道德声明

动物被安置在单独的通风笼在特定病原体自由条件下,完全符合FELASA(实验室动物科学协会联合会)建议,在动物的房子设施的雅典学院的生物医学研究基金会(希腊雅典)。所有动物护理和治疗程序批准的机构动物实验伦理委员会和希腊农业部(许可证号码:K / 1054)。

动物

BMP-responsive eGFP表达(BRE-eGFP)老鼠[33]在C57BL / 6背景保持12∶∶12小时光暗周期动物设施的雅典学院的生物医学研究的基础。

组织学

胎儿肺组织的集合是由胚胎(E11和E12汽油)pseudoglandular (E13.5和E14.5),微管的(E17)和囊状(E19.5)阶段。一天中午的阴道栓被认为是胚胎0.5天(E)。此外,组织收集在产后1天(P1), 15 (P15)和出生后2个月(成人)。所有胚胎和P1肺切除手术,清理周围组织和放置在4%多聚甲醛(默克公司,104004)在PBS 24小时在4°C。分析P15和成人BRE小鼠右lung-lobes用于RNA /蛋白质分离,而左肺灌注轻轻混合4% PFA∶10月使用20克(2∶1)导管(Abbocath G717-A01, 4535 - 20),支气管的结扎和放置在4% PFA 24小时在4°C。之后,组织被安置在PBS为30%蔗糖24小时在4°C,用PBS,嵌入在10月(Shandon Cryomatrix)并将其保持在−80°C到使用。低温恒温器部分6 - 10µm(徕卡CM3050S)放在赖氨酸或者SuperFrost +幻灯片(门泽尔Glaser),在室温下保持为3小时硅胶(默克公司,101969),然后储存在−80°C。主要的抗体用于免疫染色:山羊anti-CC10(圣克鲁斯,SC9773),鼠anti-PECAM1 (CD31) (BD-Biosciences, 550274),鼠anti-VEGFR2 (eBiosiences 14 - 5821),兔子anti-SpC (Chemicon AB3786),兔子anti-CGRP (Sigma-Aldrich C8198),鼠标anti-α平滑肌actin-Cy3 (Sigma-Aldrich C6198),叙利亚仓鼠anti-T1α(DSHB 8.1.1),绵羊anti-BrdU(菲茨杰拉德,20-BS17),鼠标anti-Foxj1 (s·布罗迪博士的慷慨的礼物),鼠标生物素化的anti-Muc5ac (Abcam ab79082) anti-SM22alpha (Abcam ab14106)和鸡肉anti-GFP (Abcam ab13970)。使用的二次抗体:德州驴抗体红(杰克逊Immuno-research, 705-076-147),驴anti-chicken FITC(杰克逊Immuno-research, 703-096-155),山羊anti-rat AlexaFluor594(分子探针,A11007),山羊anti-rat AlexaFluor647(分子探针,A21247),山羊反叙利亚仓鼠AlexaFluor568(分子探针,A21112),山羊反叙利亚仓鼠AlexaFluor647(分子探针,A21541),驴anti-rabbit Texas-Red(杰克逊Immuno-research, 711-076-152),驴anti-sheep AlexaFluor568(分子探针,A21099)和驴anti-rabbit Cy5(杰克逊Immuno-research, 711-176-152)。幻灯片是安装使用延长黄金不变色试剂与DAPI(分子探针,P36931)。 Images were captured with a Leica DMRA2 fluorescent microscope equipped with a Leica DFC320 and DFC350 FX digital cameras and a Leica TCS-SP5 confocal microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Image analysis was performed using Adobe Photoshop CS3, ImageJ 1.41 and Volocity LE.

pSmad1/5/8 immuno-staining

组织部分准备在前一节中所述治疗1.5% H₂O₂在RT MetOH 30分钟在黑暗中内生peroxidise灭活。与2%正常驴阻塞后血清(σD9663) TBS-Tween 0.3%在室温下2小时,与兔子anti-pSmad1/5/8孵化的部分(Chemicon ab3848)抗体在一夜之间在4°C TBS-Tween 0.3%和培养1小时在室温下与二次anti-Rabbit合(圣克鲁斯,SC2301)。幻灯片使用轻拍色原开发(DAKO K3468)开发根据制造商的指示。正常兔免疫球蛋白部分被用作控制主要抗体(同形像控制)。核和迈耶的Hematoxylene复染色。

RNA隔离和实时定量PCR分析

总RNA从老鼠肺部孤立使用Tri-Reagent协议(σ,圣路易斯,密苏里州)和RNA的产量和纯度是electrophoretically和spectrophotometrically来决定。DNase治疗后与RQ1 RNase-Free DNase (Promega M160A), 2µg反向转录成RNA的cDNA使用M-MLV逆转录酶(Promega M170B)和随机引物(表达载体,58875)根据制造商的指示。引物对实时PCR被设计使用设计师v7.01灯塔软件(总理Biosoft国际,帕洛阿尔托,CA)。序列表给出使用的引物对S1。PCR反应包含SYBR®绿色ER™qPCR超级混合通用(表达载体,11762 - 500),每个引物200海里(表达载体,卡尔斯巴德)和0.2µl 20µl互补dna模板的反应体积。RT-qPCR循环参数初始孵化在50°C 2分钟,变性在95°C 10分钟紧随其后50周期在95°C和15秒40秒60°C。数据收集进行了使用Chromo4实时PCR检测器(BioRad)与内髓监控和分析3表达分析软件(BioRad)。信使rna表达的相对水平根据ΔΔCt计算方法[34]。

免疫印迹分析

蛋白质提取细胞均质在裂解缓冲包含50 mM Tris-Cl pH7.6, 150毫米氯化钠,1% (v / v) Triton×100 5毫米EDTA pH值8.0,1毫米PMSF, 1∶25 (v / v)蛋白酶抑制剂(罗氏应用科学,11836153001),2毫米Na₃签证官₄焦磷酸钠,氟化钠5毫米,2毫米,13.3毫米β-Glycerophosphate二钠盐。均质细胞离心机在13.000 rpm 15分钟4°C和蛋白质样本存储在−20°C到使用。检测pSmad1/5/8分离蛋白质被转移到Immobilon-P膜(微孔,IPVH00010)和分析使用兔子anti-pSmad1/5/8 (Chemicon ab3848 1∶1000)加上anti-rabbit合(圣克鲁斯SC2301 1∶5.000)和anti-β肌动蛋白(Sigma-Aldrich A5316 1∶5.000)结合anti-mouse合(Sigma-Aldrich A4416 1∶40.000)。微是使用ImageJ 1.41软件完成的。

体内肺组织损伤和修复模型

女性BRE-eGFP动物之间长达12 - 16周的年龄与萘或博来霉素治疗。萘治疗,300毫克/公斤萘仅在玉米油(车辆)或车辆是由intra-peritoneal注入。肺组织收集在2、3、6、9 naphthalene-treatment。博来霉素治疗,博来霉素(0.033户/鼠标,日本Kayaku有限公司Bleocin)仅在PBS或PBS稀释(车辆)管理intra-tracheally 30µl总量。肺被收集在天2、4和12 post-bleomycin-treatment。

来自体内的胎儿肺移植组织的文化

分离、培养转基因E12.5肺外植体为8或24小时,在1∶1混合DMEM: F12 (GiBCO, 11039),补充了Insulin-Transferrin-Selenium (GiBCO, 51300 - 044)和抗生素。外植体放置在图像比对Track-Etched膜(绘画纸,110414)和他们孵化4板(热科学,144444)。LDN193189(轴突轴突MedChem, 1509)和SB431542 (Sigma-Aldrich S4317) 10µM的使用浓度。未经处理和车辆(DMSO Sigma-Aldrich D2650)治疗肺被用作控制。在一些实验中,E12.5肺外植体处理100 ng / ml BMP4 (Peprotech, 120 - 05年等),或250 ng / ml FGF10 (Peprotech, 100 - 26)或500海里声波刺猬(嘘)agonist-Purmorphamin (Calbiochem 540220) 8小时。

内胚层的味蕾和远端肺间质隔绝E12.5肺如前所述[35],[36]。短暂的,孤立的远端肺提示治疗大约5分钟0.5%胰蛋白酶胰液素2.5%,哈佛商学院1×(Gibco, 14170)在冰。使用26个g针头和上皮间质被芽以及孤立的间质被置于(1∶1)的混合生长因子减少人工基底膜(BD生物科学,356230)和DMEM: F12 (GiBCO, 11039) 10% FCS (GiBCO, 10500),笔喉炎的症状(GiBCO、15070、1∶100)和孵化8小时37°C, 5%的公司₂。

离体培养初级成人肺细胞

成人原发性肺细胞分离中描述[37]小的修改。短暂、肺孤立,切成小块,消化一夜在4°C和0.1%蛋白酶type-XIV (Joklik Sigma-Aldrich P5149)工程管理硕士(西格玛奥德里奇,8028)包含抗生素(Gibco, 15070)。肺片被Joklik MEM的补充10%的边后卫(Gibco 10500),轻轻用移液器吸取多次释放细胞,通过70µm过滤器(BD生物科学,352350)。细胞被洗mcdb - 201 (Sigma-Aldrich M6770)包含Insulin-Transferrin-Selenium (Gibco, 51300 - 044)和可行性用台盼蓝测量。10⁶细胞(10⁶/毫升)在12-well培养板(Nunc, 150628)涂上牛胶原蛋白(Nutacon 5409) 24小时。涂料是用100µg /厘米²胶原蛋白,为1小时37°C。此后,文化与mcdb冲洗- 201去除分离细胞和500µl mcdb - 201和Insulin-Transferrin-Selenium 1 ng / ml EGF (Peprotech, 315 - 09年)补充道。1周后,殖民地的上皮细胞形成和感染重组腺病毒表达持续激活ALK3 (caALK3) caALK5, Smad1或Smad3。48小时后孵化处理细胞的细胞化学或用于RNA提取。

隔离肺亚种群的流式细胞仪

P3小鼠麻醉,腹腔开放和心室静脉和动脉被切断。胸部被打开,右心房刻痕。肺灌注通过心脏的右心室1毫升冰冷的1×PBS使用26个g注射器,切成小块用刀片和消化的酶组合(弹性蛋白酶(Sigma-Aldrich, 45124): 3 U / ml,胶原酶:0.1 U / ml, Dispase: 0.8 U /毫升(罗氏应用科学,11097113001)和DnaseI 50µg /毫升(PBS Sigma-Aldrich DN25], 37°C与旋转1小时。相同体积的哈佛商学院^{+ +}[hbs 1×(Gibco, 14170),补充2% FCS (Gibco, 10500), 0.1玫瑰(细胞分裂缓冲Sigma-Aldrich H0887)和15% (Gibco, 1315 - 016)或EGTA 2毫米)是补充道。细胞被轻轻搅拌几次,经过40µm细胞过滤器(BD生物科学,352340),1200转离心10分钟,在4°C。上层清液都被丢弃而细胞re-suspended在哈佛商学院^{+ +}和计算血细胞计数器。肺细胞的特定人群孤立使用BD FACS-Aria IIu染色细胞分选仪的孤立肺细胞如前所述Teisanu et al。[38]与生物素化的anti-CD31 (BD生物科学,553371),anti-CD45 (Biolegend, 103103)和anti-CD34 (eBioscience, 13-0341-85)与链霉亲和素结合APCCy7 (Biolegend, 405208),与anti-Sca1-Alexa Fluor647 (Biolegend, 108118) andanti-EpCamPECy7 (Biolegend, 118216)。DAPI包括了死细胞排斥。的EpCam^pos-CD31^负的-CD45^负的cd34^负的细胞分为Sca1^负的和Sca1^低和每一个两个种群被分类成eGFP分离^负的,eGFP^低和eGFP^高。孤立的细胞为进一步使用体外培养、RNA表达或免疫印迹分析。

排序的上皮细胞的体外培养基底膜基质如前所述[38]与一些细微的修改。50µl 2×10³排序的细胞和2×10⁵小鼠肺间质细胞(MLg)与相同体积的混合生长因子减少人工基底膜(BD生物科学,356230)。细胞悬浮在基底膜基质被添加到商会24-well Transwell过滤器插入(BD生物科学,353095)和放置在24-well,乘,文化包含DMEM板块:F12培养基(GiBCO 11039)补充5% FCS (GiBCO, 10500), Insulin-Transferrin-Selenium (GiBCO、51300、1∶100),笔喉炎的症状(GiBCO、15070、1∶100)、两性霉素B (GiBCO、15290、1∶1000)和10µM SB431542 (Sigma-Aldrich S4317)。培养基是改变每隔一天,直到第八天。SB431542然后删除和文化是维持一个额外的4天前一夜之间固定在4°C和4% PFA在PBS。基底膜基质被冻融,清洗新鲜PBS。Transwell插入的内容是嵌入在10月(Shandon Cryomatrix)和10µm部分是由低温恒温器(徕卡CM1950)。

虽然在人工基底膜上皮殖民地开发即使没有SB431542它的存在导致了更多更大的殖民地,因此这个文化系统者优先。Mlg细胞的治疗与SB431542 24小时导致大幅增加FGF10信使rna合成(数据未显示)表明基质细胞衍生FGF10可能潜在机制的一部分。

统计分析

单向方差分析(ANOVA)结合“Bonferoni多重比较检验”,是使用GraphPad棱镜完成。(* /^#)P < 0.05, (* * /^{# #})P < 0.01, (* * * /^{# # #}P < 0.001)。

时空表达模式的BRE-eGFP记者在肺癌发展

先前的研究利用两个独立的规范BMP通路记者鼠标线,一个窝藏BRE-eGFP[33]和另一个窝藏BRE-lacZ等位基因[39]了表达BRE-eGFP和BRE-lacZ记者分别在气管上皮和primary-bronchi已经在E10-E12.5。扩展这些发现和地图详细规范的时空模式BMP信号在肺部,我们收集BRE-eGFP记者小鼠的肺组织胚胎天E11 E12汽油,E13.5, E14.5, E16天E17.5 E19.5和产后第1天,15和2个月eGFP表达和分析组织部分。我们的分析表明,在E11 BRE-eGFP记者已经活跃了,达到最大水平左右出生,成年之后下降到最低水平(图1和图S1)。

E11, eGFP表达仅限于大肺血管的内皮细胞,和发展中血管网络的实质。只有很小一部分的sub-epithelial平滑肌细胞(smc)非常低水平的表达eGFP E12汽油(图S1)。然而,从E13.5起健壮的eGFP表达中检测出sub-epithelial smc位于近端区域发展中航空公司(图1和图S1和S2)。

从E16天起,eGFP的表达检测在近端和远端上皮隔间。在近端上皮(即发展中国家航空公司)eGFP的表达表现出proximal-distal轴模式,高eGFP表达在支气管和大型航空公司和令人惊讶的是没有表达的远端部分气道树生长。有趣的是,孤立eGFP的集群^pos细胞被观察到的气道的各点。在远端肺间,eGFP表达中检测出立方上皮细胞发展中小囊(图1 b)。当肺形态发生接近完成,eGFP信号减少在成年小鼠,(∼2个月大),很少有eGFP^pos细胞被发现散落在支气管上皮和大型航空公司,在肺泡腔室和一个族群的心肌细胞的外层中模肺静脉(图1 b)[40]。

表达BRE-eGFP记者在发展中肺镜子忠实的激活规范BMP通路

尽管BRE元素的能力来监控BMP介导的转录激活已之前已经证明[33],[39],[41]进行更多的研究,进一步提高信心对转基因表达的肺。eGFP mRNA表达的动力学和BMP目标基因Id1被定量PCR分析。EGFP和Id1 mRNA水平遵循相似的动力学EGFP蛋白表达,达到最高水平大约出生(图2一个)。P1肺因此保持酶的消化和肺细胞被分离细胞分类的基础上,eGFP表达eGFP - (eGFP^负的),eGFPlow (eGFP^低(eGFP)和eGFP高^高)细胞(图2 b)。免疫印迹分析蛋白质提取物分离人口eGFP的表达之间的相关性良好,pSmad1/5/8水平(图2 c, D)。分析eGFP的mRNA水平和BMP-regulated目标基因,如Smad6 Id1和Id3展示了很好的相关性eGFP的表达和激活的BMP目标(图2 e)。有趣的是,Id2 mRNA的表达没有与eGFP的表达水平。此外,治疗胚胎肺外植体体外与BMP -或TGFβ-receptor抑制剂导致抑制或增强BRE-eGFP转基因表达,分别(见下文图3 b)。此外,治疗胚胎肺与FGF10外植体,一个已知的诱导物BMP4的生产由内皮细胞远端,或重组BMP4导致大幅上调eGFP的表达(图S3)。治疗肺与purmorphamin外植体,嘘受体激动剂,导致eGFP染色模式的再分配,包括一个小的增加eGFP表达sub-mesothelial细胞在一个狭窄的区域和减少eGFP表达更多的中央地区的间质。这种模式的表达可能源于嘘由间充质细胞介导FGF10合成减少[35]这反过来导致更多局限在BMP表达区。

也进一步验证了BRE-eGFP记者动物和评估其灵敏度相比,染色组织核pSmad1/5/8 immuno-histochemistry,彩色邻近组织的部分P1肺、发展阶段示威的最大BRE-eGFP记者活动,与anti-eGFP anti-pSmad1/5/8抗体。所示图S4,核pSmad1/5/8中检测出强烈的地区eGFP immuno-staining证明一致性BRE-eGFP记者活动和pSmad1/5/8 immuno-staining (图S4)。不幸的是,在我们的手中anti-pSmad1 5 8试剂我们分析到目前为止无法检测肺组织中的pSmad1/5/8 E19.5之前从胚胎阶段,因此我们不能确认eGFP的相关性和pSmad1/5/8处于早期发展阶段。大量的研究表明,测量pSmad1/5/8作为唯一指标的价值规范BMP途径激活问题,因为存在pSmad1/5/8并不一定导致转录BMP目标基因的活动。规范BMP途径活性是由细胞特定类型Smad-interacting转录因子,co-activators和若。例如Tbx1可以绑定到Smad1,干扰Smad1 / Smad4交互,减少骨形态发生蛋白转录活动而不影响pSmad1/5/8在反应细胞的数量[42]。此外,Leeuwis et al。[41]证明BRE-eGFP动物的肾脏,而BRE-eGFP的表达式模式表现出良好的相关性与BMP7和BMP目标基因的表达Id1、Smad6,相比之下pSmad1/5/8展出了表达式模式没有与BRE-eGFP的表达,BMP7, Id1或Smad6。因此,一个更安全的评估规范BMP途径应该结合分析几个已知BMP目标基因和pSmad1/5/8 immuno-stainings当这在技术上是可行的。总的来说,蒙泰罗等的分析。[33],Leeuwis等。[41]所述,结果表明BRE-eGFP转基因线报告相当忠实的激活规范BMP通路已和体外,因此它提供了一个额外的方法来评估潜在的规范BMP途径激活。

激活规范BMP-pathway发展中血管和sub-epithelial平滑肌网络在早期肺癌的发展

识别规范BMP信号的假定的目标细胞,组织收集的部分肺在不同的发展阶段与抗体染色具体适宜细胞标记。双免疫染色eGFP和CD31 (PECAM-1),成熟的内皮细胞的表面标记,或VEGFR2血管祖细胞的表面标记(图S1),表明CD31的大部分^pos或VEGFR2^pos细胞E12汽油,E14.5 E17也eGFP^pos(图3一),确认eGFP的网络^pos薄壁组织细胞组成规范的血管细胞和骨形态发生蛋白通路被激活在发展中肺血管网络的建立。在P1,∼CD31的40%^pos细胞被eGFP^pos,从P15起eGFP的数量^pos-CD31^pos细胞减少和成人他们发现不了的。与相似的动力学观察EGFP表达对大血管内皮细胞(图3一)。很少eGFP^posα-平滑肌肌动蛋白(αSMA)双阳性细胞在血管壁被发现(图3一,白色箭头在P1船)。

验证的功能意义BMP信号发展的肺血管网络发展中,体外文化E12汽油肺外植体处理各自的BMP -或TGFβ/ Activin-receptor抑制剂LDN193189和SB431542。治疗肺移植培养24小时eGFP SB431542导致大幅增加,Id1、和FGF10 mRNA表达,而治疗LDN193189导致减少ineGFP Id1 FGF10 mRNA表达增加,可能补偿,在BMP4和VEGFαmRNA表达(图3 b和D)。值得注意的是,即使是8小时的治疗SB431542导致CD31的密度的增加^pos网络和eGFP的增加更为明显^pos网络,然而,类似的治疗LDN193189导致减少密度和eGFP的连通性^pos和CD31^pos细胞(图3 c)。

总的来说,这些发现表明在pseudoglandular阶段,过程中,大部分的分支形态发生被认为,规范BMP信号在肺的一个重要目标是发展中肺血管。

强eGFP表达中检测出的developingsub-epithelial SMC层近端从E14.5 P1(航空公司图3一和图S1&S2)。eGFP的表达,有趣的是只涉及部分sub-epithelial smc,被P15察觉。有人提议sub-epithelial smc源自sub-mesothelial池,FGF10-expressing,间充质细胞。下几个信号通路的影响,例如那些由FGF, BMP,嘘,和Wnt,这些细胞增殖和被动地把周围的近端部分发展中气道树[35],[43],[44],[45],[46]。http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160611010189——bb0125To地图更精确时间激活sub-epithelial SMC的BRE-eGFP记者在开发室我们孤立的侯,P12和P13.5肺BRE-eGFP记者动物和分析co-expression eGFP SM22a, SMC原始和成熟的一个标志[47]或αSMA更多差异化smc的标志。所示图印地,观察SM22α表达式sub-epithelial人口发展中近端周围细胞的航空公司已经在胚胎阶段E11,αSMA表达明显只有在最SM22a的近端部分^pos区和eGFP表达αSMA显然是发现^pos区只有在胚胎阶段E13.5(αSMA很少^pos细胞表达非常低水平的eGFP E12汽油)。这些发现符合规范的观念BMP信号不涉及原始smc而是成熟αSMA表达sub-epithelial smc。

规范发展中气道上皮细胞BMP途径激活

虽然强大的信徒活动中检测出气管和主支气管最早E10-E12.5[33],符合BMP信号在气管的证明作用的发展[48],[49],BMP-driven eGFP-expression没有检测到的上皮车厢小叶间航空公司在肺的微管的阶段发展。所示图1和4,最小eGFP表达检测在E14.5大型航空公司,和只有在E17强eGFP信号中检测出软骨和大型航空公司proximal-distal轴模式后,信号更强烈的近端支气管树的一部分。BRE-eGFP组织化学染色肺组织部分与抗体特定为克拉拉细胞特定分化标记Scgb1a1 / CCSP CC10(以下称为CC10),显示的表达eGFP记者从E17.5和开始,在细胞腔的发展中航空公司。强CC10表达E19.5周围被发现,大约两天发生之后eGFP的表达在气道上皮细胞(图4一)CC10表达eGFP展出部分重叠的区域,与中高度表达eGFP近端部分和CC10高度表达的远端部分发展中气道树。eGFP的区^pos-CC10^pos细胞似乎把CC10分开^pos上皮eGFP的人口^pos气道的地区。产后CC10扩张^pos地区开展航空公司是伴随着eGFP的逐渐减少^pos区域(图4一)。

有趣的是,地区航空公司表现出增强的eGFP表达检测接近的气道各点接近neuro-epithelial身体(nebs3级)。分析eGFP的表达与CC10 CGRP怎样,neuro-epithelial细胞分化标记,表明eGFP^pos-CC10^低“帽子”集群形成的细胞CGRP怎样^pos细胞。从E19.5 eGFP^pos-CC10^低“帽”细胞(绿色箭头图4 b从eGFP)分离^负的-CC10^pos区细胞的双重积极的上皮细胞(黄色箭头图4 b)。值得注意的是,eGFP的区域^pos-CC10^pos细胞恰逢区richin nebs3级(图S5)。从P15以外,唯一NEB-associated eGFP^pos细胞CGRP怎样^posneuro-epithelial细胞(蓝色箭头图4 b)。

eGFP的绝大多数^pos细胞不表达分泌气道上皮的标志(CC10),其可能的关系调查了气道纤毛上皮细胞和抗体染色Foxj1纤毛细胞特定分化标记。所示图S6eGFP,一个非常小的部分^pos细胞被FoxJ1^pos(黄色箭头图S6)。

提出了两种模型对BMP信号在肺分支形态发生的作用。一个模型表明,间充质派生FGF10诱发Bmp4远端芽上皮表达的限制,以自分泌的方式,Fgf10-mediated芽产物[45],[50]。其他模型,基于微分响应的远端上皮味蕾BMP4存在与否的间质,建议BMP4远端上皮细胞产生的行为以自分泌的方式限制远端上皮增殖芽,以旁分泌的方式,在相邻的间质,诱导生产远端上皮间充质信号增强扩散的味蕾[51]。因此,根据后者模型的消极或积极的影响BMP信号分支之间的动态平衡的结果负自分泌和积极的旁分泌机制。

没有eGFP记者激活的远端芽分支气道树(图1和4)促使我们研究是否这是一种内在的结果远端上皮无法激活规范BMP通路,或者按照第二个模型,动态相互作用的结果,与邻间质。因此,自由远端上皮间质芽和上皮间质自由孤立如前所述[35],[36]并在基底膜基质培养的。值得注意的是,在8小时内孵化,BRE-eGFP记者强烈上调mesenchyme-free上皮味蕾,相反它孤立的间质表现出下降的趋势(图5)。这些发现符合布拉格的模型等。[51]而且表明,难以捉摸的,间质,上皮生长促进信号可以行动的负调节激活规范BMP在远端上皮味蕾通路。

集体,上述结果表明,激活规范BMP通路的气道上皮细胞的同时,微管的的开始阶段,当肺转移的发展计划从分支的发展形态发生明显的呼吸道上皮细胞隔间[52]。记住,气体进行航空和血液进行船舶需要开发协调方式和妥善并列最佳气体交换在成人的支持,这是可以理解的技巧发展航空公司应相互地交流发展,分化或指导信号与发展中脉管系统和其他间充质细胞,以确保协调发展和空间这两个分支系统的集成。发现中断增长血管网络的肺移植组织影响分支形态发生减少主要的“正交分岔”上皮小管[53],[54]的影响,本文提供的研究结果证明邻间质骨形态发生蛋白的激活规范途径记者(图5)说明了相声的重要性之间的上皮细胞和血管细胞在早期肺癌的发展。

应当指出,由于我们未能成功应用anti-pSmad1/5/8 immuno-histochemistry E19.5提前从胚胎组织阶段,我们不能明确地排除目前规范BMP通路的激活提示早期的分支内胚层。需要进一步的研究来评估是否BRE-eGFP记者并不活跃在远端内胚层,因为:1)非规范BMP途径主要涉及;然而,b)规范化BMP通路活跃不到激活阈值需要激活BRE-eGFP记者;或c)间质之间的动态平衡和内胚层大部分时间保持BRE-eGFP记者不活跃(图5),允许在临界点的分支过程瞬态峰值规范BMP通路信号到达细胞核和调节目标基因的表达。

规范在肺泡上皮细胞BMP途径激活

表达BMP骨形态发生蛋白受体的配体或失活的远端部分发展中肺肺泡发展导致戏剧性的缺陷[14],[16],[18],[19]。自eGFP表达高度增加BRE-eGFP小鼠肺实质的囊状和肺泡阶段期间,功能性肺泡形成的时期,我们eGFP的本质特征^pos这部分发展中肺细胞。组织部分从不同的发展阶段进行了分析通过co-staining eGFP和pro-surfactant蛋白C (pro-SpC),ⅱ型pneumocytes的标志。所示图6和图S2,eGFP染色在pseudoglandular阶段局限于内皮细胞,peri-bronchial近端气道平滑肌细胞。Pro-SpC^pos在远端气道上皮细胞均匀eGFP^负的在这个发展阶段(图S2)。相比之下,开始在微管的阶段(E17)和坚持,直到大约P15 eGFP的人口^pos-pro-SpC^pos细胞出现在远端肺隔间(图6)。的程控^pos细胞在此阶段的发展被认为是不成熟的二型pneumocytes[55]。的形态学分析表明,囊状和肺泡阶段期间,pro-SpC的大约一半^pos肺泡细胞eGFP^pos。成人组织,alveolarization完成,包含一个非常小的eGFP的数量^pos-pro-SpC^pos肺泡细胞(0.5∼-1%)(图6 b)。高分辨率的共焦显微镜分析显示,在所有的发展阶段分析只有很小一部分的i型pneumocytes eGFP^pos(图S7)。有趣的是,异位表达文化的本构ALK3成人原发性肺细胞导致增加pro-SpC(∼6倍)和Id1(∼15倍)mRNA水平,未经处理或ALK5ca相比治疗组(图6 c)进一步规范bmp信号暗示二型pneumocytes的生理学。

eGFP的顺序出现^负的程控^pos(不成熟的二型pneumocytes), eGFP^pos程控^pos和eGFP^负的程控^pos(成熟的二型pneumocytes)可能表明eGFP^pos程控^pos人口是一个中间步骤,不成熟的二型pneumocytes之前必须通过发展成成熟功能二型pneumocytes主管。这个结论与规范兼容发现老鼠的BMP通路中断由于删除Smad1基因的积累在他们发展肺部大量周期性acid-Schiff (PAS)阳性不成熟的二型pneumocytes[19]。

上面的发现表明在cannalicular阶段,规范的一个重要目标BMP信号在远端肺舱是发展中ⅱ型pneumocyte人口。这可以解释动物的戏剧性的远端肺表型与远端肺上皮细胞BMP信号中断[15],[16],[18],[19]。

很有趣的与微管的的开始阶段,当肺转移的发展计划从分支的发展形态发生明显的呼吸道上皮细胞隔间[52],BMP-responsive eGFP记者被激活在两个上皮域,即气道近端及远端发展肺泡囊。规范的结论BMP信号变成cannalicular肺上皮细胞的关键发展阶段是一致的基因研究表明删除Bmpr1早些时候[16],[18]或Smad1[19]和异位表达BMP信号负调控因子如XNoggin和显性负ALK6[15]SpC-promoter-driven表达,导致可见只有E15-E16的肺部发育缺陷,即完成后的分支形态发生。

eGFP的^pos上皮车厢被浓缩为上皮细胞祖细胞能够在人工基底膜形成菌落

eGFP的本地化^pos细胞附近的nebs3级和最小重叠细胞表达eGFP和专门的分泌(CC10)或纤毛细胞的标记(FoxJ1)促使我们调查是否积极规范BMP信号可能定义与一个不成熟的祖细胞表型。因此,一个两个小时的脉冲BrdU给孕妇在E17标签循环上皮细胞随后被anti-BrdU抗体染色。BrdU^pos气道上皮细胞占∼6.7%的表面进行航空公司和被均匀分布在整个气道树(图7)。这种模式兼容的结果Giangreco et al。[56]和罗林斯等。[57]证明了随机分布的祖细胞有助于正常上皮内稳态。的BrdU^pos细胞∼77.8%是eGFP^负的和∼22.2%是eGFP^pos,表明这两个人口导致气道上皮的扩张室(图7 b)。尽管eGFP的主导地位^负的-BrdU^pos细胞(在绝对数字),∼eGFP的13.4%^pos是BrdU^pos机,而eGFP∼5.5%^负的细胞(图7 c)。

进一步比较eGFP的增殖潜力^pos和eGFP^负的不同上皮细胞数量从分离孤立肺组织的细胞分类和分析体外克隆形成能力。先前描述的协议[38],EpCAM^pos,血统负(即CD45^负的-CD31^负的cd34^负的)细胞BRE-eGFP转基因动物被细分为Sca1^负的和Sca1^低细胞。最后,Sca1^负的和Sca1^低细胞被分类成eGFP分离^负的,eGFP^低和eGFP^高细胞分别(图7 d)。孤立的细胞被MLg支线细胞三维培养基底膜基质文化系统[38]修改由我们中的一些人(HC和br),共培养细胞在基底膜基质的八天TGFβ受体抑制剂的存在SB431542(10µM),紧随其后的是一个额外的四天没有抑制剂。

林^负的-EpCAM^pos-Sca1^低细胞培养,与之前的报道相一致[58]大囊性上皮,引起主要殖民地和林^负的-EpCAM^pos-Sca1^负的细胞产生几乎只小型紧凑上皮殖民地(图7 e)。Sca1单独使用的能力^低和Sca1^负的细胞的表达水平与与相应的eGFP BRE-eGFP记者^高种群表现出最高的单独使用容量(图7 f)。先前的研究已经表明,囊性殖民地来自林^负的-EpCAM^pos-Sca1^低细胞包含气道上皮细胞(Muc5Ac的祖细胞^pos),而紧凑的殖民地来自林^负的-EpCAM^pos-Sca1^负的细胞主要包含程控^pos肺泡祖细胞[58]。保持一致,如所示图7 g,而所有殖民地来源于Sca1紧凑^负的亚种群表现出类似的程控^pos-Muc5Ac^负的染色模式,大囊性来源于Sca1殖民地^低亚种群表现出更异构的染色模式其中大约一半Muc5Ac表达,其中一半表达程控。

值得注意的是,成年林^负的-EpCAM^pos-Sca1^负的上皮细胞基底膜基质单独使用能力非常低[38]。fromLin殖民地的发展^负的-EpCAM^pos-Sca1^负的细胞在当前的研究中最有可能是由于这一事实的分析完成了P3肺仍处于强烈的肺泡的发展。

先前的研究已经提供了两种类型的气道上皮细胞祖细胞的证据,一个随机分布的航空公司保持正常上皮内稳态响应上皮的轻伤,第二,与前所述祖细胞领域可以更新耗尽克拉拉细胞上皮损伤严重[38],[56]。随机分布eGFP^负的-BrdU^pos发展中肺细胞检测(图7而eGFP)可以代表前类型^pos上皮细胞可以代表后者类型的祖细胞。一旦肺开发完成后,体内平衡,人口流动率低,维护上皮可以支持的克拉拉细胞分布[38],[56]因此活跃的BMP信号可能不再需要。eGFP表达的下降在肺部的成年BRE-eGFP基因转移可能反映了。

复活的BRE-eGFP记者在成人肺组织损伤后显示bmp信号的积极作用在成人肺损伤后修复

eGFP表达的急剧下降的成人肺BRE-eGFP记者协会的老鼠和eGFP表达与上皮祖池促使我们调查记者是否被激活在成人肺损伤和修复。成人BRE-eGFP动物进行分析建立在两个模型肺组织损伤和修复,即萘和博来霉素诱导肺损伤模型。萘的克拉拉细胞治疗导致选择性耗尽航空公司[59]。相比之下,博来霉素导致上皮细胞死亡、急性炎症和fibro-proliferative肺外围的重构[60]。Immuno-staining CC10和CGRP怎样证明,到第三天,萘CC10治疗造成了大量减少^pos细胞在气道,CGRP怎样的数量的增加^pos细胞每内,大幅提高BRE-eGFP气道分支节点和终端细支气管(记者活动图8)。这种CC10本地化和eGFP记者表达模式与之前确定耐化学维护上皮细胞祖细胞的解剖位置[61],[62],[63],[64]。

分析在不同时间点后naphthalene-treatment证明eGFP的数量逐渐增加^pos支气管上皮细胞明显在第二天和最大增长15倍控制水平第9天post-naphthalene治疗(图8 b)。第二天,eGFP的增加^pos气道上皮细胞CGRP怎样涉及数字^pos和CGRP怎样^负的-CC10^低细胞(图8 c和D)。此后,尽管eGFP的总数^poscgrp怎样^pos从天2 - 9细胞保持稳定,eGFP的波^pos-CC10^低cgrp怎样^负的周围的细胞达到最大第三天是紧随其后的是一波又一波的eGFP^pos-CC10^pos细胞达到高原第9天(图8 d)。

有趣的是,eGFP的分布和CC10表达重现了观察在肺癌早期发展模式即eGFP^pos-CC10^pos细胞分离eGFP^pos-CC10^低从显然是新成立的eGFP^负的-CC10^pos细胞。外观的动力学和相对定位这些细胞在组织一致认为他们可能代表顺序从eGFP的发展阶段^pos-CC10^低eGFP的^负的-CC10^pos表现型。

博来霉素是一种抗癌药物,导致肺损伤和纤维化[60]。所示数字9和9 b、治疗成人intra-tracheal BRE-eGFP动物管理博来霉素导致大量复活在ⅱ型pneumocytes (Pro-SpC eGFP的记者^pos)。在第一天的治疗eGFP^pos细胞主要是立方形的SpC^pos细胞。从第四天开始立方形的和鳞状eGFP^pos细胞是肺泡地区发现的。有趣的是,鳞状eGFP^pos细胞被T1α-expressing i型pneumocytes和总是局部之间的边界影响,显然正常组织(图9 c)。我们假定立方eGFP^pos细胞中观察到的早期阶段,博来霉素诱导的反应代表了赔偿的祖人口膨胀和区分eGFP^pos-T1α^低细胞中观察到后期修复受损的肺泡上皮细胞。然而,需要进一步的研究来验证这一假设。

总的来说,我们的研究结果表明,规范BMP通路重新启动在成人肺损伤的方式相似的激活途径在肺癌早期发展,强烈支持它的重要性在成人肺组织损伤修复。