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研究文章

支气管血管生成中的趋化因子定位

摘要

肺部血管生成涉及全身支气管血管，当慢性炎症盛行时，血管生成尤为突出。肺缺血后新生血管形成的机制包括生长因子从缺血实质转运到上游支气管动脉，炎症细胞通过灌注动脉迁移/募集，以及肺细胞在左支气管内的旁分泌作用，左支气管是发生动脉生成的小生境。我们对大鼠左肺动脉结扎后左肺肺泡灌洗液(BAL)和左支气管匀浆液(LPAL)、缺血开始后(0 h)、6 h和24 h进行了分析。此外，我们还测试了地塞米松在早期降低炎症(0-24 h LPAL)和血管生成(3 d LPAL;支气管内皮细胞增生)和晚期(14d LPAL;血液流动)阶段。LPAL (6 h)后，BAL蛋白、总炎症细胞、巨噬细胞和多形核细胞显著增加。同时，促血管生成的CXC趋化因子在BAL和左主干支气管(CXCL1)或仅在支气管内(CXCL2)增加。地塞米松治疗减少BAL总蛋白、炎症细胞(总和多形核细胞)和CXCL1，但CXCL2未见减少。相比之下，支气管组织内的趋化因子、增殖的支气管内皮细胞或左肺的全身灌注均未见下降。 Our results confirm the presence of CXC chemokines within BAL fluid as well as within the left mainstem bronchus. Despite significant reduction in lung injury and inflammation with dexamethasone treatment, chemokine expression within the bronchial tissue as well as angiogenesis were not affected. Our results suggest that early changes within the bronchial niche contribute to subsequent neovascularization during pulmonary ischemia.

引用:杨晓明，杨晓明，杨晓明，等(2013)支气管血管生成的趋化因子定位。PLoS ONE 8(6): e66432。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432

编辑器:Charaf Benarafa，瑞士伯尔尼大学

收到:2013年1月16日;接受:2013年5月9日;发表:2013年6月11日

版权:©2013 Perino等。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。

资助:本研究由NIH NHLBI资助，RO1 HL088005。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

肺部的血管生成主要涉及全身血管系统，并在慢性炎症盛行的几种病理状态下变得突出，包括囊性纤维化[1]、哮喘[２]，肺纤维化[3]，肺癌[4]以及慢性肺血栓栓塞性疾病［5］，[6]．这一过程的病因在很大程度上是未知的，但提出的机制跨越机械应力的后果[7]，[8]，炎症组织重塑[9]，[10]，组织缺血导致生长因子释放[11]．因为新支气管动脉的血管扩张来自于现有的动脉，所以更具体地称为动脉发生。对于成熟支气管循环强大的血管生成能力知之甚少。因此，一个首要的挑战是确定由增加灌注需求刺激的信号等级。我们在大鼠模型中发表的工作表明，左侧肺动脉阻塞后，支气管循环发生大量增殖[12]，[13]促血管生成细胞因子及其g蛋白偶联受体参与了整个过程。具体来说，CXCR2 (cc -3)及其信号受体的参与已经得到证实，在使用CXCR2中和抗体治疗后，动脉生成显著减少[12]．趋化因子由几种细胞类型表达，包括中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞[14]- - - - - -[16]．然而，全身血管增殖的分子启动器的精确干部还没有解决。此外，驱动支气管动脉形成的具体信号定位尚不清楚。鉴于左肺动脉梗阻时发生实质缺血，目前尚不清楚生长因子如何推动上游支气管动脉有序的时空增殖。可能的机制包括生长因子通过流体运动从缺血实质转移，炎症细胞从缺血实质迁移或通过灌注动脉募集，以及左支气管内细胞的旁分泌作用(动脉发生的小生境)。本研究的目的是收集有关这三种潜在机制的信息，以更好地了解支气管动脉形成的早期启动者。

肺部血管生成已被证明主要是在炎症状态下诱导的[3]，[17]，[18]．与其他组织缺氧在诱导生长因子释放中起主要作用的器官不同，通风肺似乎对炎症细胞负担最敏感。其他研究表明，抗炎药物治疗可以限制血管生成[19]．合成糖皮质激素地塞米松已被证明可以在几种信号分子中调节促炎细胞因子，如CCL2 (MCP-1)和CXCL8家族的亚成员，其中CINC蛋白是成员[20]，[21]．在本研究中，我们还试图验证地塞米松治疗负向调节缺血肺炎症反应的有效性，并探索生长因子进入大支气管血管的机制。我们的结果证实了支气管肺泡灌洗液以及支气管组织中CXC趋化因子的存在。尽管地塞米松治疗显著减少了肺损伤和炎症，但支气管组织内趋化因子的表达以及血管生成没有受到影响。我们的结果表明，支气管组织本身的早期变化有助于肺缺血期间后续的新生血管。

方法

动物

我们的动物协议由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准(协议# RA11M47)。sd - dawley雄性大鼠(125-150克;哈兰，印第安纳波利斯，在)被麻醉，插管和通气(90次/分钟，8毫升/公斤/呼吸)与麻醉气体混合物(3%异氟醚在O2)．左肺动脉结扎(LPAL)如前所述[12]．在第四和第五肋间隙左外侧开胸后，结扎左肺动脉。关闭开胸，在切口处注射布比卡因(2 mg/kg)镇痛。在用甲基丙烯酰胺胶粘剂关闭皮肤切口后，给予丁丙诺啡(0.05 mg/kg ip)额外镇痛，将大鼠从呼吸机中取出，拔管，让其恢复。LPAL麻醉后，在规定时间后，对麻醉大鼠进行放血安乐死。

支气管肺泡灌洗

死后立即分离右肺，用室温PBS (3×1.0 ml)冲洗左肺。轻吸BAL液，记录总容积，计数总细胞数(亮线血细胞计;霍舍姆PA)。通过300个细胞/大鼠(Cytospin 4;山东，匹兹堡，PA和Diff-quick染色;Dade Bering，纽瓦克，DE)。BAL中总蛋白采用双辛酸法测定(BCA，赛默飞世尔科学公司，洛克福德，IL)。

定量实时RT-PCR

在肺实质剥离后，评估支气管组织内趋化因子CXCL1和CXCL2及其受体CXCR1和CXCR2 mRNA表达的变化。左支气管在TRIZOL (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY)中机械分离，总RNA(0.5µg)根据制造商的方案进行反转录(Qiagen, Valencia, CA)。定量PCR反应使用Quantitative SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA)和CFX96 cycler (Bio-Rad Laboratories, CA)，以1µl cDNA为模板，在25µl反应混合液中进行。在qPCR后进行熔解曲线测试，以确认存在一个代表单个扩增子的纯净熔解峰。数据归一化为单个样本中的Gapdh mRNA。

蛋白质

根据制造商的协议，通过ELISA (RCN100, RCN300, R and D Systems, Minneapolis, MN)量化LPAL后选定时间点的CXCL1和CXCL2在BAL和左支气管中的变化。采用BCA法测定总蛋白含量。对于左支气管冷冻切片(OCT)的免疫染色，用含有山羊血清、亲和素和生物素的阻断液(Invitrogen, Grand island, NY)阻断上皮细胞Epcam、CXCL2、CXCR2和内皮细胞RECA-1，并用抗体(Epcam/G8.8克隆，Biolegend, San Diego,CA;Gro-beta #ab97777, Abcam，，剑桥，马萨诸塞州;CXCR2 #ab14935, Abcam，和RECA-1 # MCA970GA, Serotec, Raleigh, NC。清洗后，切片用生物素抗兔抗体孵育，然后用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594标记链霉亲和素，并用DAPI(均来自Invitrogen)反染。以无一抗染色组织为对照。使用Olympus IX51显微镜和SensiCam高性能数码相机(Cooke, Auburn Hills, MI)对切片进行可视化和拍照。

支气管内皮细胞增殖

将支气管内皮细胞增殖的形态计量学评估作为LPAL后3 d早期血管生成的指标。气管内灌注10%福尔马林(20cmh)固定肺2从分离的左肺12个不同区域取连续切片。在苏木精和伊红(H&E)染色切片中发现与气道相关的支气管血管，并对伴随的系列切片进行增殖细胞核抗原(PCNA)评估+)血管，而观察者对动物治疗视而不见。对显示PCNA阳性/阴性内皮的血管进行评分。每个肺的阳性血管百分比平均，并被认为是特定大鼠肺的代表。

晚期功能性血管生成

LPAL后14 d，使用荧光微球(15µm;Invitrogen, Eugene, OR)。麻醉大鼠，按上述方法通气，左侧颈动脉插管，输注50万微球。大鼠采用放血安乐死，切除左肺。在染料提取后，测定滞留微球的荧光(荧光分光光度计;Digilab, Holliston, MA)并归一化至全注入。

地塞米松治疗

LPAL前24 h，大鼠给予糖皮质激素地塞米松-2-磷酸(Sigma, D1159, 1 mg/kg iv)或其载体(生理盐水，n = 4/组)。这个剂量是根据Hsieh的工作选择的[20]并在初步实验中适应于限制缺血损伤所需的最低有效剂量(BAL蛋白)。为了通过组织学评估增殖内皮，在LPAL后24小时给予额外的地塞米松治疗(1mg /kg静脉注射)。对LPAL后14 d的功能性血管生成进行评估，在LPAL后1、4、(1 mg/kg静脉注射)、7、10和13天(0.5 mg/kg静脉注射)给予额外治疗。

统计分析

结果以均数±标准误差表示。数据分析采用Kruskal-Wallis检验，事后分析采用Dunn's多重比较检验，除了血流量测量和地塞米松治疗后变化百分比(Mann-Whitney为非配对比较)，总蛋白与地塞米松治疗(2-way ANOVA)。计数数据使用平方根变换进行转换。P<0.05被认为有统计学意义。

结果

肺循环障碍可引起左肺实质和左支气管的改变

测定LPAL后即刻(0 h)、6 h、24 h BAL中总蛋白(µg/ml)变化的时间进程(n = 6 ~ 19只大鼠/时间点;P<0.0001 0 h vs 6 h, P<0.05 0 h vs 24 h)图1与0小时对照水平相比，总蛋白质含量在6小时内大幅增加(增加300%)，并在24小时内保持显著升高(增加200%)。为了确定LPAL后24小时内的急性炎症反应，还测定了同一时间BAL中促炎细胞因子CXCL1和CXCL2的含量(pg/ml)。CXCL1蛋白表现出与总蛋白含量相同的趋势，在LPAL 6小时达到最大值(P<0.05)，然后在LPAL 24小时下降至基线。相反，CXCL2在24小时呈上升趋势，然而，这些变量变化不具有统计学意义(图2)．CXCL1和CXCL2的总趋化因子负荷大致相当，平均约为400 pg/ml。在同一时间内，BAL的炎症细胞剖面表现出类似的模式，早期显著增加6小时，24小时恢复到0小时对照水平(图3)．对细胞差异的评估表明，6小时时的增加是由于多形核白细胞(PMN;P<0.0005)代表平均为10000%，巨噬细胞(P<0.05)代表平均约为200%。淋巴细胞占总细胞的比例很小，在LPAL后24小时内无明显变化。

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图1所示。LPAL后24小时内BAL总蛋白的时间过程(BCA测定)。

LPAL在6 h时早期升高(20只/组，***P<0.001)， 24 h时继续升高(18只/组，*P<0.05)。地塞米松抗炎治疗可显著降低LPAL 6 h和24 h总蛋白含量(11-12只大鼠/时间点，＃P < 0.05)。*P测量值vs 0 h LPAL，＃测量P与时间匹配的未处理P。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g001

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图2。CXCL1和CXCL2细胞因子在BAL中的时间进程。

CXCL1在LPAL后6 h显著升高，在LPAL后24 h下降(8-11只大鼠/时间点，*P<0.05 vs 0 h)， CXCL2无明显变化(13只大鼠/时间点)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g002

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图3。LPAL后24小时内BAL的炎症细胞分布。

在LPAL 6 h时，细胞总数(A)显著增加(10只/组，*P<0.05);在LPAL 24 h时，细胞总数(A)显著减少(3只/组)，恢复到基线(0 h LPAL)。巨噬细胞(B)数量(3-8只/组，*P<0.05)，中性粒细胞/ pmn数量(6-11只/组，***P<0.0001)也有相同趋势。同期淋巴细胞(D)无变化(3-7只/组)。P测量值与0小时LPAL。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g003

为直接评价支气管组织间室，在同一时间点(n = 3-4只大鼠/时间点)测定趋化因子mRNA和蛋白。为了确保左肺动脉结扎引起的特异性反应可能预测左肺血管新生，在左支气管和对照右支气管中评估趋化因子信息的时间过程。CXCL1基因表达在左右支气管均显著增加6 h (P<0.01)，提示对手术/麻醉的非特异性反应。然而，LPAL后6 h，仅左支气管CXCL2较0 h或6 h时右支气管CXCL2明显增加(P<0.05)。LPAL后6 h, CXCL1和CXCL2蛋白均在左侧支气管组织中表达(P<0.05)。寻找左支气管特异CXCL2蛋白的细胞来源，LPAL后6h取冰冻切片。图4 d显示CXCL2表达与气道上皮细胞标志物Epcam共定位。

缩略图
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图4。CXCL1和CXCL2细胞因子mRNA (A, B)，左支气管蛋白水平(C)和(D) LPAL后6小时的左支气管冷冻切片，CXCL2(红色)和上皮细胞标记物Epcam(绿色;100倍原始放大，插图:600倍原始放大)双重染色。

CXCL1 (A)和CXCL2 (B) mRNA和CXCL1和CXCL2蛋白水平(C)在LPAL 6小时升高(*P<0.05)，并在LPAL 24小时恢复到基线(3-4只大鼠/时间点)。上皮细胞(Epcam，绿色)和抗CXCL2(红色)染色共定位提示气道上皮细胞是CXCL2的主要来源。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g004

CXCL1和CXCL2信号被激活时，CXCR1和CXCR2受体mRNA水平的分析显示，在左支气管中，仅CXCR2在6小时时增加(增加300倍，P<0.05)。CXCR1或右支气管中的任何一种受体均未发生变化，这表明CXCR2在LPAL后的早期反应中起主要作用。LPAL后6小时左支气管冷冻切片图像证实CXCR2与支气管内皮共定位(RECA-1+) (图5 c)．

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图5。CXCR1(A)和CXCR2 (B) mRNA在左右支气管，CXCR2与RECA-1+上皮下血管共定位(C)。

CXCR2仅在左支气管有显著变化(0 h时*P<0.05，右支气管##P<0.01)。LPAL后6h左支气管冰冻切片显示抗cxcr2(红色)与RECA-1+上皮下血管共定位(绿色:100倍原放大，插入600倍原放大)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g005

地塞米松治疗限制肺缺血损伤

抗炎地塞米松治疗可减少BAL总蛋白外渗图1(11个老鼠/组)。时间(P<0.005)和治疗(P<0.016)对6小时至24小时间BAL蛋白均有显著影响，通过通透性变化评估，表明损伤显著减少。地塞米松治疗后测定大鼠BAL CXCL1和CXCL2水平，LPAL后6 h CXCL1蛋白显著降低(平均降低50%;7只/组，P<0.05)。与中提供的数据相比，没有观察到额外的变化图2．在炎症细胞分布方面，地塞米松治疗降低了LPAL 6 h BAL的总细胞数量(减少50%，8只/组，P<0.05)。这一变化是由于PMN显著减少(减少85%;9只/组，P<0.05)和淋巴细胞(减少90%;9只/组，P<0.05)。地塞米松治疗对本研究评估参数的显著影响总结在图6并显示为LPAL后6小时与载体处理值的百分比变化。然而，地塞米松治疗对左支气管CXCL1或CXCL2 mRNA和蛋白的表达及左支气管CXCR1和CXCR2 mRNA的表达均无显著影响(图6B和6C；3 - 4大鼠/组)。

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图6。地塞米松对实质和气道细胞及细胞因子/受体的影响。

(A)地塞米松对反映肺泡腔内变化的测量参数的平均影响的总结。每个柱状图代表地塞米松处理大鼠LPAL后6 h与空白处理大鼠相比的平均下降%(3-11只/组，*P<0.05)。c。地塞米松治疗对LPAL后6h左支气管CXCL1、CXCL2 (mRNA, protein)、CXCR1和CXCR2 (mRNA)表达的平均影响。地塞米松对支气管测量的任何变量均无显著影响(3-4只大鼠/组)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g006

炎症反应的负性调节不足以减少支气管血管生成

为了确定地塞米松是否影响肺缺血后的支气管新生血管，我们在LPAL后早期(3 d, n = 3 - 5个肺/组)和后期(14 d, n = 4-5个/组)测量了支气管血管内皮的增殖状态。图7示有代表性的气道壁图像(200倍原始放大)，显示支气管血管和相关的阳性PCNA染色。平均25±3个气道/肺被研究，平均205±20个支气管血管被评估支气管内皮细胞增殖。对照组肺代表接受假手术(无LPAL的开胸手术)大鼠的左肺，由于它们没有区别，因此将它们与假手术和LPAL大鼠的右肺分组。LPAL引起PCNA含量显著增加+血管(P < 0.008,图7 b)．用地塞米松治疗大鼠对LPAL后3 d评估的增殖支气管血管比例无显著影响(p>0.05 LPAL vs LPAL + dex)。通过将荧光微球注入体循环，定量LPAL后左肺灌注的功能性血管。组织采集后左肺荧光检测显示地塞米松治疗未改变功能灌注(图8)．这些大鼠在整个14 d的疗程中接受了额外的治疗。尽管有这种额外的治疗，血管生成仍然保持在飞行器控制水平。

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图7。增殖支气管血管的改变。

(A) H&E显示支气管血管的气道组织学切片(左图)和PCNA染色的连续切片(右图)。支气管血管可见丰富的PCNA+内皮细胞。(B) LPAL后(3 d)， PCNA的比例显著增加+观察支气管血管。地塞米松治疗对该增殖指数无显著影响。对照组包括假肺和右肺(3-5只/组，**P<0.01)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g007

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图8。LPAL后14 d荧光微球灌注评估功能血管生成地塞米松治疗对支气管血管生成的大小无显著影响(n = 4-5 /组)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066432.g008

讨论

肺部血管生成是由炎症引起的，特别是CXC趋化因子的上调[3]，[22]- - - - - -[25]．它们的促血管生成作用已在许多研究中得到证实[26]- - - - - -[28]我们实验室的工作表明，细胞因子CXCL2及其高亲和受体CXCR2参与了肺缺血后支气管血管生成的整个过程。过去的研究表明，肺总CXCL2在缺血开始后的第一天内增加，抗cxcr2对支气管血管生成有抑制作用[12]，[29]．然而，导致支气管动脉形成的CXC趋化因子在肺内的定位和时间调节尚不清楚。此外，肺实质生长因子如何激活上游支气管血管生成尚不清楚。因此，本研究旨在检测肺缺血(0-24 h)后CXC趋化因子的早期表达，特别关注CXCL1和CXCL2在BAL液和气道组织中的表达时机和局部表达。此外，我们研究了抗炎治疗在限制局部细胞因子水平(BAL和气道组织)方面的有效性，并将这种影响与支气管血管新生的程度联系起来。我们的数据表明，两种趋化因子都存在于肺腔室中。然而，CXCL1和CXCL2调制模式在分析的两个位置是不同的。CXCL1的释放似乎更多地与损伤和麻醉/手术有关。此外，抗炎治疗仅影响肺损伤程度、BAL CXCL1水平和BAL炎症细胞。支气管组织内的趋化因子表达水平没有变化，重要的是，血管生成的大小也没有变化。 In conclusion, results suggest that early changes within the bronchial niche where arteriogenesis originates, contribute to subsequent neovascularization during pulmonary ischemia.

我们最初的实验评估BAL含量作为主要实质反应的指标。在这个模型中，我们假设肺泡液可以通过粘液纤毛运动重新分配并作为生长因子的管道。我们证明急性缺血引起BAL总蛋白早期升高提示急性肺损伤。这些渗透性变化是实质性的(增加了3倍)，早期，似乎在缺血发作后24小时减弱。我们之前已经表明，LPAL后14 d渗透率再次发生变化[12]，[29]．此外，炎症细胞反应与蛋白泄漏平行，可能反映了由于缺乏肺血流量，在这个时间点只有小的支气管血管而存在的驻留细胞。具体来说，炎症细胞的特征显示，中性粒细胞和巨噬细胞占主导地位，除了上皮细胞外，它们还具有分泌CXCL1和CXCL2趋化因子的能力[30]．尽管CXCL1在LPAL后6小时显示出可重复的增加，但BAL CXCL2的变化不一致。CXCL1的测量也被包括在内，因为最近的研究表明，这两种趋化因子都可以在血管生成信号传导中发挥作用[31]，[32]．然而，考虑到3个时间点(0,6和24 h)蛋白质和炎症细胞的变化模式，CXCL1的出现似乎反映了损伤。在我们之前的研究中，左肺匀浆在4 - 24小时内显示出显著增加，但我们没有看到早期CXCL2的强劲增长，这有点令人惊讶[12]．这一观察提示BAL液可能不能完全反映肺实质变化。

为了更具体地检查支气管血管起源的小生境，我们还研究了包括左主干支气管的组织。我们评估了支气管组织中CXCL1和CXCL2细胞因子信使RNA和蛋白质的表达。结果表明，CXCL1和CXCL2蛋白表达均在缺血后6 h升高。然而，由于我们看到右支气管也显示CXCL1基因表达增加，我们认为这是对手术和/或麻醉的更普遍的反应。有趣的是，CXCL2及其主要受体CXCR2仅在左侧支气管表达，而左侧支气管是随后发生动脉形成的部位。这一观察结果表明，左支气管局部细胞分泌CXCL2可发挥旁分泌作用，并启动生长级联。CXCL2免疫染色显示上皮细胞可能是导致所测变化的趋化因子来源。然而，局部炎症细胞的贡献，特别是巨噬细胞和中性粒细胞，需要进一步评估。肺缺血如何刺激大气道内CXCL2的上调机制尚不清楚。鉴于CXCL2及其上皮细胞源中观察到的增加，目前尚不清楚为什么在BAL液中没有看到这种趋化因子的增加。 This apparent inconsistency might suggest the existence of a positive feedback among members of the CXC family. For example, Zhang and colleagues showed different compartmentalization of CXCL1 and CXCL2 in a rat model of intratracheal LPS challenge[33]．他们的结果表明，个别CXC趋化因子受到特异性调控，并可能在肺泡间隙和支气管组织中具有不同的作用。此外，Zamjahn和同事已经证明，CXCL1在血浆和血液中的清除率分别比CXCL2高出7倍和4倍以上。这表明尽管分子大小相似，但CXCL1和CXCL2穿过肺上皮/内皮屏障的通量不同[34]．Cai和同事发现CXCL1对CXCL2和其他细胞因子(如CXCL5)的局部表达很重要[35]．这些数据将CXC家族的其他成员添加到复杂的场景中。当考虑到CXCL2对CXCR2的亲和力比CXCL1的亲和力高72倍时，就增加了额外的复杂性[36]- - - - - -[38]．我们的研究结果表明，CXCL2及其主要受体CXCR2在左支气管中有独特的上调，进一步支持这种细胞因子受体对在气道重塑中很重要。

最后，我们进行了抗炎治疗以减少初始炎症反应，试图将趋化因子表达的减弱与血管生成反应联系起来。全身性炎症已被证明是有效地减少糖皮质激素地塞米松。具体来说，Sevaljevic和同事已经证明，地塞米松治疗会负向调节促炎CXC趋化因子[39]．此外，一些作者已经证明了其抗血管生成的作用[40]- - - - - -[42]．Nakao及其合作者特别指出，地塞米松(10mg /kg i.p.)在炎症性角膜血管生成模型中抑制血管生长[41]．此外，Yao和同事还证明了它可以逆转肺支原体感染小鼠的气管血管重塑(4.8 mg/天，滴眼液)。[42]．在LPAL模型中，地塞米松预处理可有效减少缺血损伤，其剂量(1 mg/Kg)甚至低于先前显示的有效下调趋化因子水平[20]．然而，只有BAL趋化因子和炎症细胞受到影响。支气管组织内的趋化因子表达水平没有变化，重要的是，血管生成的大小也没有变化。具体而言，地塞米松治疗导致BAL总蛋白、总炎症细胞、CXCL1蛋白显著降低，但CXCL2或巨噬细胞未见明显降低。支气管中的趋化因子表达不变。此外，在之后的时间点，无论是支气管内皮细胞增殖(3 d)还是支气管肺灌注(14 d)，都没有观察到任何影响。之前，我们已经在功能齐全、灌注的血管系统建立的晚期时间点测量了血管生成。虽然我们在本研究中也应用了荧光微球技术，但我们也检查了LPAL后3 d支气管内皮细胞的增殖情况。这种额外的方法旨在通过气道形态测量来量化早期血管生成。结果显示，LPAL后的支气管血管中PCNA的数量始终较高+内皮细胞比假对照组或右支气管内皮细胞多。然而，地塞米松治疗并没有减少这种内皮细胞的增殖，也没有改变血管生成，即使之前已经显示出限制BAL液体成分进入支气管血管的有效性。此外，发生在动脉发生起始的支气管小生境内的早期信号似乎也没有改变。基于这些结果，我们认为局部支气管组织环境在诱导特定生长因子对肺缺血后的新生血管形成起重要作用。

总之，我们的结果证实了在BAL液和左主干支气管内存在CXC趋化因子。尽管地塞米松治疗显著减少了肺损伤和炎症，但支气管组织内CXCL1和CXCL2趋化因子的表达以及血管生成均未受到影响。我们得出结论，在肺缺血期间，支气管生态位内早期和特异性的变化选择性地促进了随后的新生血管。

作者的贡献

构思并设计实验:MGP EMW。进行实验:MGP AM JJ EMW。分析数据:MGP AM EMW。撰写论文:MGP EMW。

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