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研究文章

吸烟者慢性阻塞性肺病患者中央气道β防御素-2降低，远端气道未降低

  • 伊丽莎白的速度，

    对这项工作有同样贡献的有:伊丽莎白·佩斯，玛丽亚·费拉罗

    pace@ibim.cnr.it

    联系意大利巴勒莫国家研究委员会生物医学和分子免疫学研究所

    ⨯
  • 玛丽亚·费拉罗，

    对这项工作有同样贡献的有:伊丽莎白·佩斯，玛丽亚·费拉罗

    联系意大利巴勒莫国家研究委员会生物医学和分子免疫学研究所

    ⨯
  • Marta Ida Minervini，

    联系美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系

    ⨯
  • Patrizio Vitulo,

    联系地中海移植和高级专科治疗研究所，ISMETT，巴勒莫，意大利

    ⨯
  • Loredana Pipitone,

    联系地中海移植和高级专科治疗研究所，ISMETT，巴勒莫，意大利

    ⨯
  • Giuseppina Chiappara,

    联系意大利巴勒莫国家研究委员会生物医学和分子免疫学研究所

    ⨯
  • Liboria锡耶纳,

    联系意大利巴勒莫国家研究委员会生物医学和分子免疫学研究所

    ⨯
  • Angela Marina Montalbano，

    联系意大利巴勒莫国家研究委员会生物医学和分子免疫学研究所

    ⨯
  • 马尔科姆•约翰逊

    联系葛兰素史克研究和发展有限公司，乌克斯布里奇，米德尔塞克斯，英国

    ⨯
  • 马克Gjomarkaj

    联系意大利巴勒莫国家研究委员会生物医学和分子免疫学研究所

    ⨯

吸烟者慢性阻塞性肺病患者中央气道β防御素-2降低，远端气道未降低

  • 伊丽莎白·步伐
  • 玛丽亚·费拉罗
  • Marta Ida Minervini，
  • Patrizio Vitulo,
  • Loredana Pipitone,
  • Giuseppina Chiappara,
  • Liboria锡耶纳,
  • Angela Marina Montalbano，
  • 马尔科姆•约翰逊
  • 马克Gjomarkaj
公共科学图书馆
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摘要

背景

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的肺防御改变可能促进远端气道细菌定植。上皮细胞Toll样受体(TLR)的表达/激活和β 2防御素(HBD2)的释放对肺防御机制有重要影响。

方法

TLR4和HBD2的上皮表达在正在吸烟的慢性阻塞性肺病(s-COPD;n = 17)，前吸烟者慢性阻塞性肺病(ex-s-COPD;n = 8)，无COPD的吸烟者(S;n = 12)，来自非吸烟非copd受试者(C;n = 13)。

结果

在远端气道中，s-COPD高表达TLR4和HBD2。在中央气道中，S和S - copd TLR4表达增加。与S组和前S组相比，S - copd中央气道中HBD2表达较低。s-COPD微解剖支气管上皮细胞实时PCR显示HBD2基因表达减少。HBD2表达与FEV1/FVC比值呈正相关，与香烟烟雾暴露呈负相关。在支气管上皮细胞系(16hbe)中，IL-1β显著诱导HBD2 mRNA的表达，而香烟提取物显著抵消了IL-1介导的作用，减少了NFkB通路的激活以及NFkB与HBD2启动子之间的相互作用。

结论

本研究为COPD固有免疫机制改变的可能机制提供了新的见解。

引用:Pace E, Ferraro M, Minervini MI, Vitulo P, Pipitone L, Chiappara G，等(2012)吸烟者COPD患者中央气道β防御素-2降低而远端气道未降低。科学通报7(3):e33601。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601

编辑器:多米尼克·哈特尔，Tübingen大学，德国

收到:2011年11月25日;接受:2012年2月13日;发表:2012年3月16日

版权:©2012佩斯等人。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

资助:这项工作得到了意大利国家研究委员会的支持，并得到了葛兰素史克公司对MG慢性阻塞性肺病卓越中心(CDS014)的资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决定或稿件准备方面没有任何作用。

利益冲突:作者已经阅读了该杂志的政策，并有以下冲突:MJ受雇于葛兰素史克公司，该公司参与呼吸系统研究，并销售治疗慢性阻塞性肺病的药物。没有专利、开发中的产品或已上市的产品需要申报。MG获得了葛兰素史克(GlaxoSmithKline)的研究资金。这并不会改变作者对公共科学图书馆·综合的所有共享数据和材料的政策的遵守。

简介

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个日益严重的全球性健康问题[1]预计到2020年，它将成为第三大最常见的死亡原因[２]．

慢性阻塞性肺疾病患者常发生肺部防御改变，远端气道细菌定植可能发生[3]．toll样受体(toll like receptor, TLR)家族是对抗感染的先天防御的一个关键组成部分[4]．当TLR被内源性和外源性配体激活后，可能会释放包括IL8和IP-10在内的趋化因子和防御素［5］．TLR2和TLR4，主要由单核/巨噬细胞和中性粒细胞表达[4]，也在肺和支气管上皮细胞中表达[6]．气道上皮细胞活跃于气道防御机制，释放细胞保护粘液和防御素[7]并通过产生细胞因子和趋化因子，在协调局部炎症和免疫反应中发挥重要作用[8]．

吸烟习惯通过增加粘液产生、减少粘液纤毛清除、减少人类β - 2防御素(HBD2)释放来干扰宿主先天防御系统[9]破坏上皮屏障，刺激炎症细胞向受损组织迁移[10]．

虽然众所周知，慢性阻塞性肺病的一个主要决定因素是香烟烟雾暴露，但它能够改变支气管上皮细胞系中TLR4的表达和激活[11]目前尚不清楚这种现象是否在体内发生，以及在支气管树的不同水平上是否有不同的改变。慢性阻塞性肺疾病的主要病理表现在周围气道和肺实质[12]．中央气道在多大程度上反映远端肺发生的事件是不确定的。

本研究的目的是评估慢性阻塞性肺病是否与TLR4表达的改变或人类β - 2防御素(HBD2)在中央和远端气道表达的改变有关。

材料与方法

患者人群

患者接受了肺癌手术，并在意大利巴勒莫ismett招募。该研究获得了ISMETT伦理委员会的批准，并与《赫尔辛基宣言》一致。获得每位患者的书面知情同意。选取以下患者组:1)无COPD (C)的从不吸烟患者(n = 13);2)吸烟患者(>15包/年)无COPD (S) (n = 12);3)慢性阻塞性肺病(s-COPD)吸烟患者(>15包/年)(n = 17);4)戒烟1年以上且患有慢性阻塞性肺病(ex-s-COPD)的戒烟患者(>15包/年)(n = 8)。COPD患者使用支气管扩张剂治疗，并根据术前肺功能分类:FEV1小于参考值的80%，FEV1/FVC < 70%，支气管扩张效果< 12%。这些患者在研究前一个月没有接受皮质类固醇治疗(既不是吸入的也不是全身的)，也没有使用抗生素，也没有出现病情加重。受试者的常见过敏原提取物皮肤试验呈阴性，既往无哮喘或过敏性鼻炎病史。

免疫组织化学

选取无肿瘤的中央支气管和周围肺组织组织标本，用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋。连续切片(3µm厚)置于聚l -赖氨酸包被玻片上，在二甲苯中脱蜡，在下降的乙醇系列中再水化，用苏木精和伊红(HE)染色。

采用免疫组化和图像分析方法，用兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)测定TLR4和HBD2在中央(内周>6 mm)和远端(内周<或= 6 mm)气道中的表达[13]．LSAB2 Dako套件(Code N°K0674) (Dako, Glostrup, Denmark)和Fuchsin底物显色系统Dako[14]用于染色。阴性对照采用兔阴性对照免疫球蛋白(Dako)。2名独立研究人员使用莱卡(Wetzlar, Germany)显微镜×400放大镜对免疫反应性进行盲法评价。使用Quantimet 500 MC软件(徕卡)进行图像分析，评估基底膜的长度。结果以阳性上皮细胞的数量/基底膜表示，如一项类似的COPD研究报道的那样[15]．

激光捕获显微解剖

激光捕获显微解剖(LMD)使用Leica AS LMD (Leica Microsystems，德国)进行[16]三个s-COPD和三个前s-COPD。上皮细胞(通过形态学特征识别)从样品中被微解剖到微管帽中，然后在同一管中加工。更多的细节在在线附录中提供。

实时PCR

如前所述进行实时PCR[17]．使用RNeasy Microkit (Qiagen, Milan, Italy)从s-COPD和前s-COPD微解剖组织中提取细胞总RNA，并使用上标第一链合成系统RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)反转录至cDNA。在ABI PRISM 7900 HT序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上使用特异性fam标记探针和引物(Applied Biosystems, TaqMan Assays on Demand)对HBD2基因进行实时定量PCR。以GAPDH基因表达作为内源性对照进行归一化。比较CT法对mRNA进行相对定量。

支气管上皮细胞系的刺激

16-HBE是一种永生化的正常支气管上皮细胞系[18]．

16HBE与IL-1β (30 ng/ml)(研发系统，明尼阿波利斯，MN)和与10%香烟烟雾提取物(CSE)培养24小时，如上所述[11]．刺激结束后收集细胞提取物，Real Time PCR检测HBD2 m-RNA表达，流式细胞仪检测HBD2蛋白表达，western blot检测IkB蛋白表达，ChiP分析。

流式细胞术

流式细胞术中，在Becton Dickinson FACSCalibur系统上使用兔抗hbd2多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)和异硫氰酸荧光素(FITC)共轭抗兔IgG (Dako)进行分析。

使用cellQuest采集和数据分析软件(Becton Dickinson (BD) Mountain View, CA)对每个样本的100,000个采集事件进行分析。阴性对照使用同型对照抗体(BD PharMingen, Mountain View, CA)。为了检测细胞内HBD2, 16-HBE用GolgiStop(2µM终浓度)(BD PharMingen)培养过夜。细胞在含1% FCS的PBS中洗涤两次，室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定20分钟。在4°C渗透缓冲液(含1% FCS, 0.3%皂角苷和0.1%叠氮钠的PBS)中洗涤2次15分钟后，用兔抗hbd2多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)染色，然后用异硫氰酸荧光素(FITC)共轭抗兔IgG (Dako)染色，然后用流式细胞术评估。

Western blot分析

如前所述，磷酸化IkB α (p IkBa)的表达通过western blot分析进行评估[11]．将总蛋白40µg装入凝胶中。首先使用兔抗pikba多克隆抗体(1∶500)(Cell Signaling Technology Inc)和兔抗ikba多克隆抗体(1∶1000)(Cell Signaling Technology Inc)检测所有印迹。采用增强化学发光系统(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK)进行显像，然后进行放射自显影。β -肌动蛋白(Sigma)被用作管家蛋白，以规范蛋白质负荷的差异。

芯片分析

如前所述，使用EZ-ChIP试剂盒(Upstate-Millipore公司- Billerica, MA)进行芯片分析[19]．

如上述所述，对16-HBE进行刺激，并对交联染色质进行超声处理，使其长度跨越200-1000 bp。样品用60 μ l蛋白A琼脂糖预先清除，然后与兔抗人NFkB多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)孵育。使用蛋白A琼脂糖沉淀免疫复合物。洗净后，分离DNA片段，用柱进行纯化。PCR使用跨越HBD2基因启动子区域的引物进行，引物为sense5 ' -catcccccagtctcttcatct-3 '和反义5 ' -atgagaccagtgtccaggcta-3 '；感觉5 ' -ggtgtgaatggaaggaactca-3 '和反义5 ' -ttcagctcctggggatgatac-3 '；感觉5 ' -tggcaggttataggtcctgag-3 '和反义5 ' -ataaaggtcctggtccctggt-3 '[20]．

统计数据

年龄、患者临床评分及Real time PCR数据以均数±标准差表示。患者组间比较采用Kruskal Wallis和Mann Whitney u检验。相关性采用斯皮尔曼检验。16HBE体外实验采用学生配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

研究对象的人口统计学特征

研究人群的人口学特征和功能评价见表1．所有被招募的患者组在年龄方面都是相似的。

缩略图
下载:
表1。研究对象的人口统计学特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.t001

S组与S - copd组的包数/年相近，但S - copd组显著高于前S - copd组(p<0.01)。

TLR4表达

因为吸烟习惯会干扰宿主的先天防御系统[10]我们首先评估了TLR4在远端和中央气道上皮细胞中的表达。远端气道上皮组织TLR4表达增加(图1 A而且图2 A与C相比，S、S - copd和ex-s-COPD中TLR4的表达增加，S和S - copd中TLR4的表达明显高于S - copd (图一B而且图2 B)．TLR4在基底上皮细胞和柱状上皮细胞中均有表达。

缩略图
下载:
图1所示。TLR4在远端和中央气道中的表达。

来自对照组(n = 13)、S组(n = 12)、S - copd组(n = 17)和ex-s-COPD组(n = 8)受试者手术样本的远端(A)和中央气道(B) TLR4免疫组化。细胞用抗tlr4抗体染色。阴性对照采用兔免疫球蛋白阴性对照(见材料与方法详情)。一个)远端气道基底膜阳性上皮细胞数/毫米的个体计数。横条表示中值。图中* p<0.05值为Mann-Whitney U检验分析。B)中心气道基底膜中阳性上皮细胞数/mm的个体计数。横条表示中值。图中* p<0.05值为Mann-Whitney U检验分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g001

缩略图
下载:
图2。远端和中央气道TLR4免疫染色。

一个)对照组、吸烟者、s-COPD和前s-COPD患者远端气道代表性阴性对照和代表性TLR4免疫染色(红色染色)。B)对照组、吸烟者、s-COPD和前s-COPD患者中央气道代表性阴性对照和代表性TLR4免疫染色(红色染色)。对于中央气道，从400倍放大倍数中选择并显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g002

HBD2表达式

因为TLR4的激活会导致防御素的释放[21]，评估HBD2表达。在远端气道上皮中，与C组相比，S组、S组和ex- S组HBD2表达增加。图3 A而且图4 A)．在中央气道上皮中，与S组和前S组相比，S - copd组HBD2表达明显降低(图3 B而且图4 B)．

缩略图
下载:
图3。HBD2在远端和中央气道的表达。

来自对照组(n = 13)、S组(n = 12)、S - copd组(n = 17)和ex-s-COPD组(n = 8)受试者手术样本的远端(A)和中央气道(B) HBD2免疫组化。细胞用抗hbd2抗体染色。阴性对照采用兔免疫球蛋白阴性对照(见材料与方法详情)。一个)远端气道基底膜阳性上皮细胞数/毫米的个体计数。横条表示中值。图中* p<0.05值为Mann-Whitney U检验分析。B)中心气道基底膜中阳性上皮细胞数/mm的个体计数。横条表示中值。图中* p<0.05值为Mann-Whitney U检验分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g003

缩略图
下载:
图4。远端和中央气道HBD2免疫染色。

一个)对照组、吸烟者、s-COPD和前s-COPD患者远端气道代表性阴性对照和代表性HBD2免疫染色(红色染色)。B)对照组、吸烟者、s-COPD和前s-COPD患者中央气道代表性阴性对照和代表性HBD2免疫染色(红色染色)。对于中央气道，从400倍放大倍数中选择并显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g004

相关性

我们评估了TLR4和HBD2在远端和中央气道中的表达是否与FEV1、FEV1/FVC比值或与香烟烟雾暴露(包/年)相关。这些参数与TLR4表达之间未发现显著相关性(数据未显示)。HBD2在中央气道中的表达与FEV1/FVC比值(图5 A)，但在HBD2和FEV1之间没有(数据未显示)。此外，中央气道中HBD2的表达与香烟烟雾暴露呈负相关(包/年)(图5 B)．

缩略图
下载:
图5。中枢气道HBD2表达与功能参数的相关性。

对照组(n = 13)、S组(n = 12)、S - copd组(n = 17)和ex-s-COPD组(n = 8)中气道HBD2表达与FEV1/FVC比值(一个)和包/年(B)采用Spearman相关检验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g005

微解剖支气管上皮中HBD2 mRNA的表达

为了了解中央气道中s-COPD和ex-s-COPD之间HBD2表达差异是否与mRNA表达减少有关，我们对微解剖的支气管上皮(图6 A)。与前s-COPD相比，s-COPD中HBD2 mRNA表达减少(图6 B)．

缩略图
下载:
图6。HBD2 m-RNA在中央气道中的表达。

用Real - time PCR方法检测了s-COPD和ex-s-COPD微解剖支气管上皮中HBD2 m-RNA的表达材料与方法详情)。一个)激光显微解剖(LMD)前(左)和后(右)支气管上皮的代表性图像。B)微解剖支气管上皮中HBD2 m-RNA的表达。以GAPDH基因表达作为内源性对照进行归一化。比较CT法对mRNA进行相对定量。(平均数±标准差)。* p < 0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g006

香烟烟雾对支气管上皮细胞的体外影响

为了更好地探索香烟烟雾暴露的作用，HBD2在两种mRNA (图7 A)和蛋白质水平(图7 B)在IL1 beta和CSE刺激的支气管上皮细胞(16-HBE)中进行评估。CSE没有改变HBD2的本构表达。IL1 β诱导HBD2的表达，CSE显著抵消了IL-1 β介导的作用，进一步支持了香烟烟雾对支气管上皮细胞HBD2表达的负面影响。进一步探讨了CSE抑制HBD2诱导的机制。在支气管上皮细胞中，IL-1 β增加了pIKBa的表达，导致NFkB通路的激活增加，CSE对这一现象产生负向干扰(图7 C)．

缩略图
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图7。CSE对支气管上皮细胞(16-HBE)的影响。

16-HBE细胞分别在存在和不存在IL-1 β和CSE(10%)的情况下进行培养(n = 3)材料与方法详情)。一个)实时PCR检测HBD2 m-RNA在16-HBE中的表达。以GAPDH基因表达作为内源性对照进行归一化。比较CT法对mRNA进行相对定量。(平均数±标准差)。* p与基线相比<0.05。** p<0.05 vs IL-1 beta。B)代表性实验(3个实验中的1个)，流式细胞术显示HBD2蛋白在16-HBE中的表达。HBD2的表达以HBD2阳性细胞的百分比表示。C) western blot检测p-IkBa或t-IkBa。然后剥离膜，用山羊多克隆抗-ß-actin孵育。代表性的western blot分析(三次实验中的一次)。Lane1 =基线;lane 2 = CSE 10%;lane 3 = IL1 beta;lane 4 = CSE+IL1 beta。DChiP法使用抗nfkb抗体，PCR法使用引物5 ' -GGTGTGAATGGAAGGAACTCA-3 '反向5 ' -TTCAGCTCCTGGGGATGATAC-3 ')跨越HBD2基因的启动子区(见材料与方法两个实验中的一个被展示出来。巷1 = DNA标记;2号跑道=基线;lane 3 = CSE 10%;lane 4 = IL1 β;lane 5 = CSE+IL1 β。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033601.g007

此外，我们用特异性NFkB抗体(图7 D这些实验结果表明，在与IL-1 β孵育后，NFkB在支气管上皮细胞HBD2的启动子区域被检测到，这一现象被CSE的存在逆转。

讨论

慢性阻塞性肺病(COPD)是一种了解甚少且发展缓慢的疾病，在诊断时已出现显著的病理解剖变化。慢性阻塞性肺病疾病表型的详细炎症概况正在出现。

本研究首次证实，在s-COPD中、远端气道上皮中均存在TLR4的过表达。慢性阻塞性肺疾病(s-COPD)中中央气道上皮细胞HBD2表达减少，而远端气道上皮细胞HBD2表达增加，这一标记物与气流阻塞和吸烟包数/年有关。中央气道上皮中HBD2表达的减少是由于CSE在NFkB通路激活中的负面作用。

慢性阻塞性肺疾病的主要病理表现在周围气道和肺实质[12]．中央气道在多大程度上反映远端肺发生的事件是不确定的。近端支气管树中嗜中性粒细胞较多，远端气道中巨噬细胞较多[22]．炎症过程促进大支气管中与慢性支气管炎相关的结构和功能变化[23]而在较小的支气管和细支气管中，它们会因粘液、管壁增厚和管腔变窄而导致管腔闭塞[12]．本研究旨在了解吸烟者和病情稳定的COPD患者(当前吸烟者和前吸烟者)在支气管树的不同水平上，先天免疫反应机制是否发生了不同的改变。

先天免疫依赖于模式识别受体，它能识别许多微生物和内源性配体(如热休克蛋白)的共同结构。一项来自Pons的研究[24]表明从COPD患者采集的外周血单核细胞中TLR-2上调，无论是在临床稳定时还是在病情加重时。Droemann等人。[25]报道了来自稳定期COPD患者和吸烟者的肺泡巨噬细胞表达的TLR-2比从不吸烟者少。我们首次证明TLR4在吸烟者和s-COPD患者的中央和远端气道上皮中表达增加。这些结果强烈提示TLRs的表达可能在支气管树的不同细胞间隔(免疫细胞或气道上皮细胞)中被不同的修饰。此外，吸烟者和s-COPD患者中央气道上皮组织中TLR4表达的增加与之前的研究结果一致在体外我们小组发表的研究表明，CSE增加了支气管上皮细胞系TLR4的表达[11]．

TLRs建立炎症环境以应对感染或组织损伤，并提供先天免疫系统的低级别激活，以维持日常肺结构的稳定[25]．TLR信号的高度激活导致细胞因子和活性氧化剂的产生增加，有助于实验性肺气肿[26]．

CSE通过激活TLR4信号通路诱导小鼠气道中性粒细胞增多[27]在支气管上皮细胞中，在体外， TLR4的激活指向IL-8释放增加和IP-10释放减少，导致中性粒细胞趋化性增加和淋巴细胞趋化性减少，从而改变先天和适应性反应之间的平衡[11]．这种不平衡可能放大肺部炎症，因为当适应性肺部免疫反应不适当时，肺部炎症可能过度[28]．TLR4被外界激活主要是由于革兰氏阴性菌，也最终释放抗菌肽，包括HBD2，一个分子对革兰氏阴性菌有强大的作用[20]．呼吸上皮细胞需要TLR4通过LPS诱导HBD2[29]．HBD2主要存在于结构上皮细胞中，对中性粒细胞具有特异性的趋化活性[30]并可能作为内源性TLR配体放大TLR反应[31]．我们在这里表明，与吸烟者和停止吸烟的COPD患者相比，s-COPD患者中央气道中HBD2降低，并与先前报道的FEV1/FVC比值降低评估的气道阻塞程度相关[32]，是一个很好的反映气流限制的肺量学参数。此外，HBD2在中央气道中的表达与吸烟包数/年呈负相关，这强烈表明香烟烟雾暴露对COPD患者中HBD2的表达有严重的负面影响。在这方面，最近有研究表明，香烟烟雾提取物降低了吸烟者和COPD患者原代支气管上皮细胞中HBD2的表达[9]我们的体外实验表明，支气管上皮细胞暴露于CSE阻断了暴露于IL-1 β(一种在COPD炎症中起关键作用的细胞因子)所产生的HBD2 mRNA的诱导，证实并扩展了这些观察结果，为导致这一现象的机制提供了一些解释。香烟烟雾通过增加黏液的产生，减少黏液纤毛的清除，破坏上皮屏障和刺激炎症和免疫细胞的迁移，干扰了宿主的先天防御系统[28]．此外，暴露于烟雾中的气道上皮细胞阻断了lps诱导的NFkB通路的激活[11][33]这是一种在HBD2合成中起关键作用的信号通路。因此，先前的研究表明，气道上皮细胞暴露于烟雾中会抑制细菌对HBD2的诱导[34]．为了进一步支持这些数据，在本研究中，我们证明CSE抑制IL-1 β诱导的NFkB通路激活，反过来消极地干扰NFkB与HBD2启动子区域之间的相互作用。HBD2基因拷贝减少的受试者易患克罗恩病[35]在s-COPD中，中央气道上皮中HBD2表达减少，进一步支持了这一概念，即在支气管树的特定腔室中，HBD2表达的失调可能有助于疾病的发展。其他机制可能解释HBD2在当前吸烟者慢性阻塞性肺病中央气道表达减少的原因。瘦素可能促进HBD2的合成[36]在支气管活检的上皮细胞中，轻至重度COPD患者瘦素及其受体的表达降低[37]．

因为不是所有的吸烟者都会患慢性阻塞性肺病[38]，中枢气道中HBD2表达减少可能识别易发展为COPD的吸烟者。这一假设需要进一步的研究来验证。此外，中心气道上皮中HBD2的减少和TLR4表达的增加可能提示先天反应激活在这一水平上的损伤，反过来可能有利于微生物入侵远端气道和实质。生理上，远端气道是无菌的，而COPD患者的气道被潜在的呼吸道病原体长期定植[39]．慢性细菌定植在一起导致氧化剂/抗氧化失衡，可刺激宿主免疫系统，引起慢性气道炎症[40]进而可能促进COPD患者远端气道和肺实质的组织损伤。细支气管炎症与功能损害和暂时性肺气肿相关[22]．我们的研究发现，在s-COPD的远端气道中，HBD2和TLR4上皮表达均增加，这支持了先天免疫应答激活增加可能发生在该水平的概念。在患有慢性阻塞性肺病和急性呼吸衰竭的吸烟者远端气道中，高水平的HBD2增加中性粒细胞存活[40]因此有助于放大炎症反应，进而通过粘液、壁增厚和变窄促进管腔的闭塞。此外，ex-s-COPD中枢气道上皮细胞HBD2表达增加，进一步支持了戒烟可能改变气道上皮细胞炎症特征的概念。与正在吸烟的COPD患者相比，戒烟的COPD患者上皮鳞状细胞化生、增殖细胞数量显著减少，杯状细胞面积有减少的趋势[41]．

综上所述，本研究表明，尽管TLR4在S - copd和S中、远端气道中均有过表达，但在S - copd中，HBD2在中、远端气道中均有降低，且与气流阻塞程度和吸烟史相关。

致谢

玛丽亚·费拉罗是巴勒莫大学免疫药理学博士课程的博士生。

作者的贡献

构思并设计了EP MF实验。实验采用LS - GC - LP - AMM。分析数据:EP MF。贡献的试剂/材料/分析工具:MF AMM LS GC。撰写论文:EP MF MG。招募患者和管理手术样本:PV MIM。数据解释贡献:MJ。

参考文献

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