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研究文章

幼儿上呼吸道病原体之间的联系:病毒和细菌之间的相互作用

摘要

背景

在健康儿童的上呼吸道中可以检测到高比率的潜在致病菌和呼吸道病毒。调查健康个体中这些病原体的存在及其之间的联系仍然是一个相当未开发的研究领域，但可能对解释疾病期间的发现有影响。

方法/主要结果

我们从参加随机对照试验的433名6至24个月健康儿童中选择了986份鼻咽样本。我们使用实时PCR检测了20种常见呼吸道病毒的存在。链球菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌，莫拉克斯氏菌属复活而且金黄色葡萄球菌采用常规培养方法鉴定。通过问卷调查获取危险因素信息。我们进行了多变量逻辑回归分析，然后进行部分相关分析，以确定整体的关联模式。肺炎链球菌殖民与动物的存在呈正相关流感嗜血杆菌(调整后优势比1.60,95%置信区间1.18-2.16)，复活的(1.78, 1.29-2.47)、人鼻病毒(1.63,1.19-2.22)和肠道病毒(1.97,1.26-3.10)呈负相关金黄色葡萄球菌存在感(0.59,0.35-0.98)。流感嗜血杆菌与人鼻病毒(1.63,1.22-2.18)和呼吸道合胞病毒(2.78,1.06-7.28)呈正相关。复活的冠状病毒(1.99,1.01-3.93)和腺病毒(3.69,1.29-10.56)与定殖率呈正相关，与定殖率呈负相关金黄色葡萄球菌车厢(0.42,0.25-0.69)。我们观察到两者之间有很强的正相关金黄色葡萄球菌流感病毒(4.87,1.59-14.89)。此外，人鼻病毒与肠道病毒呈正相关(2.40,1.66-3.47)，肠道病毒与人博卡病毒、WU多瘤病毒、副流感病毒和人parechovirus也呈正相关(2.40,1.66-3.47)。人鼻病毒与冠状病毒呈负相关。

结论/意义

我们的数据显示，在健康儿童中，病毒和细菌患病率较高，细菌-细菌、病毒-细菌和病毒-病毒之间存在明显的关联，这暗示了上呼吸道微生物群落的复杂性和潜在动态。在将微生物的存在与特定的呼吸道疾病联系起来时，这一点值得仔细考虑。

引用:van den Bergh MR, Biesbroek G, Rossen JWA, de Steenhuijsen Piters WAA, Bosch AATM, van Gils EJM，等(2012)幼儿上呼吸道病原体的相关性:病毒与细菌的相互作用。PLoS ONE 7(10): e47711。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711

编辑器:Lynette Kay Rogers，美利坚合众国俄亥俄州立大学

收到:2012年6月19日;接受:2012年9月13日;发表:2012年10月17日

版权:©van den Bergh et al。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。

资助:这项工作由荷兰科学研究组织通过NWO-VENI赠款91610121,ZonMW赠款91209010和荷兰卫生部支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益冲突:DB宣称从辉瑞公司收取了咨询费。EAMS宣布获得了辉瑞和百特的无限制研究支持，辉瑞和葛兰素史克的咨询费，辉瑞的讲课费，以及辉瑞和葛兰素史克对疫苗研究的资助。RHV宣布已获得葛兰素史克公司和辉瑞公司的疫苗研究支持和葛兰素史克公司的咨询费。本文所述的研究没有收到此处列出的任何费用或补助金。对于所有其他作者，没有利益冲突声明。这并不会改变作者对PLOS ONE关于共享数据和材料的所有政策的遵守。

简介

科赫最初的假设旨在将一种致病微生物与一种特定疾病联系起来，自1884年提出以来，一直受到重新考虑[1]- - - - - -[3]．事实上，当科赫发现霍乱病原体也可以无症状传播时，他自己就放弃了他的第一个假设[1]．从那时起，人们越来越多地认识到，包括中耳炎和肺炎等呼吸道感染在内的人类疾病是多微生物的，是病原体之间协同和拮抗相互作用的结果[4]，［5］．

人类鼻咽部被认为是呼吸道感染起源的生态位[6]．鼻咽微生物群的几个居民，包括链球菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌，莫拉克斯氏菌属复活而且金黄色葡萄球菌是儿童疾病的主要诱因。然而，它们也很常见，是健康儿童鼻咽的短暂殖民者，特别是在免疫系统仍在成熟的年幼儿童中。这个生态位在上呼吸道的定植似乎是一个获取和清除各种微生物的动态过程，在此过程中，它们与宿主、其成熟的免疫系统以及彼此相互作用[6]．在平衡状态下，这种细菌生态系统被认为对健康有益，例如通过刺激免疫系统，并作为抵御病原体入侵的保护屏障[7]．

在健康儿童的鼻咽样本中也经常能检测到病毒[8]- - - - - -[10]．新细菌或病毒的获得可能会破坏这个生态系统的平衡，病原体可能有机会入侵、传播并引起急性中耳炎、肺炎甚至脑膜炎等疾病[4]．重要的是，接触病毒和细菌的动态受到环境因素的影响，比如日托中心拥挤或兄弟姐妹生活在同一个家庭[6]．了解健康儿童鼻咽中细菌和病毒的流行情况以及这些病原体之间的具体联系对于解释疾病期间的发现并最终更好地理解呼吸道感染的发病机制非常重要。然而，这仍然是一个相当未开发的研究领域。

在这里，我们描述了对986个参加肺炎球菌疫苗接种试验的6至24个月健康儿童鼻咽拭子样本的事后分析结果。我们旨在评估广泛的常见呼吸道病毒的流行情况，以及临床实践中最常检测到的四种细菌病原体的共存模式(肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，复活的而且金黄色葡萄球菌)，同时考虑到详细描述的流行病学和环境决定因素。

材料与方法

道德声明

来自荷兰的一个公认的独立伦理委员会(Stichting Therapeutische Evaluatie Geneesmiddelen)批准了该研究方案。该试验是根据欧洲良好临床实践声明进行的，其中包括赫尔辛基宣言的规定。在入组前获得每位受试者父母或法定监护人的书面知情同意。

研究人口与设计

我们从参与随机对照试验的儿童中选取了986个鼻咽样本(ClinicalTrials.gov Identifier NCT00189020)。[11]．该试验于2005年7月至2008年2月在荷兰进行，旨在评估减少剂量的7价肺炎球菌结合疫苗(PCV-7)对鼻咽肺炎球菌定植的影响。该试验和细菌携带率的细节之前已经报道过[11]- - - - - -[13]．简而言之，共有1003名健康婴儿入选，并随机分配(1)在2和4个月大时注射PCV-7，(2)在2、4和11个月大时注射PCV-7，或(3)不注射PCV-7(对照组)。在6周、6个月、12个月、18个月和24个月的儿童家中进行访问，获取鼻咽样本。孩子们在他们被拜访的时候通常是健康的。，visits were postponed when parents deemed their child unfit for the study procedures, for example in case of fever or acute symptoms of an infection. At each visit, a questionnaire collecting information on day care attendance, the presence of siblings, and administration of antibiotics was obtained from the parents.

在本研究中，鼻咽样本是从未接种疫苗的对照组和2+1剂量计划组的儿童中选择的，基于剩余材料的足够数量。最终，分析了来自2+1剂量组的497个样本和来自对照组的489个样本。这986个样本来自总共433名儿童:212个来自6个月和18个月大的同一儿童的配对样本，121个来自12个月和24个月大的同一儿童的配对样本，74个儿童的样本在四个连续的时间点收集，而另外26个儿童只使用了一个样本。

鼻咽样本和实验室程序

鼻咽样本由训练有素的研究人员根据世界卫生组织标准程序，用柔性无菌拭子经鼻采集(经鼻过鼻平原，医疗电线和设备公司，Corsham Wiltshire, England)[14]．培养和细菌鉴定按照标准程序进行，如前所述[11]- - - - - -[13]．电镀后，拭子在1ml生理盐水中冲洗，并在−80°C保存，直到进一步分析。

如前所述，使用MagNa纯LC全核酸分离技术(罗氏诊断公司，瑞士巴塞尔)从200 μ L拭子“冲洗”溶液中提取核酸[15]．样本采用针对人博卡病毒、多瘤病毒(WU和KI)、呼吸道合胞病毒(A和B)、人流感病毒A和B、副流感病毒1-4、人鼻病毒、腺病毒、人冠状病毒OC43、NL63、HKU和229E、人偏肺病毒、人parechovirus和肠病毒的实时PCR检测。本研究中使用的引物、探针和PCR检测条件先前已详细报道[15]- - - - - -[17]．在831个样本的亚组中确定了人异状病毒和肠道病毒的存在，因为剩余的核酸数量有限，无法进行这些最后的测试。

统计分析

细菌定植率定义为常规培养的鼻咽样品中某一特定细菌阳性的比例。同样，病毒检出率被定义为实时PCR检测特定病毒阳性样本的比例。为了便于统计分析，循环阈值(Ct)值被一分为二，并将属于特定组的不同亚型病毒(如副流感病毒)合并。Ct值<45定义为阳性，即，如果样品在45个循环后未变为阳性，则定义为不存在检测的病毒。

首先，我们探讨了四种细菌之间以及每种细菌与细菌定植风险因素之间的单因素相关性。、年龄、是否有兄弟姐妹、日托人员、最近使用抗生素(即取样前两个月内)以及接种PCV-7疫苗。我们计算了每种细菌与另一种细菌(或风险因素)共存的风险和95%置信区间(CI)，相对于在不存在另一种细菌(或风险因素)的情况下存在该细菌。类似地，我们评估了每种细菌与特定病毒(或合并的亚型组)的共存情况。再一次，我们计算了当一种特定病毒(或合并的亚型组)相对于没有该病毒的每种细菌同时出现时，每种细菌存在的风险和95% CI。

接下来，我们使用逻辑回归模型来检验细菌分离、病毒检测和危险因素之间的独立关联。在单因素回归分析中P值<0.1的所有相关性随后进入多因素回归模型。我们验证了各个模型中包含的每个协变量的年龄相关分布，结果证明是线性的。因此，年龄作为连续变量进入模型。计算调整后的优势比与他们的95% CI。为了在包括肠道病毒和人parechovirus的模型中保持足够的统计能力，缺失值由单一imputation程序来估算，这在我们的研究中缺失值的数量有限的情况下是足够的[18]．我们使用重复测量模型验证了我们的主要分析，该模型考虑到每个儿童使用具有自回归相关结构的广义线性模型进行多次测量[19]．结果几乎相同，表明潜在的人内依赖性并没有实质性地影响我们估计的准确性。本文给出了初步分析的结果。所有这些分析均使用SPSS Statistics version 17.0进行。

最后，所有在多变量分析中发现有统计学显著相关性的变量随后被输入一个单一的偏相关矩阵。该分析确定了矩阵中任意两个给定参数之间的所有独立相关性，在修正了以p值为0.01和0.05作为截止值的其余变量之后。该分析在软件包R 2.7 (function cor2por [package for R;可以在:http://cran.r-project.org/web/packages/corpcor/index.html])，并使用Cytoscape (version 2.7)中的复杂网络分析进行可视化。[20]．不同显著性水平上的相关性是可视化的，而不是对多重比较进行校正。尽管如此，对这些重大结果的解读仍应谨慎。

结果

儿童鼻咽细菌定植及病毒检出率特点均显示在表1．本研究中的细菌定植率与主要试验的结果相似[11]- - - - - -[13]．在近70%的样本中检测到呼吸道病毒，29%的样本显示出多种病毒的证据。检测到人鼻病毒的频率最高，在样本中占31%至50% (表1)．

缩略图
下载:
表1。儿童鼻咽细菌定植及病毒检出率特点。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711.t001

单变量分析的结果在支持信息(S1的数据而且S2)．总而言之,肺炎链球菌流感嗜血杆菌而且复活的相互之间呈正相关(图S1A-C)，而它们都与金黄色葡萄球菌（图S1D)．日托服务和家中兄弟姐妹的存在与所有细菌定植的风险增加有关，除了金黄色葡萄球菌（图S1)．最近使用抗生素与肺炎球菌定植的风险显著降低有关，PCV-7疫苗接种也是如此，这与先前描述的结果相一致[11]．一般来说,肺炎链球菌，流感嗜血杆菌,复活的更有可能与(多种)呼吸道病毒(图S2A-C)．

在多变量分析中，我们观察到肺炎链球菌殖民和存在流感嗜血杆菌而且复活的、是否有兄弟姐妹、日托人员、人类鼻病毒和肠道病毒(表2)．金黄色葡萄球菌在多变量分析中，携带、近期抗生素使用和PCV-7疫苗接种与肺炎球菌定殖呈负相关。我们发现最流行的呼吸道病毒与肺炎球菌疫苗或非疫苗血清型共同出现的风险之间没有重大差异。同样，我们在疫苗接种状态的分层分析中没有发现差异。流感嗜血杆菌殖民与动物的存在呈正相关肺炎链球菌人类鼻病毒和呼吸道合胞病毒，兄弟姐妹的存在，日托人员。复活的殖民仍然与存在正相关肺炎链球菌、冠状病毒、腺病毒以及兄弟姐妹的存在。两者之间呈负相关复活的而且金黄色葡萄球菌，其调整后的优势比甚至比之间的优势比还要大金黄色葡萄球菌而且肺炎链球菌殖民(0.42vs分别为0.56)。存在之间的正向关联金黄色葡萄球菌合并的流感病毒组在多变量模型中持续存在(表2)．

缩略图
下载:
表2。分布和调整后的优势比a、b对于鼻咽细菌定植，与其他每种细菌、呼吸道病毒和危险因素同时发生。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711.t002

中显示了与最常检测到的病毒独立关联的多变量模型表3．人鼻病毒与兄弟姐妹以及肠道病毒的存在呈正相关，与冠状病毒呈负相关。此外，肠道病毒与人博卡病毒、WU多瘤病毒、副流感病毒和人parechovirus的存在呈正相关。人类博卡病毒也与日托服务和WU多瘤病毒的存在有关(表2)．

缩略图
下载:
表3。分布和调整后的优势比a、b对于鼻咽存在最常见的病毒，与其他呼吸道病毒、细菌和危险因素共同发生。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711.t003

图1图解总结了偏相关网络分析的结果。多变量分析显示的显著相关性在偏相关网络分析中均持续存在(图1一个)．同时根据驾驶风险因素进行调整时(图1 b)所有的相关性都保持不变，除了之间的相关性流感嗜血杆菌而且复活的(P = 0.17)，之间复活的冠状病毒(P = 0.064)。

缩略图
下载:
图1所示。交互模式的图形表示。

细菌和病毒(A)与这些相互作用的流行病学驱动因素(风险因素)之间的部分相关性的可视化(B)。这里描述的模式来自部分相关网络分析，并通过Cytoscape进行可视化。蓝色表示细菌，橙色表示呼吸道病毒，灰色表示危险因素。实线表示p值小于0.01的关联，虚线表示p值在0.01到0.05之间的关联。绿线表示正相关变量;红线表示负相关。线的粗细表示相关的大小。缩写:SP,肺炎链球菌；你好,流感嗜血杆菌；MC,复活的；SA金黄色葡萄球菌；HRV，人鼻病毒，EV，肠病毒;HBoV，人博卡病毒;WUPyV, WU多瘤病毒;HCoV，人类冠状病毒;副流感病毒;HAdV，人腺病毒;四、流感病毒;HPeV，人parechvirus;RSV，呼吸道合胞病毒; AB, antibiotic use within 2 months before sampling; ‘crowding’ was entered into the model as a variable combining the presence of siblings (yes/no) and day care attendance (yes/no); 0 = no siblings and no day care attendance, 1 = siblings present, but not attending day care, or vice versa, and 2 = siblings present and attending day care.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711.g001

讨论

据我们所知，这是首次通过多元和偏相关网络分析，在健康幼儿的鼻咽样本中研究四种潜在致病菌和20种常见呼吸道病毒的共现模式。后者可以从直升机视角观察复杂群落中微生物之间可能的相互关系，同时校正重要的流行病学和环境决定因素的影响[21]．即使在健康状态下，我们也发现了病毒和细菌病原体之间的许多特定联系，这些联系可能在当地生态系统动态中发挥重要作用。这些发现可以指导未来的研究，以寻求可能的潜在机制及其在呼吸道疾病发病机制中的作用。

我们研究中的细菌检出率与以前在幼儿中的研究相当[11]- - - - - -[13]．此外，我们研究中的病毒检出率与以前的报告相当[9]，[10]．来自无症状儿童的样本中大量存在病毒，提出了一个问题，即阳性结果是否可以被视为呼吸道疾病症状的原因。显然，某些病毒，如呼吸道合胞病毒和流感病毒，能够自行引起疾病[9]．对于更常见的“携带”病毒(如鼻病毒、人博卡病毒、WU多瘤病毒)，有人建议，不仅需要存在，而且需要一定的病毒载量，超过此载量可能会出现呼吸道症状[22]．然而，考虑到它们的高检出率和与细菌定植的关联，我们认为将单个微生物或某种病毒载量确定为幼儿呼吸道感染的单一原因变得更加复杂。

总的来说，风险肺炎链球菌，流感嗜血杆菌而且复活的在特定呼吸道病毒存在时，定植似乎增加。这种相对风险的大小因病毒和细菌而异。一般来说，流感病毒的存在与病毒定植的风险增加有关金黄色葡萄球菌还有肺炎链球菌这两个结论也得到了流感大流行期间的观察结果的支持。而甲型H1N1流感与金黄色葡萄球菌在2009年大流行期间，肺炎与肺炎球菌有关，这取决于病毒的亚型［5］，[23]．在目前的研究中，只有流感病毒与金黄色葡萄球菌持续进行多变量分析，这可能反映了不同流感病毒亚型对这些细菌病原体的不同影响[24]．

之前报道的负相关肺炎链球菌而且金黄色葡萄球菌本研究证实在鼻咽运输期间[12]，[25]，[26]．然而，我们发现了更强的负相关复活的而且金黄色葡萄球菌．这是否反映了真正的微生物干扰，或者，例如，通过其他(共生)细菌或免疫调节的间接影响的结果，值得进一步研究。

与经典多元分析的单维视图相比，偏相关分析提供了一个二维视图[27]．因此，它不会赋予单个变量比其他变量更多的价值，并且允许同时测试所有参数之间的独立关联。

然而，观察到的关联是数学上的，需要进一步的研究来揭示其潜在的生物学机制，并确定它们是直接的还是依赖于其他(未知的)决定因素。然而，一些观察到的统计相关性得到大量证据的支持，这些证据表明病毒介导的呼吸道细菌感染易感性。例如，对动物模型的研究以及在体外研究为鼻病毒和肺炎链球菌[28]，[29]．有趣的是最近描述的这些微生物在疾病中的时间联系[30]．这进一步证实了流感和呼吸道合胞病毒的传播与侵袭性肺炎球菌和脑膜炎球菌疾病之间的关联[31]．

更深入地了解上呼吸道微生物群落成员之间的协同作用和竞争，以更好地了解疾病的进展是非常有趣的。多微生物组成和多样性的平衡被认为是维持健康状态的重要因素[4]，[6]．例如，之前有研究表明肺炎链球菌可以杀死金黄色葡萄球菌通过远程控制噬菌体诱导，可能解释了在马车研究中观察到的那些物种之间的负相关[32]．对肠道菌群的研究表明，共生菌是相互依赖的，因为它们有共同的代谢途径[33]．可能，细菌相互干扰的类似机制也可能在上呼吸道中发挥作用。我们还应该注意到高度适应性细菌的巨大异质性，例如肺炎链球菌而且流感嗜血杆菌在这种情况下。尽管在我们的研究中观察到的正相关已经在之前的报道中[34]，拮抗作用也被描述发生[35]．

关于呼吸道疾病，已证明肺炎球菌结合疫苗接种总体上也减少了与病毒相关的肺炎，特别是与流感和副流感病毒等季节性病毒相关的病例[36]．这表明假定的“病毒相关肺炎”本质上实际上是多微生物的。急性中耳炎可能也是如此，这种疾病可能是由单个病原体引起的，但也可能是真正的多微生物发病机制的最后阶段。在任何一种情况下，关于病毒易导致继发性细菌疾病的旧范式似乎是对潜在相互作用的复杂性和动态性的过度简化。例如，最近描述了肠道中病毒和细菌之间的相互依赖关系:一些病毒用细菌常驻分子覆盖自己，使病毒感染成为可能[37]，[38]．这也与主流观点相矛盾，即常驻微生物只是防止新的病毒感染。

需要提到一些限制。首先，我们将当前细菌检测标准(常规培养)的结果与病毒检测标准(qPCR)的结果进行了建模。使用PCR代替常规培养可能增加了(较少的)细菌的检测。我们将分析限制在四种可培养的细菌病原体，因为它们通常被认为是儿童呼吸道疾病的主要原因。此外，由于细菌需要以足够的丰度存在才能通过培养检测，因此这些结果可能揭示最具临床相关性的关联。此外，流行率的培养肺炎链球菌，流感嗜血杆菌而且复活的在我们的研究中已经很高了。我们认识到上呼吸道的微生物群落本质上是复杂的，包括不可培养的，较少丰富的共生细菌种[39]，[40]．这些如何与病机相联系，是当前和未来研究的一个有趣的话题。第二，以横断面方式评估病毒和细菌的流行情况;我们只描述关联，不能推测因果关系。需要未来的研究来证明这些关联的重要性和可能的潜在机制。第三，我们主要关注病毒和细菌的粗略存在或不存在，忽略了病毒和/或细菌负荷。最后，应该指出的是，除了可能与本研究中未分析的菌群成员相互作用外，所证明的微生物之间的联系可能(至少部分)受到宿主遗传和免疫成熟状态的影响。

我们研究的优势包括健康儿童的大样本量，分析中包含的病毒范围广泛，以及关于危险因素的详细数据的可用性。相对较高的细菌定植率和病毒检出率允许进行可靠的统计分析，总结为这些微生物之间不同关联的“网络模型”。

总之，我们已经证明，细菌病原体和呼吸道病毒大量存在于健康幼儿的上呼吸道。在我们的研究中发现的病毒和细菌之间的明显联系，在将微生物存在与特定的呼吸道疾病联系起来时，值得仔细考虑。

支持信息

图S1。

与其他致病菌共存有关的细菌定殖。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711.s001

(PDF)

图S2。

与呼吸道病毒共存有关的细菌定殖。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047711.s002

(PDF)

致谢

我们感谢研究团队成员、实验室工作人员和所有合作机构对项目的奉献。最重要的是，我们感谢所有参加活动的儿童和他们的家庭。

作者的贡献

重要的知识内容的手稿的关键修订:MRvdB EJMvG GB RHV JWAR JPB WAAdSP AATMB XW CB DB EAMS。研究指导:DB EAMS。构思和设计实验:DB EAMS。进行实验:RHV EJMvG MRvdB WAAdSP AATMB JPB JWAR。分析数据:MRvdB XW CWBB DB。贡献试剂/材料/分析工具:RHV GB JWAR JPB。撰写论文:MRvdB EJMvG DB EAMS。

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