数据
摘要
出现异常血液学结果，如淋巴细胞减少，血小板减少和全血细胞减少的严重病例被诊断为甲型H5N1禽流感。病毒是否直接传播到骨髓(BM)细胞导致了这种现象仍然是难以捉摸的。我们探讨了两种干细胞类型的易感性;从人骨髓细胞或脐带血中分离的造血干细胞(hsc)和间充质间质细胞(MSCs)感染禽流感H5N1病毒。我们首次证明H5N1病毒可以有效地感染和诱导两种人类干细胞类型的细胞死亡。相反，在人流感病毒感染时没有观察到这些活动。我们还确定了感染是否影响间充质干细胞的免疫调节功能。我们注意到，在H5N1感染的间充质干细胞和单核细胞共培养中，细胞因子和趋化因子的产生较高，从而导致了间充质干细胞介导的免疫调节失调。这些发现从广泛的组织趋向性和全身传播的角度提供了对H5N1发病机制的更好理解。
引用:王晓明，王晓明，王晓明，王晓明，王晓明，等。(2013)H5N1型禽流感病毒对间充质干细胞和CD34的趋同性研究+造血干细胞。PLoS ONE 8(12): e81805。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081805
编辑器:Kevan L. Hartshorn，美国波士顿大学医学院
收到:2013年6月17日;接受:2013年10月16日;发表:2013年12月10日
版权:©2013 Thanunchai等人。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议它允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是要注明原作者和出处。
资助:这项工作得到了国立卫生研究院和国立过敏和传染病研究所(YI-AI-5026-01)，泰国国家基因工程和生物技术中心(BIOTEC) (P-00-10072)和玛希隆大学理学院的支持。共聚焦显微镜部分由玛希隆大学Siriraj医院医学院支持。他南猜在皇家金禧博士计划(RGJPHD)奖学金的研究生学习期间获得了财政支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。
简介
H5N1亚型高致病性A型禽流感病毒最初在家禽中流行，但跨越了禽-人物种障碍。根据世界卫生组织自2003年以来的报告，它已成为一种高度致命的人类传染病，在十多个国家观察到60%的死亡率[1]，[２]．H5N1患者的病理过程是最初表现为发烧和呼吸系统症状，包括咳嗽和呼吸短促[3]．此外，重症病例以暴发性病毒性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭和死亡为特征[4]．一旦感染，病毒可以从肺部传播到其他器官［5］也会传染给胎儿[4]，［5］，导致全身性疾病，导致异常高的死亡率。H5N1病毒感染的致命结果与存在高病毒载量、高细胞活力血症和相关的反应性噬血综合征有关[4]．严重者常见血液学异常，包括淋巴细胞减少、白细胞减少、血小板减少和全血细胞减少，这可能与骨髓(BM)抑制和/或病毒相关噬血细胞症有关。尽管已知病毒的全身传播，但没有从BM本身分离出病毒的报道，即使在同一尸检对象的其他样本中检测到病毒抗原[6]．如果病毒介导的BM抑制可能是导致所观察到的大量细胞损失、血液学异常和高炎性细胞因子产生的因素，那么确定所观察到的抑制是否是病毒直接入侵的结果就很有趣了。
骨髓是产生祖细胞的重要来源。它包含两种类型的祖细胞;可分别分化为血细胞和间充质系细胞(成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等)的造血干细胞和非造血干细胞[7]．造血干细胞具有更新和分化能力[8]．造血干细胞能够从骨髓迁移到血液循环系统[9]．CD34+细胞是一个包括造血干细胞(hsc)、髓系、红系和淋巴系祖细胞的群体[10]．近年来，脐带和胎盘被认为是造血干细胞分离的丰富来源[11]哪些与骨髓干细胞有相似的特征[12]．间充质干细胞具有许多关键的生物学特征，这些特征构成了上文所述的被接受的干细胞的定义标准。骨髓间充质干细胞作为支持细胞，调节正常造血过程，包括造血干细胞的生长、成熟、分化和生存[13]．由于其分化能力，间充质干细胞可以通过分化成受损细胞的特定表型来再生受损组织[14]．MSCs还通过抑制NK、T、B和单核细胞来源的树突状细胞(MoDCs)的增殖和功能发挥免疫调节活性[15]- - - - - -[17]．这些特性似乎对在组织损伤、移植和自身免疫等条件下调节免疫反应的治疗方法更为重要[18]．
BM是祖细胞的丰富来源[19]可能是h5n1引起的血液学异常的靶标[20]，引导我们调查BM中H5N1病毒的直接感染。在这项研究中，我们证明了高致病性禽流感(HPAI) H5N1病毒可以高效地感染和复制CD34+造血干细胞和间充质干细胞。目的细胞表面的唾液酸(SA)受体被认为是介导病毒结合和进入的主要受体。H5N1病毒感染诱导CD34细胞死亡+造血干细胞和间充质干细胞。我们还观察到，促炎细胞因子和趋化因子在MSCs和原代单核细胞共培养中增强，这表明H5N1感染改变了MSCs的免疫调节作用。
材料与方法
脐带血(CB)和脐带血样本
脐带血(CB)来自足月新生儿，并收集在无菌收集袋含有抗凝血柠檬酸磷酸盐葡萄糖。骨髓(BM)样本从健康供体髂后上棘抽吸。CD34的+表达造血干细胞(CD34+造血干细胞(hsc)是从上述两种来源中分离出来的，而间充质基质细胞(Mesenchymal Stromal Cells, MSCs)是从骨髓中分离出来的。干细胞在收集材料后不迟于15小时(h)分离。本研究的所有样本均经泰国玛希隆大学医学院Ramathibodi医院机构审查委员会批准，获得所有捐赠者的书面知情同意。
CD34的分离培养+hsc和CD14+单核细胞
使用IsoPrep (Robbins Scientific, Canada)密度离心法从CB (CBMCs)和BM (BMMCs)中分离出单个核细胞(MCs)。CD34+按照制造商的说明，使用CD34 MACS微珠(Miltenyi, Gladbach, Germany)从cbmc和bmmc中分离出造血干细胞。CD34的效率+通过phycoerythrin (PE)偶联抗cd34单克隆抗体(Miltenyi, Gladbach, Germany)在4℃下对分离的细胞表面标记物进行30分钟的染色来确定造血干细胞的纯化。细胞在PBS中清洗，用流式细胞仪(Becton-Dickinson pharingen, Heidelberg, Germany)在配有488 nm调氩激光的仪器上进行分析。获得CD34的百分比+在所有纯化的CB和BM样品中，hsc的范围为98%至99%。表达>98% CD34抗原的细胞在Stemline II培养基(Sigma，美国)中培养，培养基中添加特定的造血生长因子鸡尾酒，包括50 ng/ml干细胞因子，50 ng/L rh-IL-6和50 ng/L rh-IL-3(研发系统)。CD14+共培养研究中使用的单核细胞如前所述分离[21]．简单地说，使用IsoPrep和CD14离心获得外周血单个核细胞(pmcs)+用CD14 MACs微珠分离单核细胞。单核细胞在RPMI 1640培养基(Gibco, Life Technology, Rockville, Md.， USA)中培养，培养基中添加10%胎牛血清(FBS)、2mm l -谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素(Pen/Strep)。
MSC纯化与培养
用IsoPrep密度梯度离心分离骨髓基质细胞。简单地说，将10ml肝素化骨髓样本与等体积的Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco, Life Technology, Rockville, Md.， USA)混合，在室温下1000g离心30分钟。收集界面单个核细胞，用DMEM冲洗两次。用0.2%台盼蓝评价细胞总数和存活率。总共2×106细胞/ml BMMCs在添加10% FBS和1% Pen/Strep的DMEM完全培养基中培养，37°C, 5% CO2．培养72小时后，丢弃非贴壁细胞，每四天重复一次这一过程。当MSCs融合度达到90%时，用0.05%胰蛋白酶- edta进行胰蛋白酶化，然后传代进行下一次扩增。
凝集素染色
为了鉴定与sa α 2,3gal -或sa α 2,6gal特异性凝集素反应的唾液寡糖，1×105分别用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的凝集素黑松菌凝集素(SNA)和Peridinin叶绿素蛋白复合物(PerCP)标记的马氏马氏菌凝集素(MAA) (Boehringer Mannheim Biochemicals)培养hsc和MSCs，分别检测sa α2,6半乳糖和sa α2,3半乳糖[22]．在冰冷的PBS中洗涤三次后，样品用流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。
流感病毒感染造血干细胞和间充质干细胞
A型流感病毒的不同亚型:高致病性H5N1 (A/开嘴鹳/Nakhonsawan/BBD0104F/04)和人A型流感病毒;H1N1 (A/WS/33)和H3N2 (A/Hong Kong/8/68)的传播和定量如前所述[21]．这些菌株在整个研究中都被使用。对CD34+用无血清培养基洗涤体外培养的造血干细胞，在感染多重数(MOI)分别为1和10的情况下，对每种病毒吸附1小时。所有H5N1病毒实验都是由训练有素的研究人员在生物安全3级设施内进行的。吸附后，再次用无血清培养基洗涤细胞，并在添加特定造血生长因子鸡尾酒的Stemline II培养基中培养。对于H1N1和H3N2病毒感染，使用相同的培养基，但在孔中添加含有0.02 ug/ml的TPCK胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)[23]．同时，在感染前1天进行间充质干细胞镀膜。培养物达到100%融合生长后，用无血清培养基洗涤细胞，用病毒MOI 1和10吸附1小时。吸附后，细胞用无血清培养基洗涤三次，并在无血清培养基中培养。作为对照，H5N1病毒在56°C下热杀灭30分钟[24]．
反向遗传病毒的产生
覆盖多碱基裂解位点的HA基因片段被修饰成低致病性序列，克隆到pHw2000质粒中，测序，并如前面所述用于反向遗传(rg)病毒的构建[25]．简单地说，HEK-293细胞与MDCK细胞在6孔板上共培养，分别转染野生型HA或突变型HA以及a /Puerto Rico/8/34 (H1N1)的其他7个基因组片段，以生成rgPR8-H5和rgpr8 - h5单碱基病毒。
MSCs与CD14共培养+单核细胞
实验前一天，在37°C, 5% CO条件下，在添加10% FBS和1% Pen/Strep的RPMI 1640 24孔平底培养皿中接种MSCs2过夜。新隔离3×105CD14+每孔加入单核细胞(MSC:单核细胞比1∶5)。对照包括单培养的间充质干细胞和单核细胞。
共培养，MSCs和CD14的融合单层+用无血清培养基清洗单核细胞，然后在MOI为0.04的条件下感染H5N1病毒，37℃孵育1小时。未处理的细胞作为对照。感染后，去除接种体，用无血清培养基洗涤细胞，然后将1 ml添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基放入孔中。在感染后24小时，通过Bio-plex Pro Human Cytokine Assay测定感染共培养、MSCs单培养和单核细胞单培养上清液中产生的细胞因子。
甲型流感病毒抗原的免疫荧光检测方法
在2.5×10上进行免疫荧光检测4在载玻片培养基上生长的细胞。在感染后24小时(p.i)，细胞用4%多聚甲醛固定在PBS中，并用细胞固定液/细胞固定液渗透(BD Biosciences)。用fitc偶联抗体(DAKO)染色病毒核蛋白(NP)。CD34+用phycoerythrin (PE)偶联抗cd34单克隆抗体(红色)(Miltenyi Biotec)对细胞进行反染色。使用激光罐共聚焦显微镜(LSM510 META;卡尔·蔡司)在玛希隆大学Siriraj医院医学院研究与发展办公室医学分子生物学部门工作。
流式细胞术检测病毒感染和细胞表面标志物
分析细胞表面标记物检测CD34+和CD14+根据制造商说明书(MACS，德国和BD，美国)，分别使用PE和percp偶联的特异性单克隆抗体。为了检测病毒抗原，所有感染细胞都用fitc偶联NP抗体(绿色)孵卵(Chemicon, Temecula, CA.)。将这些细胞洗净，在3.7%的甲醛中重悬，然后用流式细胞仪分析。
实时聚合酶链反应
在不同时间点收集感染的间充质干细胞，按照制造商的说明使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)提取总病毒RNA。用PBS清洗细胞三次以去除游离病毒粒子。利用oligodT引物和AMV逆转录酶(Promega)从病毒基因组RNA合成cDNA。这些cDNA样本被用作模板。如前所述，H5N1病毒的M基因被扩增[21]使用HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)。利用转子-Gene 3000 (Corbett Robotics)的SYBR绿色荧光信号对基因拷贝进行量化。标准曲线是用一系列稀释质粒(从1-107副本)包含各自克隆的基因目标。由于RNA和cDNA的数量可变，结果被标准化，最终表达为目的基因的数量。
空斑实验
从感染的CD34中采集培养上清液+不同时间点的造血干细胞和间充质干细胞。用空斑法测定上清液中的病毒滴度。简单地说，用10倍稀释的H5N1病毒接种MDCK细胞，在37℃下孵育1小时。除去接种物，清洗细胞，用含2%琼脂糖的空斑培养基覆盖。两天后，细胞用1.25%结晶紫染色，并评估斑块数量。
细胞凋亡检测
病毒感染1×105MOI为1或10,CD34+造血干细胞和间充质干细胞在特定的培养基中培养16小时，平行样品用DNaseI作为阳性对照。凋亡细胞采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp -生物素缺口末端标记(TUNEL)阳性染色，按照制造商提供的方案进行。(原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红，罗氏)。简单地说，感染H5N1、H1N1或H3N2病毒16小时后，细胞用4%的多聚甲醛固定，细胞固定液/细胞固定液渗透(BD生物科学)。之后，将细胞置于含有末端脱氧核苷酸转移酶和TMR红偶核苷酸的标记反应混合物中，37℃孵育1小时，用PBS洗涤数次。为了检测TUNEL染色后的病毒抗原，如前所述，用fitc偶联抗np抗体在4°C下孵卵30分钟。两个CD34+用DAPI反染HSCs和MSCs，然后用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510 META;卡尔蔡司)。
结果
BM细胞表达流感病毒受体
细胞表面的唾液酸(Sialic acid, SA)被广泛认为是一种流感病毒受体，它可以介导流感病毒的结合和融合。与半乳糖相连的SA (SAα2,3- gal)分布在禽类胃肠道和人下呼吸道，而SAα2,6- gal则在人上呼吸道表达[22]，[26]，[27]．然而，目前还没有关于SA受体在干细胞上表达的报道。因此，我们研究BM干细胞是否表达SA受体。我们染色分离的CD34+具有MAA和SNA的hsscs和MSCs分别对sa α2,3- gal和sa α2,6- gal特异。我们证明了CD34+HSCs和MSCs表达禽(sa α2,3- gal)和人(sa α2,6- gal)流感病毒受体(图1)．MDCK和CD14+使用单核细胞作为对照，因为它们是流感病毒感染的已知靶点，据报道表达两种SA受体[21]．这一结果表明CD34 .+造血干细胞和间充质干细胞可能是禽流感和人流感病毒的靶点。
CD34+造血干细胞，间充质干细胞，CD14+分别用α2,3和α2,6 SA特异性SNA和MAA培养单核细胞和MDCK细胞，流式细胞仪检测。所示的剖面描述了细胞数量是细胞表面sa α2,3 gal和sa α2,6 gal特异性凝集素活性低聚糖对数荧光强度的函数。相对平均荧光强度(MFI)和平均通道荧光(MCF)是描述荧光素亮度的参数，通过减去阴性对照(Grey)的MFI和MCF来计算。数据代表了三个独立的实验。
造血干细胞对禽流感(H5N1)病毒敏感，但对人流感病毒不敏感
目的探讨H5N1病毒是否能感染造血干细胞CD34+从BM和CB中分离、纯化hsc，然后用H5N1病毒感染材料与方法部分。在感染后24小时(p.i)，病毒抗原(NP)在CD34中表达+感染活H5N1病毒而非热灭病毒时的造血干细胞(图2一个)．相反，CD34+免疫荧光染色显示，造血干细胞对人流感病毒(H1N1和H3N2)完全耐药图2一个流式细胞仪图S1．H5N1感染的NP阳性(NP+)细胞百分比与人流感病毒感染有统计学差异P值<0.05 (图2一个)．通过流式细胞术，我们证实了CB和bm衍生的CD34+造血干细胞对H5N1病毒的感染指数较高时敏感，但在感染指数较低时敏感程度较低(图2 b)．在不同的H5N1病毒株之间观察到相似的易感程度(图S1)．我们继续研究这些细胞是否支持产生新的传染性病毒颗粒。在不同时间点从感染细胞中收集培养上清，使用标准空斑试验确定病毒输出。从CD34释放的传染性H5N1病毒颗粒的水平+hsc从0到12 h增加1 log，在MOI高时达到峰值，在12h时增加不到1 log，在MOI低时趋于稳定(图2 c)．这些发现表明H5N1病毒可能具有干细胞趋向性，使病毒能够感染CD34并在CD34中复制+肝星状细胞。
（一个) CD34+在MOI为10的条件下，用活禽和热杀禽(H5N1)和人流感病毒(H1N1和H3N2)感染CB的造血干细胞24小时。在MOI为1的条件下，用感染H5N1的MDCK感染12小时作为阳性对照。固定细胞并渗透细胞内流感核蛋白(NP;绿色)。CD34+细胞用抗人CD34-PE反染色(红色)，然后用共聚焦显微镜检查，并在×200放大倍率下拍照。NP阳性(NP+)细胞的百分比是通过在5个随机区域中计算每总细胞中NP+细胞的数量来获得的。（B) CD34+BM和CB来源的造血干细胞暴露于高(MOI 10)或低(MOI 1)剂量的H5N1病毒。流式细胞仪检测病毒抗原的表达。（C)感染CD34的上清液+在感染后不同时间点收集MOI 1和10的hsc，然后在MDCK细胞上滴定，用空斑法测定病毒产量。结果是从三个不同的实验中获得的，并以均值加标准误差的形式表示。P值<0.05表示H5N1感染与人流感病毒感染的显著性
间充质干细胞对H5N1禽流感病毒高度敏感
接下来我们研究了非造血干细胞(MSCs)对H5N1病毒的易感性。骨髓间充质干细胞是从骨髓中分离出来的。一旦在适当的培养基中培养细胞，获得均匀的细胞培养物，就测试细胞的表面标记特征。分离的间充质干细胞表达CD73、CD90和CD105，但不表达CD34和CD45(数据未显示)。MSCs感染H5N1、H1N1和H3N2病毒。令人惊讶的是，间充质干细胞对H5N1病毒高度敏感，而H5N1病毒是必需的活病毒(图3一)．间充质干细胞对感染的易感性在不同程度上与暴露剂量相关(图3B和3E)．荧光显微镜和流式细胞术显示，间充质干细胞对人流感病毒株感染有限，感染百分比与H5N1感染显著不同(图3A、3C和3D)．此外，H5N1病毒在间充质干细胞中具有很高的复制效率，在MOI为10 (图3 f)．MOI为0.008(每120个靶细胞有一个病毒颗粒)足以感染间充质干细胞，在感染36小时后产生至少2对数的新H5N1病毒颗粒(图S2)．这一现象仅局限于HPAI H5N1，因为代表HPAI H5N1的rgPR8-H5在MSCs中的感染比例明显高于低致病性rgpr8 - h5monobicP值<0.05 (图S3)．这些结果表明，H5N1病毒可以在骨髓间充质干细胞中有效感染和复制，从而扩大其在BM环境中的宿主范围。
（一个)将禽流感H5N1感染间充质干细胞的能力与人流感病毒进行了比较。细胞感染H5N1;活的或热灭活的，H1N1和H3N2的MOI为10。24小时后，用共聚焦显微镜对细胞进行染色和检测病毒抗原(绿色)的表达，埃文蓝(红色)作为反染色。高、低MOIs感染间充质干细胞的百分比(B) H5N1病毒及(C)流式细胞术检测人流感病毒。（D) moi10 24小时内MSCs感染mock、H1N1、H3N2、H5N1和热杀H5N1的感染率。在MOI 1感染H5N1病毒12小时的MDCK作为阳性对照。（E)不同剂量感染H5N1病毒12 h后，实时PCR检测间充质干细胞中H5N1 M基因，用β -肌动蛋白(beta actin)规范病毒RNA含量。（F)用空斑法测定感染间充质干细胞在不同时间点产生H5N1病毒的情况。结果代表了三个独立实验的均值和标准差。P<0.05表示H5N1与人流感病毒感染差异有统计学意义。
禽流感病毒感染导致CD34死亡+造血干细胞和间充质干细胞
一旦人类干细胞被感染，活细胞的数量就会减少(数据未显示)。我们怀疑这与这些细胞的凋亡有关。带着这样的想法，我们研究了MSCs和CD34的命运+感染后的造血干细胞。凋亡细胞采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp -生物素缺失末端标记(TUNEL)染色(原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红，Roche)进行表征。TUNEL实验证实H5N1活病毒可诱导CD34细胞凋亡+而人流感病毒和热杀H5N1病毒蛋白则不能(图4A和4B)．大多数h5n1感染的间充质干细胞均出现病毒诱导的细胞死亡(图4 b)．在感染h5n1的间充质干细胞中，合并信号(NP+TUNEL+)的百分比与单一阳性信号(NP+或TUNEL+)的百分比相当图S4，这与合并图像中多种颜色的共定位有关图4 b．然而，在一些未感染的CD34细胞中也观察到细胞凋亡+hsc数量为TUNEL+的数量;无感染细胞凋亡明显高于NP+TUNEL+;感染和凋亡(图S4)．该数据与h5n1感染CD34合并图中的非定位红色信号相关+肝星状细胞在图4一．这一发现表明H5N1病毒在MSCs中通过感染直接引起干细胞凋亡，而在CD34中通过感染间接引起干细胞凋亡+肝星状细胞。
（一个) CD34+感染H5N1病毒的造血干细胞的MOI为10，而(B) MSCs感染禽流感病毒或人流感病毒的MOI与CD34相同+肝星状细胞。平行样品用DnaseI处理，以破坏双链DNA作为阳性对照。18 h后，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp -生物素切口末端标记(TUNEL)染色(红色)、fitc标记的anti-NP(绿色)和DAPI(蓝色)对细胞进行固定、渗透和多重染色。b中的箭头表示同时表达细胞内病毒抗原和凋亡信号的细胞。样品在共聚焦显微镜下检查，并在×200放大倍率下拍摄。
禽流感病毒破坏mscs介导的免疫调节
由于间充质干细胞是具有免疫调节活性的非免疫细胞，进一步探讨间充质干细胞在H5N1发病机制中的作用至关重要。先前的报道表明MSCs能够抑制单核细胞来源的树突状细胞(MoDCs)的分化。[15]，[17]．研究H5N1感染后的免疫失调是很有趣的。因此，我们推测H5N1感染可能改变mscs介导的免疫调节。单核/巨噬细胞主要分泌炎症介质，包括IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1β和GM-CSF，这些介质在h5n1介导的免疫发病机制中起关键作用[28]，[29]．在此，我们设计了一个实验，在MOI为0.04的情况下，将MSCs/单核细胞共培养物感染H5N1病毒，并将感染的共培养物与模拟、MSCs单培养和单核细胞单培养的细胞因子谱的变化进行比较。感染后24小时，收集培养上清，测定细胞因子的产生。细胞因子和趋化因子使用Bio-plex Pro Human Cytokine Assay进行检测。我们发现h5n1感染MSCs的IL-6水平与模拟的相当，而在CD14感染的MSCs中几乎检测不到IL-6+单核细胞(图5一个)．趋化因子;MCP-1和MIP-1β在单一培养的h5n1感染MSCs中没有上调，但在CD14感染MSCs中略有上调+单核细胞(图5B和5C)．与模拟相比，h5n1感染间充质干细胞/单核细胞共培养中IL-6、MCP-1和MIP-1β均显著上调。图5 a-5c)．相比之下，来自h5n1感染共培养物的一些细胞因子和趋化因子如IL-1β、IL-8和GM-CSF与各自的对照没有显著差异(图S5)．这些结果表明，H5N1感染的间充质干细胞/单核细胞共培养可产生高水平的IL-6、MCP-1和MIP-1β，表明H5N1感染的间充质干细胞与单核细胞共培养时具有诱导免疫失调的潜力。
（一个) il-6， (B) MCP-1，及(C)感染CD14上清液MIP-1β水平测定+单核细胞和MSCs单培养，MSCs/CD14比例为1∶5+用Bio-plex细胞因子法测定MOI为0.04时共培养的单核细胞。数据通过Bio-plex 5.0软件进行分析。实验中使用的两种不同类型的细胞来自不同的供体。结果代表了两个独立实验的均值和标准差。单个星号表示模拟细胞和感染细胞之间有统计学上的显著差异P<0.05和双星号表示共培养组与单培养组间差异有统计学意义P值<0.05。
讨论
关于H5N1的发病机制的细节有限。H5N1感染不局限于呼吸器官，这种病毒的全身性传播使H5N1有别于其他人类流感病毒。尸检时BM中病毒RNA的检测以及严重H5N1病例中血液学异常的存在增加了我们对H5N1介导的BM抑制的兴趣。因此，研究BM细胞中的病毒趋向性非常重要。CD34直接感染的前期研究+其他持续性病毒，如麻疹病毒(MV)[10]和巨细胞病毒(CMV)[30]，[31]证明了病毒介导的免疫抑制然而，骨髓细胞的急性病毒感染仍不清楚。
在本研究中，我们首次证明H5N1病毒可以直接感染人类BM原代祖细胞:造血干细胞和间充质干细胞。病毒感染诱导细胞死亡，影响间充质干细胞的免疫调节活性。我们得到的数据可以更好地解释病毒在肺外器官中的发病机制。我们从分离CD34开始+健康供体骨髓和骨髓间充质干细胞通过流式细胞仪、定量RT-PCR、斑块检测、免疫荧光和共聚焦显微镜等不同技术，我们证实了CD34+造血干细胞和间充质干细胞支持H5N1病毒的生产性感染，尽管CD34的程度较低+肝星状细胞。这两种干细胞都对人流感病毒(H1N1和H3N2)感染具有抗性，尽管这两种细胞分别表达禽流感和人流感病毒的受体α-2,3 SA和α-2,6 SA。结果表明H5N1病毒具有BM性和CD34+骨髓间充质干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)可作为骨髓间充质干细胞内病毒的关键扩增体。这两种细胞的动员特性可以支持病毒在全身的传播[9]，[32]．我们的发现与Gu J.，等．[33]和Uiprasertkul M，等．[34]研究表明H5N1能够传播和感染肺外器官，显示病毒具有广泛的组织趋向性。然而，有限的尸检数据证明病毒在全身器官中传播。
由于一些表达α-2,3 SA和2,6-SA的细胞不能支持病毒的有效感染和复制，每种细胞类型对H5N1感染的易感性部分依赖于SA受体[35]．此外，可能还有一些未知的细胞内因素或机制与CD34的允许性有关+hsc与H5N1病毒。先前的研究表明，H5N1可以感染免疫系统特定细胞中的各种靶标[21]，[36]- - - - - -[38]因此，H5N1可能通过多种机制，如ns1介导的IFN抑制，PB1-F2在限制有效的免疫细胞介导的病毒清除中的促凋亡功能，来逃避宿主的先天免疫反应在活的有机体内以及禽类受体向人类受体的转换使H5N1能够逃避含有α-2,3 SA的粘蛋白的病毒中和作用[4]，[39]．尽管这两种病毒更有可能是实验室毒株而不是人流感毒株，但应进行进一步的调查，以了解祖细胞对H5N1病毒的高易感性背后的机制。
研究表明，细胞凋亡在H5N1发病机制中起着重要作用。上皮细胞和淋巴细胞感染诱导凋亡在体外[40]，[41]．人类淋巴细胞凋亡增加导致严重的淋巴细胞减少，这是由直接感染或过度激活细胞因子反应引起的[41]．在本研究中，H5N1病毒诱导了MSCs和CD34的高凋亡率+肝星状细胞。在大多数感染的间充质干细胞中观察到的凋亡可能是由于直接感染引起的，而在CD34中观察到的凋亡+在未感染的CD34中观察到凋亡信号，旁分泌因子可能诱导造血干细胞+造血干细胞数量(图4一)．进一步的实验证实CD34细胞异常凋亡+造血干细胞将被进一步研究。CD34以来+造血干细胞(hsc)和间充质干细胞(MSCs)是具有自我更新能力的原始祖细胞，在造血和间生过程中产生后代细胞，前体细胞的减少可能会影响这两个过程，最终导致所有谱系中分化细胞的数量减少。骨髓间质和CD34受损，造血功能中断+在MV诱导的淋巴细胞减少后，淋巴样前体的再繁殖显著受损[10]．我们的发现支持血液学异常表现，包括低外周血计数和血细胞减少，这是严重H5N1感染患者的突出临床特征。此外，MSCs的大量缺失会影响免疫抑制活性，导致免疫反应过度激活。
H5N1病毒的发病机制以广泛的组织嗜性、全身复制和高细胞活力血症为特征[42]，[43]．h5n1诱导的促炎细胞因子是由各种免疫细胞在协调攻击入侵病原体时产生的。在正常情况下，抗炎细胞因子是调节促炎反应的免疫调节分子。另一方面，在病理条件下，可能会发生抗炎反应与促炎反应平衡的破坏[44]．间充质干细胞具有有效的免疫调节作用，使其成为减少炎症和损伤的有吸引力的靶标[18]，[45]．MSCs已被证明与CD14相互作用+单核细胞和阻断单核细胞向树突状细胞(dc)分化，IL-6部分参与了这一作用[15]，[17]，[46]，[47]．此外，间充质干细胞可以通过树突状细胞和T细胞亚群调节细胞因子的产生[15]．MSCs和单核细胞的相互作用导致感染期间的免疫病理和MSCs介导的免疫调节失调的事实是有争议的。有趣的是，我们的研究结果表明，IL-6、MCP-1和MIP-1β来自MSCs/CD14+单核细胞共培养上调，而MSCs或单核细胞单培养未见此效应。既往研究表明，IL-6升高可增强炎症反应[43]，[48]，[49]．H5N1有可能通过使免疫调节剂向增强子倾斜而破坏mscs介导的免疫调节，这可以从感染共培养物中IL-6水平的显著升高得到证明。较高水平的IL-6可能会促进DC成熟的抑制，从而减少抗原提呈细胞的数量，从而导致病毒清除缓慢。先前发表的数据报告说，H5N1是MCP-1和MIP-1β的强诱导剂，它们负责将免疫细胞招募到感染部位[49]，[50]．因此，高水平的MCP-1和MIP-1β被感染共培养可能通过吸引许多免疫细胞进入BM环境来放大炎症反应[51]这表明间充质干细胞可能间接参与H5N1诱导的炎症，因为当它们与单核细胞共培养时，它们对H5N1感染的反应更活跃。
细胞因子的过度激活，包括TNF-α，可溶性IL-2受体，IL-1和IL-6可能在反应性噬血细胞综合征(RHS)的发病机制中发挥作用。[52]．高水平的IL-6、MCP-1和MIP-1β在h5n1感染的共培养物中产生可能会在BM中诱导RHS。RHS的特征是激活的巨噬细胞，从而吞噬邻近的细胞，包括造血细胞[53]．这可能导致明显的低细胞性脑脊髓瘤。来等先前的文献表明，BM中的低细胞状态和RHS是在致命H5N1病例中观察到的最突出的病理特征[54]．
除了骨髓组织，间充质干细胞在包括肺在内的许多具有类似功能的其他器官中也被发现[32]，[55]．它们对肺内稳态的维持和肺损伤后的修复具有重要意义[32]．由于肺部是流感病毒感染的主要部位，居住在肺部的间充质干细胞有可能被H5N1病毒感染，导致更新和分化过程中断。此外，mscs介导的免疫调节功能可能如假设的那样失调，导致肺的严重损伤。虽然在人类中没有数据，但在鸡和猪的肺中研究了流感病毒感染的肺间充质干细胞[23]，[56]．
总之，我们证明了H5N1病毒在CD34中更有效地感染和复制+造血干细胞和间充质干细胞与人类流感病毒的比较在体外．细胞凋亡是MSCs感染的直接结果，而CD34的细胞凋亡可能是由旁分泌因子诱导的+肝星状细胞。此外，H5N1感染可以通过将免疫调节剂的产生转向增强子来干扰msc介导的免疫调节，而增强子反过来又通过循环单核细胞和巨噬细胞的涌入放大细胞因子反应。我们的探索从严重H5N1感染患者的侵袭性全身感染和血液学异常方面深入了解了H5N1的发病机制。
支持信息
图S1。
cb衍生CD34的敏感性+不同的H5N1病毒株。感染通过使用特定的标记物(核蛋白)来确定，并通过流式细胞仪检测。以MOI为10的不同禽流感和人流感病毒毒株感染细胞24小时。结果分别从三个不同的实验中获得，并以均值加标准误差表示。＊P<0.05表示H5N1感染与人流感病毒(H1N1、H3N2)感染差异有统计学意义。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081805.s001
(TIF)
图S2。
h5n1感染间充质干细胞在不同剂量和孵育时间下的病毒产量禽流感H5N1可在MSC中感染和复制。数据为在不同MOI下感染H5N1的间充质干细胞上清液中形成斑块的单位，洗净，并在指定的时间点孵育。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081805.s002
(TIF)
图S3。
MSCs的高易感性仅局限于HPAI H5N1。分别用代表HPAI H5N1、LPAI H5N1和H1N1病毒的rgPR8-H5、rgpr8 - h5monobic和rg-PR8在MOI 1感染MSCs 24小时。LPAI H5N1是反向遗传(rg)病毒，在HA裂解位点携带单碱基氨基酸，如中所述材料与方法部分。流式细胞仪检测感染百分比。结果代表了两个独立捐赠者的均值和标准差。＊P<0.05表示rgPR8-H5病毒与rgpr8 - h5单基病毒、rg-PR8病毒差异有统计学意义。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081805.s003
(TIF)
图S4。
H5N1感染诱导的凋亡细胞百分比。(一)CD34+HSCs感染H5N1病毒，(B) MSCs同时感染禽流感病毒和人流感病毒，MOI为10。18 h后，细胞固定，渗透，TUNEL, NP和DAPI多次染色，共聚焦显微镜检测，如中所述图4．通过从5个随机视图中计数阳性细胞来获得阳性信号的百分比。数据以两个独立实验的平均值±标准差表示。*P<0.05表示h5n1感染CD34的TUNEL+和Merge (NP+TUNEL+)百分比差异有统计学意义+．**P<0.05表示在MSCs中h5n1诱导的凋亡数量与人流感病毒相比具有显著性。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081805.s004
(TIF)
图S5。
在共培养中，H5N1没有诱导IL-1β、IL-8和GM-CSF。(A) IL-1β， (B) IL-8和(C) GM-CSF水平使用Bio-plex细胞因子法测定。本实验中两种不同类型的细胞来自不同的供体。所示数据为两个独立实验的平均值±标准差。单个星号表示模拟细胞和感染细胞之间有统计学上的显著差异P<0.05和双星号表示共培养组与单培养组间差异有统计学意义P值<0.05。N.s.的意思是没有意义。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081805.s005
(TIF)
致谢
我们非常感谢Robert G. Webster博士为逆向遗传学提供pHW2000质粒和A/PR/8/34骨干质粒。我们要感谢Chokdee Wongborisut先生在获得人类MSCs方面的帮助。
参考文献
- 1.Beigel H, Farrar H, Han AM, Hayden FG, Hyer R等(2005)当前概念-人感染甲型H5N1禽流感。新英格兰医学杂志353:1374-1385。
- 2.世卫组织(2013年)向世卫组织报告的甲型H5N1禽流感人间确诊病例累计数目。
- 3.Tran TT, van Doorn HR, de Jong MD(2008)人类H5N1流感:目前对发病机制的认识。国际生物化学与细胞生物学杂志40:2671-2674。
- 4.顾娟，张志刚(2008)人感染H5N1型禽流感病毒的分子生物学研究。Am J Pathol 172: 1155-1170。
- 5.顾健，谢志刚，高志才，刘建辉，Korteweg C，等。(2007)H5N1病毒感染的分子病理学研究。柳叶刀370:1137-1145。
- 6.张泽峰，张建新，黄坤，李克胜，袁建基，等。(2009)甲型H5N1亚型禽流感病毒在人全身感染的研究。人类病理学40:735-739。
- 7.Gurkan UA, Akkus O(2008)骨髓的机械环境:综述。生物医学工程年鉴36:1978-1991。
- 8.瓦特FM，霍根BLM(2000)走出伊甸园:干细胞和它们的利基。科学287:1427-1430。
- 9.马侬C，弗雷内特PS(2008)造血干细胞贩运。StemBook。剑桥(MA)。
- 10.曼彻斯特M，史密斯KA, Eto DS, Perkin HB, Torbett BE(2002)麻疹病毒对人CD34+细胞的靶向和造血抑制。中国病毒学杂志(英文版):636 - 6642。
- 11.Musina RA, Bekchanova ES, Belyavskii AV, Grinenko TS, Sukhikh GT(2007)脐带血间充质干细胞。公牛Exp生物医学143:127-131。
- 12.NIH(2013)干细胞信息。成人干细胞。
- 13.Uccelli A, Moretta L, Pistoia V(2008)间充质干细胞在健康和疾病中的作用。自然评论免疫学8:726-736。
- 14.陈玲，Tredget EE，吴佩玉，吴勇(2008)间充质干细胞的旁分泌因子招募巨噬细胞和内皮系细胞并促进伤口愈合。PLoS One 3: e1886。
- 15.阿加瓦尔S, Pittenger MF(2005)人间充质干细胞调节异基因免疫细胞反应。《血》105:1815-1822。
- 16.柯西恩，范文杰，李文杰，等。(2006)人间充质干细胞对b细胞功能的调节作用。血107:367-372。
- 17.Spaggiari GM, Abdelrazik H, Becchetti F, Moretta L(2009)间充质干细胞通过选择性干扰未成熟DC的产生抑制单核细胞来源的DC成熟和功能:间充质干细胞来源的前列腺素E2的核心作用。血113:6576-6583。
- 18.间充质干细胞:炎症机制。年度Rev Pathol 6: 457-478。
- 19.张伯伦G, Fox J, Ashton B, Middleton J(2007)简要综述:间充质干细胞的表型、分化能力、免疫特征和归巢潜力。干细胞25:2739-2749。
- 20.肖皮塔亚苏农德，韩浩瓦库尔，王晓明，等。(2005)甲型H5N1型流感暴发的病原学研究，泰国，2004。新发传染病11:201-209。
- 21.李文杰，李志强，李志强，等。(2007)人树突状细胞对禽流感病毒感染的敏感性及其与干扰素α和TLR配体的关系。免疫学杂志179:5220-5227。
- 22.Nicholls JM, Bourne AJ，陈红，管毅，Peiris JS(2007)人呼吸道唾液酸受体检测:人禽流感病毒潜在结合位点广泛分布的证据。呼吸分辨率8:73。
- 23.陈晓明，陈晓明，陈晓明，等(2010)鸡肺间充质细胞的分离、鉴定及其对禽流感病毒的敏感性。发展比较免疫34:474-479。
- 24.Shahid MA, Abubakar M, Hameed S, Hassan S(2009)禽流感病毒(H5N1);理化因素对其生存的影响。病毒J 6:38。
- 25.Hoffmann E, Krauss S, Perez D, Webby R, Webster RG(2002)用于快速生成流感病毒疫苗的八质粒系统。疫苗20:3165-3170。
- 26.Suzuki Y, Ito T, Suzuki T, Holland RE Jr, Chambers TM，等(2000)唾液酸种类作为甲型流感病毒宿主范围的决定因素。病毒杂志74:11825-11831。
- 27.刘志强，李志强，李志强，等(2008)流感病毒对唾液酸组织分布的影响。流感其他呼吸道病毒2:147-154。
- 28.许鹏平，李明敏，张CY，吴ih，潘丽玲等。(2009)甲型流感病毒(H5N1)对原代人巨噬细胞促炎细胞因子的诱导作用受干扰素调节因子3和p38 MAPK的选择性调控。中华免疫杂志182:1088-1098。
- 29.潘丽丽，刘亚平，刘玉玲，等。(2002)甲型H5N1流感病毒诱导人巨噬细胞促炎细胞因子:人类疾病异常严重的机制?柳叶刀360:1831-1837。
- 30.孙丽娟，张晓娟，张晓娟，等。(2007)骨髓间充质干细胞在巨细胞病毒感染中的作用及其对造血、自我更新和分化潜能的影响。病毒学360:6-16。
- 31.Bego MG, St Jeor S(2006)人类造血起源细胞的巨细胞病毒感染:hcmv诱导的免疫抑制、免疫逃避和潜伏期。Exp血肿34:555-570。
- 32.Sinclair K, Yerkovich ST, Chambers DC(2013)间充质干细胞与肺。呼吸科学18:397-411。
- 33.顾健，谢震，高志，刘军，Korteweg C，等。(2007)H5N1病毒感染的分子病理学研究。柳叶刀370:1137-1145。
- 34.吴晓燕，王晓燕，王晓燕，等。(2005)甲型h1n1流感病毒在人体内的复制位点。新兴感染疾病11:1036-1041。
- 35.姚玲，薛伟，顾军(2008)h5n1感染和非感染人体组织中禽流感受体的表达。Faseb j 22: 733-740。
- 36.Friesenhagen J, Boergeling Y, Hrincius E, Ludwig S, Roth J，等(2012)高致病性禽流感病毒抑制人血源性巨噬细胞有效免疫应答。中华生物医学杂志92:11-20。
- 37.赵颖，陆敏，刘丽玲，陆娟，高志等(2008)中性粒细胞可能是人H5N1禽流感病毒复制和传播的载体。临床感染杂志47:1575-1578。
- 38.唐培，吕欣，莫肯·T, Zaki SR, Katz JM(2000)人分离的高毒力甲型H5N1流感病毒感染小鼠淋巴细胞耗竭和细胞因子产生减少。中国病毒学杂志74:6105-6116。
- 39.Hale BG, Albrecht RA, Garcia-Sastre A(2010)流感病毒的先天免疫逃避策略。未来微生物学5:23-41。
- 40.戴道治，杨春春，上田明，等。(2008)H5N1禽流感病毒诱导哺乳动物气道上皮细胞凋亡的研究。病毒杂志82:11294-11307。
- 41.李志强，李志强，李志强(2001)甲型流感病毒感染后人淋巴细胞凋亡。病毒杂志75:5921-5929。
- 42.辛纳特·J·Jr，米切利斯·M，杜尔·HW(2007)甲型H5N1禽流感的威胁:第二部分:致病性和病理线索。医学微生物学杂志(英文版)
- 43.de Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJD，等(2006)人甲型H5N1流感的致命结局与高病毒载量和高细胞活力血症相关。自然医学12:1203-1207。
- 44.Darwish I, Mubareka S, Liles WC，编辑。重症流感的免疫调节疗法。专家Rev反感染Ther 9:807 - 822。
- 45.Cardenes N, Caceres E, Romagnoli M, Rojas M(2013)间充质干细胞:急性呼吸窘迫综合征的一种有前途的治疗方法。呼吸85:267-278。
- 46.Nauta AJ, Kruisselbrink AB, Lurvink E, Willemze R, Fibbe WE(2006)间充质干细胞抑制CD34(+)来源的树突状细胞和单核细胞来源的树突状细胞的生成和功能。中国生物医学工程学报(自然科学版)，20(4):344 - 344。
- 47.Nemeth K, Leelahavanichkul A, Yuen PS, Mayer B, Parmelee A，等(2009)骨髓基质细胞通过前列腺素E(2)依赖性重编程宿主巨噬细胞增加白细胞介素-10的产生来减弱败血症。Nat Med 15:42 - 49。
- 48.陈伟文，张CY，崔文辉，曹文文，Nicholls JM，等。(2005)甲型流感(H5N1)病毒在原代人肺泡和支气管上皮细胞中诱导的促炎细胞因子反应。呼吸研究6:-。
- 49.潘丽敏，刘亚平，刘玉玲，等。(2002)甲型H5N1流感病毒诱导人巨噬细胞促炎细胞因子:人类疾病异常严重的机制?柳叶刀360:1831-1837。
- 50.于文伟，陈瑞伟，王娟，崔伟华，等。(2011)H5N1和H1N1流感病毒感染人原代肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞的病毒复制和固有宿主反应。病毒学报85:6844-6855。
- 51.Brandau S, Jakob M, Hemeda H, Bruderek K, Janeschik S，等(2010)组织间充质干细胞吸引外周血中性粒细胞并增强其炎症活性以应对微生物挑战。中华生物医学杂志88:1005-1015。
- 52.Fisman DN(2000)噬血细胞综合征和感染。新兴感染6:601-608。
- 53.李志强，李志强，李志强(2008)反应性噬血细胞综合征。印度儿科杂志75:1261-1263。
- 54.杜锦芳，陈普生，陈锦芳，李伟坤，林文英等(2001)甲型H5N1禽流感病毒致死性人类感染的病理学研究。医学病毒学杂志63:242-246。
- 55.沙巴提尼F, Petecchia L, Tavian M, Jodon de Villeroche V, Rossi GA，等(2005)人支气管成纤维细胞表现出间充质干细胞表型和多谱系分化潜力。实验室投资85:962-971。
- 56.Khatri M, Saif YM(2012)流感病毒体外感染骨髓间充质基质细胞:对骨髓移植的影响。细胞移植。