，得出CCNE1、CDC2和CADM1是表现最好的单个基因(两者)以及山内等人的签名。（d）．描绘危险比（具有置信区间）与CDC2和VEGF的样本号的漏斗图显示了更大的数据库大小的更可靠估计（E-F）．

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.g002

缩略图
下载:
表2。以前公布的非小细胞肺癌生存相关的生物标志物候选的表现。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.t002.

讨论

HER2基因在乳腺癌中的成功凸显了癌症生物标记物的重要性。高HER2表达首先是较差生存率的标志，但靶向抗HER2治疗的引入改变了这一情况:今天，HER2阳性患者与HER2阴性患者相比有更好的预后[27]．

这里，通过使用十个先前公布的转录组数据集的集成数据库，我们验证了与非小细胞肺癌中一组基因的生存相关的关联。通常，发现最强烈的联合是在先前的荟萃分析（VEGF，CCNE1和CDK1）中研究的那些。对于所有这些基因，较高的表达与较短的存活相关。拥有超过5,000名患者，VEGF的META分析[20]雇用最多的患者 - 我们的分析还通过单变量和多变量分析证实了VEGF表达和NSCLC患者的整体生存率的相关性。VEGF的重要性是由于靶向药剂的可用性直接抑制其激活。有趣的是，对于其中一种基因（CDK1），先前的META分析实际上抑制了基因与生存之间的相关性[24]．相比之下，我们的结果表示对该基因的大规模独立验证。在个体基因中，在显示更高的表达时，只有少数生存率相关 - 这些包括CADM1，ANXA3，ADAM28，XIAP和XAF1。这些未来的治疗靶向只能使用不同的方法，而不是大多数基因，其中较高表达实际导致较短的存活率。

手术后，大约三分之二的早期疾病复发发生在遥远的部位。因此，必须高度重视尽早根除微转移。之前对所有研究化疗获益的试验进行的荟萃分析显示，总生存率提高了5%［28］．这种对化疗的存活优势也在9年的随访中保持。由于这些原因，使用佐剂化疗是目前早期NSCLC患者的护理标准。在我们的分析系统中，我们综合了化疗的使用，使得验证与化疗治疗患者的生存有关的基因。

肺癌的主要病因因素是卷烟吸烟，其占所有病例的近85％。肺癌的发展与其他癌症类型类似，通过涉及受吸入致癌致癌的遗传变化的集体作用驱动的恶性转化来逐步进展[29]．与此同时，先前从未吸烟的肺癌患者的数量也在增加[30]．收集这些患者的潜在机制和病因的新见解对于更好地了解疾病和发展新的治疗策略是必要的[2]．在我们的数据库中，我们有1042名患者(187名从不吸烟的患者中)的吸烟史，meta分析工具还包括在非吸烟者队列中限制吸烟的选项。其他筛选选项包括使用性别(1564名患者的数据可用)和分期(697名患者)。这些选项的组合能够在之前任何单个研究没有达到的亚队列中验证biomarker候选物。

此前，在循环腺癌的董事挑战项目中，临床和基因表达信息的结合使用最适合预测预后[17]．在线软件中的多变量分析可以比较临床和分子变量。不幸的是，并不是所有的临床信息都公布了每个患者-这明显限制了任何多变量分析的潜力，包括临床和基因表达变量。

我们还必须提到一些可能削弱其有效性的meta分析问题——包括与患者选择、临床异质性、不同结果测量、方法和统计技术相关的偏差[31]．测试偏差的一个选择是绘制样本大小与效应大小，因为这通常是倾斜的和不对称的存在偏差[32]．基本上，没有偏见，在小型研究中，最大的变化应该是最大的，并且在大型研究中最少。这是我们使用的原始漏斗图的概念，以证明两个选定基因的危险率和样本尺寸之间的相关性。我们为我们的工具添加了一个分析选项，以便单独运行每个数据集中的计算，以便为任何基因提供这种分析的SWIFT构造。

最后，我们还评估了以前公布的基因表达签名以预测生存率。如今，多烯签名的临床应用仍然是争议的，因为它们的许多人都不使用常规参数来表现出预后。在这里，在七个签名中，两个人能够在阶段预测生存[13]以及所有非小细胞肺癌患者[14]．

综上所述，通过利用过去5年发布的全基因组微阵列数据集，我们成功地整合了一个适合于在Silico.非小细胞肺癌中生物标志物候选的验证。

支持信息

表S1。

先前发表的基因集所涉及的基因列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.S001

(XLS)

R脚本S1。

用于生成Kaplan-Meier Plots的R脚本

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082241.S002

（r）

作者的贡献

构思和设计了实验：BG。执行实验：BG PS JB A1。分析了数据：BG PS JB al。贡献的试剂/材料/分析工具：BG PS JB AL。写论文：BG。

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