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研究文章gydF4y2Ba

缓慢的受体解离动力学Macitentan有别于其他在肺动脉平滑肌细胞内皮素受体拮抗剂gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

两个内皮素受体拮抗剂(时代),应用波生坦ambrisentan,目前批准用于治疗肺动脉高血压(PAH),一场毁灭性的疾病涉及一个激活内皮素系统和异常的收缩和扩散肺动脉平滑肌细胞(PASMC)。这部小说时代macitentan最近得出的测试在第三阶段PAH患者的发病率和死亡率的临床试验。自协会和离解率G protein-coupled受体拮抗剂可以影响他们的药理作用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,我们使用人类PASMC特征抑制效力和macitentan受体抑制动力学,ambrisentan并使用钙释放和inositol-1-phosphate (IP应用波生坦gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)分析。在钙释放化验macitentan ambrisentan,应用波生坦与K高度有效的时代gydF4y2BabgydF4y2Ba值为0.14 nM,分别为0.12和1.1 nM。Macitentan,但不是ambrisentan应用波生坦,显示缓慢明显受体协会动力学就是明证增加敌对的力量在对手pre-incubation时代的延伸。在复合冲刷实验中,macitentan显示显著降低受体离解速率和较长的受体入住率半衰期(腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba)相比,应用波生坦和ambrisentan(腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba∶17分钟与70秒40秒,分别)。由于其低离解速率macitentan表现作为一个不可逾越的对手在钙释放和IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba化验,并与应用波生坦和ambrisentan阻止内皮素受体激活跨广泛的endothelin-1 (ET-1)浓度。然而,ET-1刺激时间的延长超出腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba呈现macitentan可战胜的对手,揭示竞争绑定模式。应用波生坦和ambrisentan表现可战胜的对手无论试验持续时间和他们缺乏抑制活动ET-1浓度高。因此,macitentan是一个竞争激烈的时代,明显慢受体解离动力学比当前批准的时代。缓慢分解导致功能PASMC-based化验和不可逾越的对抗这可能有助于增强药理作用的macitentan ET-1-dependent病态。gydF4y2Ba

引用:gydF4y2BaGatfield J,穆勒Grandjean C,水闸T,克洛泽M, Nayler O(2012)缓慢受体解离动力学Macitentan有别于其他在肺动脉平滑肌细胞内皮素受体拮抗剂。《公共科学图书馆•综合》7 (10):e47662。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662gydF4y2Ba

编辑器:gydF4y2BaMakoto Kanzaki、东北大学、日本gydF4y2Ba

收到:gydF4y2Ba2012年7月27日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2012年9月14日;gydF4y2Ba发表:gydF4y2Ba2012年10月15日gydF4y2Ba

版权:gydF4y2Ba©Gatfield等。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。gydF4y2Ba

资助:gydF4y2Ba报告作者没有资金或支持。gydF4y2Ba

利益冲突:gydF4y2Ba所有作者的员工应用波生坦Actelion股价制药有限公司是一个销售产品的Actelion股价制药有限公司macitentan由Actelion股价医药产品开发,和化合物都是受到保护的专利授权或由Actelion股价制药有限公司(应用波生坦:专利家族对应EP 526708 (f .罗氏公司AG);macitentan:专利家族对应我们02/053557 (Actelion股价制药有限公司))。这并不改变作者的坚持所有的PLoS ONE政策共享数据和材料。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

肺动脉高压(PAH)是一种罕见的严重疾病,特点是增加压力引起肺循环进步肺动脉重构和肺血管的收缩gydF4y2Ba[1]gydF4y2Ba。这种破坏性疾病的初始原因很大程度上是未知的;然而,肺内皮功能障碍和平滑肌细胞异常重要的贡献者gydF4y2Ba[2]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

治疗旨在恢复平衡endothelium-derived血管活性的物质是有效降低肺血管阻力和提高运动能力gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。这种治疗方法包括环前列腺素类似物,5型磷酸二酯酶抑制剂和内皮素受体拮抗剂(时代)。肺组织中内皮素(ET)浓度升高的PAH患者gydF4y2Ba[6]gydF4y2Ba和中央致病作用等多环芳烃已被证实在几个临床试验评估不同的时代gydF4y2Ba[7]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

内皮素是血管活性的肽的endothelin-1 (ET-1)是最丰富的肺部组织gydF4y2Ba[8]gydF4y2Ba。ET-1是最有效而持久的血管收缩剂在人,充当有丝分裂原,血管生成因子,中介的纤维化和炎症。所有这些过程都是在肺血管异常激活多环芳烃gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[10]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[12]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[13]gydF4y2Ba。ET-1反应是通过激活介导两个同源G protein-coupled受体亚型,内皮素受体(等gydF4y2Ba一个gydF4y2BaB)和内皮素受体(等gydF4y2BaBgydF4y2Ba)gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba。两种受体亚型Gαq激活磷脂酶Cβprotein-mediated途径激活和增加细胞内钙浓度gydF4y2Ba[16]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

内皮细胞的主要来源是ET-1他们分泌肽通过两种途径。本构途径被认为导致基底血管张力而non-constitutive途径释放ET-1为了应对各种外界刺激从专门储存囊泡gydF4y2Ba[17]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[18]gydF4y2Ba。符合网站的行动,ET-1内皮细胞分泌的极化对基底外侧空间,即进入深层组织的血管壁gydF4y2Ba[19]gydF4y2Ba。的分泌内皮ET-1是由刺激引发如缺氧、生长因子、细胞因子、类固醇、流/剪切应力和血管损伤gydF4y2Ba[20]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[22]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[23]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[25]gydF4y2Ba。在肺,改变当地ET 1浓度然后感觉到邻近肺动脉平滑肌细胞(PASMC)和成纤维细胞表达ET受体。在PASMC, ET受体耦合Gαq通路和激活磷脂酶Cβ和inositol-trisphosphate (IPgydF4y2Ba3gydF4y2Ba)和甘油二酯的生产。这些早期的第二信使发起两相的钙反应导致细胞内钙水平的持续提升。钙水平升高促进细胞骨架收缩和细胞增殖gydF4y2Ba[7]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[16]gydF4y2Ba从而调解持续的血管收缩和血管重建,中央在PAH病理过程gydF4y2Ba[26]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[27]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在目前的研究中,我们使用第二信使化验主要人类PASMC ET受体协会和离解macitentan动力学特征,小说时代gydF4y2Ba[30]gydF4y2Ba相比,应用波生坦和ambrisentan PAH的两个时代批准治疗。Macitentan明显受体协会速度缓慢,15倍延长受体入住率半衰期(腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba应用波生坦和ambrisentan相比)。因此,macitentan,但无论是应用波生坦还是ambrisentan,显示不可逾越的对抗与短细胞化验孵化时间和阻塞ET受体激活无论添加ET-1浓度。封锁以来PASMC的ET受体信号的一个关键方面成功的治疗干预PAH,独特的动力学性质macitentan可能允许一个更有效的治疗ET-1-mediated病态的血流动力学和结构影响的多环芳烃和其他疾病。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

内皮素受体亚型在PASMC信号的贡献gydF4y2Ba

人工培养的初级PASMC,中央在PAH治疗靶细胞,表达高水平的等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba信使rna,大大减少等gydF4y2BaBgydF4y2Ba信使rna(未发表的数据gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba)。一组5个参考时代不同受体亚型选择性配置文件被用来确定不同受体亚型mRNA表达水平也反映在相对等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体的贡献ET-1-induced钙信号。拮抗剂KgydF4y2BabgydF4y2BaPASMC中获得与K值gydF4y2BabgydF4y2Ba值生成在CHO细胞表达重组等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体或重组等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体。为此,对手稀释系列是120分钟pre-incubated各自的细胞类型,然后刺激与ET-1 (ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba)。荧光跟踪记录3分钟的荧光成像板读者(FLIPR)和峰值荧光值被用来计算最大对手的抑制浓度(IC的一半gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。这些被转化为功能抑制常数(KgydF4y2BabgydF4y2Ba使用Cheng-Prusoff方程)gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba(见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。所示gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba在重组细胞,双等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体拮抗剂tezosentan显示混合等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和等gydF4y2BaBgydF4y2Ba对立而等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体拮抗剂bq - 123, sitaxentan zibotentan选择性阻塞等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体和等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体拮抗剂bq - 788选择性阻塞等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体。PASMC的化合物,涉及了广泛的对抗效力从KgydF4y2BabgydF4y2Ba= 10点tezosentan KgydF4y2BabgydF4y2Ba对bq - 788 = 117海里。评估对人类PASMC ET-1-induced信号受体亚型的贡献,KgydF4y2BabgydF4y2BaPASMC中获得与K值gydF4y2BabgydF4y2Ba在CHO-ET获得的值gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba系统(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2BaCHO-ET)或gydF4y2BaBgydF4y2Ba系统(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。一个显著相关(RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.990)与CHO-ET获得gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba数据,而没有相关性(RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba与CHO-ET = 0.004)被发现gydF4y2BaBgydF4y2Ba数据,这表明ETgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体的主要中介在这些PASMC ET-1-induced钙释放。的总体转变CHO-ET观察降低敌对力量gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba系统,可能是由于受体表达和更高的受体储备重组系统。gydF4y2Ba1选项卡。gydF4y2Ba总结了这些KgydF4y2BabgydF4y2Ba数据。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图1所示。gydF4y2Ba内皮素受体亚型的贡献在人类主要PASMC钙信号。gydF4y2Ba

PASMC或CHO-ETgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba或CHO-ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba细胞与参考pre-incubated时代稀释系列120分钟,然后刺激在FLIPR ET-1 (ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba)。集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba从荧光峰的响应值计算,转化为KgydF4y2BabgydF4y2Ba值作为描述的gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba。相关性散点图的KgydF4y2BabgydF4y2BaPASMC与CHO-ET获得的值gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba细胞(A)或与CHO-ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba细胞(B),相关行和RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba价值是由双对数线性回归产生的数据。几何n = 3 - 8决定显示的方法。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g001gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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表1。gydF4y2Ba意思是KgydF4y2BabgydF4y2Ba值参考时代由钙释放CHO-ET化验gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,CHO-ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba和人类PASMC。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.t001gydF4y2Ba

敌对的力量和明显关联动力学不同的时代gydF4y2Ba

Macitentan与不同时代,包括ambrisentan和应用波生坦,效力和明显的协会在PASMC动力学。细胞与时代pre-incubated稀释系列10分钟或120分钟(稳态条件)和由此产生的钙信号测量与ET-1刺激后。计算KgydF4y2BabgydF4y2Ba值每个化合物和每个孵化条件(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)说明,所有测试时代,除了macitentan tezosentan在一个较低的程度上,10分钟后达到稳态,就是明证pre-incubation时间时缺乏力量的转变从10分钟延长到120分钟。然而,macitentan显示增加6.3倍力量120分钟后,10分钟pre-incubation相比,表明慢明显关联动力学。效力ambrisentan和macitentan类似在120分钟后稳态pre-incubation (KgydF4y2Bab_macigydF4y2Ba= 0.12 nM, KgydF4y2Bab_ambrigydF4y2Ba应用波生坦= 0.14 nM),大约是10倍(K有效gydF4y2Bab_bosentgydF4y2Ba= 1.1海里)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图2。gydF4y2Ba敌对的力量和明显关联动力学不同时期使用钙释放PASMC化验。gydF4y2Ba

细胞与拮抗剂pre-incubated稀释系列10分钟或120分钟,然后刺激在FLIPR ET-1 (ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba)。集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba从荧光峰的响应值计算,转化为KgydF4y2BabgydF4y2Ba值作为描述的gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba。相关性散点图的KgydF4y2BabgydF4y2Ba值为10分钟和120分钟生成拮抗剂pre-incubation倍(几何n = 6决定)的手段。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g002gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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表2。gydF4y2Ba意思是KgydF4y2BabgydF4y2Ba值不同时期由钙释放人类PASMC化验用10分钟或120分钟拮抗剂pre-incubation时间。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.t002gydF4y2Ba

解离动力学和受体入住率Macitentan半衰期,Ambrisentan和应用波生坦gydF4y2Ba

慢明显关联动力学可能由受体增加入住率半衰期(腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba)和缓慢的离解。因此,我们确定了腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Bamacitentan,应用波生坦和ambrisentan PASMC拮抗剂冲刷后利用功能性读数。PASMC孵化了macitentan浓度增加,应用波生坦ambrisentan或120分钟,然后直接刺激细胞和ET-1或受到冲刷过程消除自由化合物。后冲刷过程与EC细胞被刺激了gydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba后ET-1不同的恢复时间和钙释放测定(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。的集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值在不同的时间点进行计算,并通过Cheng-Prusoff转换方程(KgydF4y2BabgydF4y2Ba=集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba/ (1 + (ET−1gydF4y2Ba机枪兵gydF4y2Ba)/ ECgydF4y2Ba50 _et−1gydF4y2Ba)KgydF4y2BabgydF4y2Ba值gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba使用电子商务gydF4y2Ba50gydF4y2BaET-1确定在同一试验板以及刺激ET-1浓度。在低刺激ET-1浓度的计算给出了一个估计KgydF4y2BabgydF4y2Ba值甚至不可逾越的拮抗剂gydF4y2Ba[32]gydF4y2Ba。五分钟后复合冲毁,ambrisentan——bosentan-treated PASMC已经恢复了对ET-1刺激响应性,显著K的变化就体现了这一点gydF4y2BabgydF4y2Ba的因素∼170 (ambrisentan)和∼20(应用波生坦)。相比之下,macitentan-treated PASMC仍ET-1反应迟钝和K的显著转变gydF4y2BabgydF4y2Ba是第一次看到后60分钟惨败。这些数据表明在腐烂明显不同gydF4y2Ba1/2gydF4y2Bamacitentan ambrisentan相比,应用波生坦。基于K的转变gydF4y2BabgydF4y2Ba在5分钟,腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba(ambrisentan)和∼∼40秒的70秒(应用波生坦)计算,假设一个指数下降随着时间的推移受体封锁。效力的13倍损失macitentan超过60分钟翻译腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba∼17分钟。综上所述,macitentan显示∼15倍增加腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Baambrisentan相比,应用波生坦。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图3。gydF4y2Ba离解macitentan动力学,应用波生坦ambrisentan和由钙释放PASMC化验。gydF4y2Ba

细胞被pre-incubated与对手稀释系列120分钟然后直接刺激ET-1 (ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba)或受到一种化合物冲刷过程之后,刺激与ET-1冲刷后在指定的时间点。钙响应峰值被用来计算ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba这变成了K值gydF4y2BabgydF4y2Ba值作为描述的gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba。显示时间的变化在KgydF4y2BabgydF4y2Ba后惨败。几何显示+ /−SEM手段。KgydF4y2BabgydF4y2Ba值后冲刷明显不同(p < 0.05)的KgydF4y2BabgydF4y2Ba0分钟用星号表示。测试:单向方差分析,Dunnett的文章测试。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g003gydF4y2Ba

后果的ET受体对抗方式gydF4y2Ba

化合物与增加腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba如macitentan能像不可逾越的对手当使用兴奋剂刺激时间短于腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Baantagonist-receptor复杂gydF4y2Ba[32]gydF4y2Ba。知识产权gydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累分析非常适合于不同受体激动剂刺激倍信号由于长期发展,因此他们通常用于调查的对抗方式Gαq-coupled G蛋白耦合的受体。评估是否macitentan ambrisentan,应用波生坦的对抗模式,不同量效曲线(crc) ET-1生成浓度增加的三个时代(席尔德分析),和IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba20分钟后积累决心ET-1刺激。所有三个对手concentration-dependently阻塞ET-1-induced IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累在PASMC (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。然而,尽管ambrisentan应用波生坦和显示模式可以克服的对立导致等距向右的变化ET-1 crc, macitentan显示一个不可逾越的方式对抗抑郁的最大响应除了向右转变ET-1 crc。因此,增加的腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Bamacitentan与一个不可逾越的对抗。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图4。gydF4y2Ba应用波生坦的影响,ambrisentan和macitentan ET-1-induced IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累。gydF4y2Ba

人类PASMCs pre-incubated稀释系列的对手120分钟紧随其后的一系列稀释ET-1。经过20分钟的刺激,细胞是细胞溶解和IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba内容确定。来自4个独立实验原始数据规范化,平均值+ /−SEM所示。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g004gydF4y2Ba

IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累试验数据也被用来推断KgydF4y2BabgydF4y2Ba通过Cheng-Prusoff方程值不同的对手。再次,对KgydF4y2BabgydF4y2Ba计算我们使用了集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值生成ET-1浓度最低,交付一个健壮的信号强度(1.6 nM ET-1)。Ambrisentan (KgydF4y2BabgydF4y2Ba:1.1 nM,σgydF4y2BaggydF4y2Ba= 1.6,n = 4)和macitentan (KgydF4y2BabgydF4y2Ba:0.74 nM,σgydF4y2BaggydF4y2Ba= 1.4,n = 4)显示类似的力量,比应用波生坦(K的约10倍gydF4y2BabgydF4y2Ba:12海里,σgydF4y2BaggydF4y2Ba= 2.2,n = 4)σg是几何标准差。这些结果符合人类PASMCs钙通量分析获得的数据。gydF4y2Ba

区分slow-offset orthosteric对抗不可逆转的对立或变构对抗,我们用更长的刺激时间下进行化验。Slow-offset拮抗剂像可超越的竞争对手在这些化验如果刺激时间显著长于腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Baantagonist-receptor的复杂。相比之下,变构拮抗剂或不可逆转的阻滞剂不会改变他们的抑制在长期的孵化模式。IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累试验因此进行20分钟和90分钟的ET-1刺激时间,后者远远超出了估计腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Bamacitentan∼17分钟,允许更好的antagonist-agonist平衡。Macitentan显示不可逾越的对抗与培养时间20分钟(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)和可战胜的对抗(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)当刺激时间延长至90分钟。相比之下,ambrisentan和应用波生坦显示可战胜的对抗无论孵化时间(gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)。因此,在平衡条件下macitentan透露其竞争拮抗作用方式就是明证等距的向右移动ET-1 crc,对抗和缺乏的完整surmountability饱和度的拮抗效应,将负变构调节器。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图5。gydF4y2Ba时间依赖性的macitentan不逾越决定IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累化验。gydF4y2Ba

人类PASMCs pre-incubated稀释系列的对手120分钟紧随其后的一系列稀释ET-1。20分钟后(A)或90分钟(B)的刺激,细胞是细胞溶解和IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba内容确定。显示原始数据+ /−SD的副本的一个代表性的实验共有n = 3。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g005gydF4y2Ba

是可以克服的对立被认为对所有化合物的90分钟的孵化时间席尔德KgydF4y2BabgydF4y2Ba值可以计算。在以前的实验中,看到macitentan席尔德(KgydF4y2BabgydF4y2Ba:1.4,σgydF4y2BaggydF4y2Ban = 3 = 2.1)和ambrisentan席尔德(KgydF4y2BabgydF4y2Ba= 1.6 nM,σgydF4y2BaggydF4y2Ban = 3 = 2.3),显示类似的效力和都是大约10倍比应用波生坦(席尔德K更有效gydF4y2BabgydF4y2Ba:16 nM,σgydF4y2BaggydF4y2Ban = 3 = 1.8)。gydF4y2Ba

总之,macitentan slow-offset orthosteric拮抗剂导致不可逾越的对抗,如果化验孵化时间短于计算腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba但可以克服的对抗观察如果试验时间超过计算腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba。相比之下,应用波生坦ambrisentan和显示可战胜的对抗无论ET-1刺激。gydF4y2Ba

PASMC的钙释放诱导ET-1的特征是两相的概要文件组成的快速瞬态增加和第二个持续升高gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[34]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[35]gydF4y2Ba,后者与病理学的持续收缩和细胞增殖gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[36]gydF4y2Ba。我们使用这两个反应阶段进一步评估三个时代ambrisentan,应用波生坦和macitentan。在PASMC ET-1刺激引起一个健壮的、瞬变胞质钙,增加达到30秒后ET-1加法和持续了大约3分钟。随后,胞质钙长时间但不明显增加,持续了超过25分钟(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。两个阶段显示浓度,饱和行为(gydF4y2Ba图6 b和CgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图6。gydF4y2Ba描述两相的细胞内的钙对PASMC ET-1反应。gydF4y2Ba

细胞被刺激的稀释系列ET-1和两相的钙的反应被记录为25分钟。显示是200海里的原始FLIPR荧光痕迹ET-1和车辆治疗持续覆盖第一个瞬态响应阶段,第二个反应阶段(A),的concentration-response-curves ET-1获得第一阶段使用峰值荧光值+ /−SD的副本(B)和concentration-response-curves ET-1获得第二阶段使用曲线下的面积值3分钟至23分钟后刺激+ /−SD的副本(C)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g006gydF4y2Ba

Macitentan ambrisentan,应用波生坦进行调查与120 - min pre-incubation席尔德实验时间和两个阶段的影响钙增加独立进行了分析。第一个反应阶段是量化使用荧光峰高在前三分钟,第二阶段是量化通过计算曲线下的面积3分钟至23分钟的观察。gydF4y2Ba

由于信号快速发展的第一个钙响应峰值(30秒),这三个化合物显示一定程度的不可逾越的对抗与预期的一样,尽管macitentan最明显(gydF4y2BaFig.7AgydF4y2Ba)。难以克服的程度进一步说明了显示时代抑制曲线以固定ET-1浓度(1µM)。应用波生坦ambrisentan和这些曲线是两相的(gydF4y2BaFig.7BgydF4y2Ba),达成一个中间高原敌对的功效与残余畅通无阻的信号被描述的受体的比例可战胜的对抗gydF4y2Ba[37]gydF4y2Ba。事实上,应用波生坦显示可超越的方式对抗∼50%的ET-1-induced信号和ambrisentan显示这种可超越的模式∼30%的ET-1-induced信号。Macitentan显示不可以克服的行为。因此,基于这些观察结果可以估计,第一个30秒内,应用波生坦已经分离从∼∼50%的受体和ambrisentan 30%的受体(假设1∶1信号之间的相关性和受体入住率和缺乏受体储备)。这些考虑收益率很短的腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba< 1分钟ambrisentan和应用波生坦。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图7。gydF4y2Ba应用波生坦的影响,ambrisentan macitentan ET-1-induced钙响应的阶段。gydF4y2Ba

人类PASMCs pre-incubated稀释系列120分钟的拮抗剂,刺激一系列稀释的ET-1和两相的钙的反应被记录。显示拮抗剂的作用在ET-1 concentration-response-curves第一反应阶段(使用高峰,荧光值+ /−SD副本),第二个持续反应阶段(C,使用曲线下的面积值+ /−SD的副本)。此外,三个对手的concentration-response-curves得罪峰值反应诱导1µM ET-1显示+ /−SD的副本(B)的近似定位中间高原的拮抗剂疗效。是一个有代表性的实验的结果显示n = 3的实验。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047662.g007gydF4y2Ba

图7 cgydF4y2Ba显示了三个化合物的拮抗效应在第二个钙质的持续阶段。Macitentan显示一个不可逾越的对立而其他两种化合物显示方式可以克服的对抗。使用Cheng-Prusoff方程,KgydF4y2BabgydF4y2Ba第一(K值计算gydF4y2Bab1,gydF4y2Ba使用集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值8海里ET-1)和第二阶段(KgydF4y2Bab2gydF4y2Ba使用集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba在1.6 nM ET-1)。再一次,macitentan (KgydF4y2Bab1gydF4y2Ba∶0.17 nM和KgydF4y2Bab2gydF4y2Ba0.093 nM)和ambrisentan (KgydF4y2Bab1gydF4y2Ba∶0.27 nM和KgydF4y2Bab2∶gydF4y2Ba0.14)几乎是均等的,∼10倍更有效应用波生坦比(KgydF4y2Bab1gydF4y2Ba∶2.3 nM和KgydF4y2Bab2∶gydF4y2Ba0.79)。有趣的是要注意,应用波生坦ambrisentan,不仅缺乏抑制能力持续钙释放ET-1浓度很高,但是他们的存在可再生产地增加的最大疗效ET-1读出。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

相关性的药物动力学有约束力gydF4y2Ba

药物的药理作用取决于目标亲和力和药代动力学变量如免费分数和血浆半衰期和理化性质,影响化合物的速度和程度分布到目标组织。所有这些因素现在早已建立,是任何药物化学复合优化程序的一部分。然而,有越来越多的证据表明,药物复杂的动力学行为也会影响临床活性的化合物gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba。长期目标是普遍有效的抑制剂,事实上,新分子实体FDA批准的2001年至2004年,只有18%的orthosteric抑制剂或拮抗剂显示纯质量作用后抑制竞争的机制,而大多数的抑制剂(70%)能够持续目标封锁gydF4y2Ba[39]gydF4y2Ba。因此,目标持续封锁被缓慢的分离是一种有效的策略来避免或至少推迟生理配体浓度的增加之间的竞争和药物目标结合位点。的强烈波动的配体浓度的目标,这可能是由于当地脉动的分泌结合快速退化,持续封锁可能导致目标增强的最大功效的抑制剂。gydF4y2Ba

许多自分泌和旁分泌GPCR配体显示暂时限制局部浓度高,和持续的受体封锁/不可逾越的对抗似乎适合加强这种系统的最大敌对的功效。众所周知的例子GPCR拮抗剂处理这类波动对位/自分泌组胺H1受体配体(如desloratidine、腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba∼6 h,gydF4y2Ba[40]gydF4y2Ba)能引起的过敏反应的封锁脱粒和PgydF4y2Ba2gydF4y2BaYgydF4y2Ba12gydF4y2Ba拮抗剂(如氯吡格雷,不可逆转的绑定,gydF4y2Ba[41]gydF4y2Ba),血小板源ADP诱导的血小板聚集的封锁。另一类研究GPCR拮抗剂瞄准一个至少部分自分泌/旁分泌系统的血管紧张素ⅱ受体拮抗剂(arb)是治疗高血压和心脏病。slow-offset ARBs药物坎地沙坦和olmesartan显示增加最大功效相比fast-offset拮抗剂洛沙坦,有15-25-fold短腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba[37]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[42]gydF4y2Ba。因此不足为奇动能调查成为一个普遍的实践在现代药物发现和可以使用生化检测,描述compound-target复合物或使用功能分析——增加功能的相关性gydF4y2Ba[43]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在目前的研究中,在人类主要PASMC使用第二信使化验,我们为特征的抑制效力,动力学和macitentan拮抗作用方式,在第三阶段刚刚结束测试,长期的、事件驱动的,发病率和死亡率的临床试验的病人患有多环芳烃。PASMC已知目标细胞成功PAH疗法和endothelin-mediated影响PASMCs被证明有助于PAH病理学。两个时代,ambrisentan和应用波生坦,目前通过PAH疗法,因此macitentan的分子受体抑制性能与应用波生坦ambrisentan和比较。gydF4y2Ba

ET-1-induced钙信号在人类主要PASMC基本上是等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba驱动,显示通过使用内皮素受体亚型特定参考拮抗剂。观察到的功能的贡献等gydF4y2Ba一个gydF4y2BaET受体亚型相比gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体亚型在协议与我们的子类型特定的信使rna表达的定量评估和同意以前发表的报告等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/等gydF4y2BaBgydF4y2Ba表达人类PASMCs比率gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba。macitentan disease-relevant原代细胞系统,但不是ambrisentan应用波生坦显示缓慢受体离解导致ET-1-induced IP不可逾越的对抗gydF4y2Ba1gydF4y2Ba积累和ET-1-induced持续高度的细胞内钙含量时ET-1刺激时间有限。允许充分平衡受体激动剂和拮抗剂(90分钟co-incubation)揭示了竞争的本质对立macitentan施加。我们的发现在人类主要使用第二信使化验PASMC确认macitentan先前的竞争对抗大鼠主动脉环收缩化验所示gydF4y2Ba[30]gydF4y2Ba。因为血管收缩的发展添加ET-1体内是一个缓慢的过程(> 100分钟到达ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba化验数据未显示),收缩,体内添加ET-1不捕捉macitentan发生的难以克服ET-1刺激时间较短。gydF4y2Ba

Macitentan和ambrisentan在稳态分析相同的对抗效力,但显示不同的动力学特性。这种差异的可能原因是不同的gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba绑定模式分子功能的分子结构。macitentan无关的结构与ambrisentan之一,应用波生坦的一个显著不同,因此不同的绑定模式可以预期。的等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体被建议有bitopic ET-1结合位点的住宿氨基ET-1 address-domain和c端受体激活域gydF4y2Ba[44]gydF4y2Ba。另外有人建议低分子量时代可能显示变构对立或orthosteric对抗。macitentan我们获得的数据,应用波生坦ambrisentan和高度兼容的直接竞争时代的绑定的ET-1 bitopic结合位点的两个部分。由于动力学和结构差异我们假设macitentan结合位点至少是部分应用波生坦和ambrisentan结合位点的不同,这种差异在绑定导致的缓慢受体离解macitentan hemi-equilibrium条件下导致不可逾越的对抗。结合分子建模、定点诱变NMR和x射线研究需要来证明这一假设。gydF4y2Ba

直接病理相关性PAH的持续高度PASMC的细胞内钙含量gydF4y2Ba

本研究区分macitentan及其模式从其他时代使用内皮素受体拮抗治疗靶细胞和测量ET-1-induced第二信使的水平,包括disease-relevant持续高度的胞质钙浓度。这种持续的钙海拔已经直接关系到持续的血管收缩和病理PASMC增殖gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[36]gydF4y2Ba。PASMC的持续增加,胞质钙介导通过各种等离子体膜通道包括压敏电阻器频道,门店渠道和瞬时受体电位(TRPC)阳离子通道。有趣的是,在增殖PASMC或PASMC特发性PAH患者观察到细胞内钙含量高于growth-arrested PASMCs或PASMCs健康受试者gydF4y2Ba[45]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[46]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[47]gydF4y2Ba。具体来说,TRPC通道已被证明是调节在PAH-derived PASMC。持续钙海拔密切相关细胞增殖有丝分裂原激活蛋白激酶的激活和诱导的前导转录因子c-jun c-fos。钙也直接促进细胞周期进程通过核calcium-calmodulin复合物的形成gydF4y2Ba[48]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[49]gydF4y2Ba。因此,高效的封锁ET-1-induced持续缓慢释放的钙分离时代预计将有利于抑制病理PASMC增殖。gydF4y2Ba

优势慢慢游离拮抗剂的自分泌/旁分泌的封锁等系统gydF4y2Ba

ET-1是自分泌/旁分泌受体激动剂释放的内皮细胞,成纤维细胞和平滑肌细胞,以应对当地刺激如缺氧、生长因子或流和剪切应力和内皮损伤gydF4y2Ba[20]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[22]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[23]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[25]gydF4y2Ba。重要的是,除了它的本构分泌,ET-1也可以从专门储存囊泡释放,所谓Weibel-Palade身体,集中和商店ET-1下内皮细胞的质膜gydF4y2Ba[17]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[18]gydF4y2Ba。本构和刺激ET-1分泌机制辅以高效当地ET-1降解酶就是明证短一半的生命自由ET-1组织提取物gydF4y2Ba[50]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[51]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[52]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[53]gydF4y2Ba。ET-1释放的空间和时间模式和退化病变组织和由此产生的当地ET-1浓度时间资料遇到PASMC的心肌细胞,心脏和肺成纤维细胞仍然是未知的。然而,在波动的假设,即不平衡当地ET-1浓度在体内,慢慢游离拮抗剂如macitentan预计将显示一个更完整的块ET-1绑定应用波生坦比ambrisentan和其受体。此外,很可能阻止绑定的ET-1阻塞ET受体迅速退化,而不是用于尝试重新绑定。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

Macitentan分化的两个目前批准的时代通过其受体离解慢动力学和非平衡分析中不可逾越的对抗。当地的条件下ET-1波动gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,macitentan应该阻止ET-1-induced信号比其他时期更有效。这些品质可能导致一个独特的有效性macitentan在增加自分泌和旁分泌ET-1信号特征的疾病,如多环芳烃。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组表达等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba或等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体在生长培养基培养(火腿F-12与含有1000µg /毫升G418的谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100µg /毫升、heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS)]。PASMC买来TCS Cellworks (zhc - 3116)和培养生长培养基(Lonza Clonetics SmBM (cc - 3181))与SmGM-2 SingleQuots补充剂和5% FCS (cc - 4149))。PASMC的3到5是用于所有实验。gydF4y2Ba

时代gydF4y2Ba

Macitentan,应用波生坦,ambrisentan tezosentan被Actelion股价制药有限公司合成,sitaxentan购买从Convertex(德国)和zibotentan Acesys Pharmatech(美国)。bq - 123和bq - 788或购买σ。gydF4y2Ba

细胞内钙释放使用重组CHO-ET测量gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和CHO-ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba

CHO-ETgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba或CHO-ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba细胞在生长介质被播种在20000细胞/到384 -黑色明确底部无菌盘(格林尼)和隔夜37°C的5%孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然后,生长介质交换了50µL /染料的缓冲区(哈佛商学院,0.1%牛血清白蛋白(BSA), 20毫米消息灵通的,0.375 g / L NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba5毫米丙磺舒(σ),1% FCS和3µM fluo-4]。细胞被孵化1 h在37°C的5%股份gydF4y2Ba2gydF4y2Ba其次是平衡在室温下至少30分钟。然后,在荧光成像板读者(FLIPR利乐、分子设备),板块受到协议组成的两个添加10µL决心的抑制效力(ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba和KgydF4y2BabgydF4y2Ba内皮素受体拮抗剂)。钙的痕迹都被记录下来,然后处理如下所述。测定内皮素受体拮抗剂(K的对抗效力gydF4y2BabgydF4y2Ba)细胞补充6×10µL拮抗剂稀释系列准备集中在分析缓冲区覆盖最终浓度范围从0纳米10µM (0.5% DMSO最终测定浓度)。120分钟后孵化在室温条件下,细胞被刺激的7×10µL集中ET-1获得欧共体的浓度测定gydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba。钙释放监测3分钟。KgydF4y2BabgydF4y2Ba计算,FLIPR痕迹受到空间均匀性校正和归一化之前跟踪在最后时间点对齐受体激动剂(ScreenWorks软件、分子设备)。然后,相对荧光单位(RFU)每个好出口的最大信号和所使用的专用集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba女巫软件计算ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba值(设置ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba值=使用固定最低(10µM macitentan)和curve-intrinsic最大)。KgydF4y2BabgydF4y2Ba通过Cheng-Prusoff方程[K值计算gydF4y2BabgydF4y2Ba=集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba/ (1 + (ET−1gydF4y2Ba机枪兵gydF4y2Ba)/ ECgydF4y2Ba50 _et−1gydF4y2Ba使用确定IC)]gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值,欧共体gydF4y2Ba50gydF4y2Ba每日ET-1(决定),ET-1刺激集中使用gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

细胞内钙释放人类PASMC测量使用gydF4y2Ba

PASMC被播种在生长介质在8000个细胞/(异常持续钙释放,见下文)进入384 -黑色明确底部无菌盘(格林尼)和隔夜37°C的5%孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然后,细胞培养基是由50µL /交换的染料缓冲区(哈佛商学院,0.1% BSA,消息灵通的20毫米,0.375 g / L NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba5毫米丙磺舒(σ)和3µM fluo-4]。细胞板是孵化1 h在37°C的5%股份gydF4y2Ba2gydF4y2Ba其次是平衡在室温下至少30分钟。在FLIPR板块受到协议包括两个添加10µL、测定的抑制效力(ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba和KgydF4y2BabgydF4y2Ba内皮素受体拮抗剂),分析对手的腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba或持续的钙离子通量的分析。钙痕迹记录和处理如下所述。对于KgydF4y2BabgydF4y2Ba决心,细胞补充6×10µL拮抗剂稀释系列准备集中在分析缓冲区覆盖最终浓度范围从0纳米到1µM。最后分析DMSO溶液的浓度是0.1%。10分钟或120分钟后在室温下,细胞被刺激的添加10µL ET-1 7×集中ET-1获得最终EC的浓度gydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba。钙释放监测3分钟。KgydF4y2BabgydF4y2Ba计算,FLIPR痕迹受到空间均匀性校正和归一化之前跟踪在最后时间点对齐受体激动剂(ScreenWorks软件、分子设备)。然后,RFU每个好出口的最大信号和所使用的专用集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba女巫软件计算ICgydF4y2Ba50gydF4y2BaIC(设置值gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值=使用固定最低(1µM macitentan,总是会造成信号完整封锁)和curve-intrinsic最大)。KgydF4y2BabgydF4y2Ba通过Cheng-Prusoff值计算方程使用集成电路决定gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值,敏锐地确定电子商务gydF4y2Ba50gydF4y2BaET-1, ET-1刺激集中使用。对腐败的决心gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba不同时代的价值观,细胞补充10µL拮抗剂稀释系列和孵化为120分钟,然后在室温下,细胞被刺激在添加10µL FLIPR的7×集中ET-1(最终化验浓度ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba),或者细胞被洗两次50µL /分析缓冲区(包含0.1% BSA的哈佛商学院,20毫米消息灵通的,0.375 g / L NaHC0gydF4y2Ba3gydF4y2Ba2.5毫米丙磺舒,pH值7.4)。5、10、20、30和60分钟的孵化在室温下,EC细胞被刺激gydF4y2Ba50gydF4y2Ba中gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba添加10µL ET-1的7×集中ET-1股票分析缓冲区。钙释放监测3分钟。估计受体的腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba,KgydF4y2BabgydF4y2Ba值计算通过使用对板块生成EC Cheng-Prusoff方程gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值ET-1, K的最早时间点gydF4y2BabgydF4y2Ba值明显转移与non-washed控制KgydF4y2BabgydF4y2Ba(K值gydF4y2Bab0gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba)使用。重大变化从KgydF4y2Bab0gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba(p < 0.05)确定使用单向方差分析测试包括Dunnett的文章使用GraphPadPrism软件和测试是用星号表示gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba。一个近似腐烂gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba然后计算假设一阶解离动力学:tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba= tgydF4y2BaxgydF4y2Ba/(日志gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(KgydF4y2BabxmingydF4y2Ba/ KgydF4y2Bab0gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba)与x =第一次重大变化的时间点KgydF4y2BabgydF4y2Ba后没有用。gydF4y2Ba

的决心对抗影响ET-1-induced维持细胞内钙释放,PASMC被播种在生长介质20000细胞/到FLIPR板块。1.5 h的附件后37°C / 5%的股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba、中交换了50µL /饥饿的介质(SmBM包含平时补充浓度的1/10)。第二天,细胞被染成如上所述,然后补充6×10µL浓缩稀释系列的时代分析缓冲区覆盖试验浓度在0纳米和1µM之间。最后DMSO浓度的测定为0.1%。孵化120分钟后在室温下,细胞被刺激的7×10µL稀释系列ET-1集中在分析缓冲区覆盖试验浓度在0纳米和1µM之间。缓冲区分析在这个试验包含2.5毫米丙磺舒类型。细胞内钙海拔监测25分钟。时代影响的第一反应阶段的分析计算,分析了KgydF4y2BabgydF4y2Ba价值的集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba8点生成纳米ET-1 concentation。分析持续calcium-response FLIPR痕迹受到空间均匀性校正和归一化之前跟踪在最后时间点对齐受体激动剂(ScreenWorks软件、分子设备)。持续的钙释放被量化计算FLIPR跟踪下的面积(曲线下的面积= AUC) 3分钟至23分钟后ET-1加法。此外,集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值为1.6 nM ET-1刺激浓度确定使用专用集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba女巫软件集成电路(设置gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值=使用固定最低(non-stimulated控制)和curve-intrinsic最大值)。KgydF4y2BabgydF4y2Ba通过Cheng-Prusoff值计算方程使用集成电路决定gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值,敏锐地确定电子商务gydF4y2Ba50gydF4y2BaET-1, ET-1刺激浓度(1.6 nM)使用。gydF4y2Ba

知识产权gydF4y2Ba1gydF4y2Ba测量gydF4y2Ba

所有测量进行使用IP-One HTRF工具包(Cisbio # 62 ipapec)后manufactureŕs协议。PASMC被播种在10000细胞/ 20µL /到384,白色,满足组织培养无菌盘格林尼(# 784080)和隔夜37°C的5%孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然后,中摘除和5µL /分析缓冲区(包含0.1% BSA的哈佛商学院,20毫米消息灵通的,0.375 g / L NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba,50 mM氯化锂,pH值7.4)补充道。然后,细胞补充与5µL /拮抗剂的一系列2×集中稀释测定缓冲区覆盖fincal浓度范围的清廉µM和孵化120分钟37°C的5%股份gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然后,2.5µL / ET-1 5×集中解决方案的分析缓冲区覆盖的最终浓度范围0 - 5添加了µM紧随其后的是37°C / 5%的孵化有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba20分钟或90分钟。细胞细胞溶解的2.5µL / conjugate-lysis缓冲区。然后,2µL / IPgydF4y2Ba1gydF4y2Bad2共轭和3µL / anti-IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba穴状化合物添加了铽,60分钟在室温下孵化后,测定板很兴奋在337 nm,发射光的比例在665 nm和620 nm记录使用PHERAstar (BMG labtech)。665海里/ 620海里排放比率被译成IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba通过对板块浓度生成校准曲线与已知浓度的IPgydF4y2Ba1。gydF4y2Ba知识产权gydF4y2Ba1gydF4y2Ba集中值导出到GraphPadPrism软件和ET-1量效曲线(CRC)的不同拮抗物浓度拟合的非线性回归使用Gaddum /席尔德分析函数可以克服的对抗。20分钟后ET-1 CRC刺激macitentan显示不可逾越的对立的存在和被安装GraphPadPrism的3参数非线性回归函数。平均独立实验中,IPgydF4y2Ba1gydF4y2Ba浓度每实验规范化使用最大响应ET-1没有拮抗剂作为参考点。KgydF4y2BabgydF4y2Ba值20分钟的刺激与ET-1获得通过Cheng-Prusoff方程计算的集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值为1.6 nM ET-1 IC(设置gydF4y2Ba50gydF4y2Ba计算:曲线内在最小(non-stimulated控制)和curve-intrinsic最大),欧盟gydF4y2Ba50gydF4y2BaET-1和刺激ET-1浓度(1.6海里)。席尔德KgydF4y2BabgydF4y2Ba值90 - min刺激ET-1(所有时代都是可以克服的)是由GraphPadPrism生成软件在应用Gaddum /席尔德非线性回归函数。KgydF4y2BabgydF4y2Ba值表示为几何的方法包括几何标准差σ3 - 4独立测量gydF4y2BaggydF4y2Ba这是计算标准差SD的pKgydF4y2BabgydF4y2Ba值如下σgydF4y2BaggydF4y2Ba= 10 exp (SDgydF4y2BapKbgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们要感谢苏珊弗洛雷斯手稿上的有价值的输入。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

构思和设计实验:詹。进行了实验:没有发生TS。分析了数据:没有发生TS詹。该报写道:詹MC。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

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