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研究文章

布地奈德和Formoterol减少早期先天抗病毒免疫反应在体外

  • 珍妮特·m·戴维斯,

    j.davies2@uq.edu.au

    联系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯
  • 梅勒妮·l·卡罗尔,

    联系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯
  • Hongzhuo李

    联系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯
  • 艾丽莎m . Poh

    联系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯
  • Darren Kirkegard

    联系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯
  • 米歇尔·塔,

    从属关系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚,呼吸医学系,亚历山德拉公主医院,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯
  • 约翰·w·阿帕姆

    从属关系肺癌和过敏研究中心,医学院,昆士兰大学的亚历山德拉公主医院临床部门,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚,呼吸医学系,亚历山德拉公主医院,Woolloongabba,昆士兰,澳大利亚

    ⨯

布地奈德和Formoterol减少早期先天抗病毒免疫反应在体外

  • 珍妮特·m·戴维斯
  • 梅勒妮·l·卡罗尔,
  • Hongzhuo李
  • 艾丽莎m . Poh
  • Darren Kirkegard
  • 米歇尔·塔,
  • 约翰·w·阿帕姆
公共科学图书馆
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文摘

哮喘是一种呼吸道慢性炎症疾病,呼吸道病毒感染常引起发作。目前的治疗哮喘的组合的吸入型皮质类固醇激素和长期代理beta2受体激动剂可以提高哮喘控制和减少发作但这对天生的抗病毒免疫的影响尚不清楚。我们调查了在体外哮喘药物天生的抗病毒免疫的影响。外周血单核细胞(PBMC)从健康和哮喘捐助者培养24小时的toll样受体7受体激动剂、咪喹莫特、鼻病毒16 (RV16)布地奈德和/或formoterol的存在。生产的促炎细胞因子和抗病毒细胞内信号分子的表达分别用rt - pcr和ELISA。独自在PBMC从健康的捐赠者,布地奈德抑制IP-10和il - 6生产咪喹莫特浓度的方式和抑制的程度放大时,布地奈德和formoterol结合使用。Formoterol单独对这些参数的影响很小,除了在高浓度(10−6米),il - 6生产增加。在RV16刺激PBMC,布地奈德和formoterol抑制IFNα和哮喘IP-10生产以及健康的捐赠者。布地奈德和formoterol也抑制RV16-stimulated myxovirus I型干扰素诱导的基因表达蛋白A和2′,5′oligoadenylate合成。值得注意的是,RV16刺激低水平的类型Myxovirus oligoadenylate合成酶在捐助者的哮喘病患者PBMC比控制。这些在体外研究表明,药物常用于哮喘治疗的组合抑制早期促炎细胞因子和I型干扰素通路的关键方面。这些发现表明,布地奈德和formoterol抑制过度炎症引起的鼻病毒感染患者的哮喘,但这是否能抑制病毒清除在活的有机体内还有待确定。

引用:戴维斯JM,卡罗尔ML,李H, Poh, Kirkegard D,塔米,et al。(2011)布地奈德和Formoterol减少早期先天抗病毒免疫反应在体外。《公共科学图书馆•综合》6 (11):e27898。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898

编辑器:雅克•齐默de矫揉造作的公共卫生中心(CRP-Sante),卢森堡

收到:2011年9月22日;接受:2011年10月27日;发表:2011年11月18日

版权:©2011年戴维斯等。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:支持由办公室卫生和医学研究,昆士兰健康和昆士兰的哮喘的基础。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

哮喘是一种慢性炎症性疾病的全球航空公司影响到3亿人,构成重大负担在西方国家和发展中国家的卫生保健系统[1]。哮喘患者的生活质量造成不利影响,从学校或工作生产率和旷工[2]。然而,哮喘的主要医疗负担和医疗费用包括发病率和死亡率发生在急性发作[3],[4]。多达80%的发作急性哮喘的儿童和70%的成人呼吸道病毒性感染鼻病毒是一个主要的罪魁祸首[5],[6],[7],[8]。

目前哮喘治疗通常包括吸入型皮质类固醇激素和长期代理beta2受体激动剂。这些药物是有效地控制哮喘症状和减少但不消除哮喘急性加重[9],[10],[11]。此外,这些药物对宿主防御病毒感染的影响尚不清楚。感应天生的抗病毒免疫是必要的为病毒起始间隙以及招聘的特异性适应性免疫反应[12],[13],[14]。然而,过度的炎性反应在哮喘个体可能导致急性哮喘的免疫病理反应[15]。

启动免疫反应对呼吸道病毒感染包括肺的结构细胞和白细胞招募的循环[16]。虽然呼吸道粘膜的主站点rhinoviral感染,迁移细胞起源于骨髓可能会作出重大贡献主机防御这种病毒[17]。有越来越多的证据表明,哮喘与血液白细胞的抗病毒功能的变化[18],[19],[20],[21]。抽样的外周血提供了一种方法来拦截和询问的各种免疫细胞途中到肺部和区域淋巴结。此外,实验鼻病毒感染哮喘患者表现出很强的相关性之间在体外反应的外周血白细胞鼻病毒和临床相关在活的有机体内结果包括哮喘症状,支气管hyper-responsiveness和病毒传染的程度[22],[23],[24]。而糖皮质激素的影响和长期代理beta2受体激动剂在鼻病毒感染的支气管上皮细胞进行了调查[25],[26],[27],几乎没有信息的影响这些治疗早期外周血白细胞的先天免疫反应。

在这项研究中我们旨在调查的影响糖皮质激素的组合,布地奈德,和长期代理beta2兴奋剂,formoterol,鼻病毒的先天免疫反应。鼻病毒是单链RNA病毒,可能会产生复杂的影响宿主细胞与宿主的相互作用包括国防分子检测病毒核酸。我们曾表明,青少年哮喘反应降低外周血白细胞为单链RNA的toll样受体受体激动剂(TLR7)[21]。因此我们首先检查外周血单核细胞被激活之前通过TLR7进行一系列的实验与生活鼻病毒株16 (RV16)。因为天生干扰素反应鼻病毒之间的区别健康和哮喘捐助者已报告[19],[20],[28]我们检查了在体外布地奈德和formoterol先天的各个方面的影响宿主免疫健康以及哮喘捐助者。

结果

学科特点

我们以前观察到的差异之间的鼻病毒适应性免疫健康绝经前女性和aged-matched男性[31]。然而,先天免疫鼻病毒是不受年龄和性别的影响研究。尽管如此,消除任何潜在的性别与RV16混杂效应的实验,11 12个健康的捐赠者和哮喘PBMC捐赠者都是女性。健康控制和哮喘捐赠者有相似的身体质量指数(表1)。健康的捐赠者略,但明显比哮喘捐赠者,但这是不可能有任何生物学上的意义,因为大多数两组的参与者是绝经前的年龄。哮喘捐赠者有轻度至中度医生诊断哮喘。6十二哮喘病患者处方吸入糖皮质激素(布地奈德或结合formoterol丙酸氟替卡松加沙美特罗),一个是规定喷鼻类固醇但正在口服类固醇。哮喘捐助者都对屋尘螨过敏有或没有过敏的敏感到其他高空过敏症而对照组都non-atopic (表1)。

缩略图
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表1。患者PBMC捐助者的特点进行实验比较RV16哮喘药物对先天免疫的影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.t001

布地奈德和formoterol TLR7激活PBMC从健康的捐赠者

最初的实验关注TLR7-activated PBMC。细胞健康的捐赠者是刺激TLR7兴奋剂智商的布地奈德和formoterol的浓度增加。PBMC文化刺激与智商产生大量我IFN-associated趋化因子IP-10类型。高浓度的布地奈德治疗(10−7-10年−6米)显著降低IQ-induced IP-10生产最多80%抑制10−6布地奈德(图1一个)。布地奈德治疗有较强的促炎细胞因子il - 6的影响生产和达到完全抑制il - 6浓度减少10−8布地奈德(图1 b)。

缩略图
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图1所示。布地奈德和formoterol剂量依赖的标志引起的先天免疫咪喹莫特(智商)。

IP-10 (C)和il - 6 (B, D)生产由20名健康女性捐赠者PBMC培养与智商的存在增加浓度(10−10-10年−6M表示)的布地奈德(芽)和formoterol(形式)。如果控制文化产生的背景细胞因子水平(平均69 pg / ml IP-10和181 pg / ml il - 6)减去。盒子,须情节显示10的中位数和四分位范围th-90年th百分位。IQ-stimulated文化之间的差异和IQ-stimulated文化用药物测试邓恩弗里德曼方差分析和多重比较的测试(* *,p < 0.005;* * *,p < 0.001)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.g001

Formoterol也减少IP-10生产引起的智商显著抑制76%的观察到10−6M formoterol (图1 c)。相比之下,formoterol不会降低il - 6生产刺激智商(图1 d)。事实上,有一个2.8折增强il - 6生产引起的智商10点−6M formoterol,暗示独立IP-10和il - 6的监管。

我们接下来研究的影响的组合布地奈德和formoterol药物相关浓度。布地奈德和formoterol (10−8每种药物的M)抑制IQ-stimulated IP-10生产,而当测试单独在同一浓度,这些药物没有效果(图2一个)。减少IQ-stimulated il - 6生产观察布地奈德治疗被添加formoterol进一步提高(图2 b)。

缩略图
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图2。布地奈德和formoterol对咪喹莫特的影响(智商)全身的先天免疫的标志。

IP-10 (A)和il - 6 (B)生产由八个健康女性捐赠者PBMC培养与智商与布地奈德(芽,10−8米)和/或formoterol(形式,10−8米)。如果控制文化产生的背景细胞因子水平(平均211 pg / ml IP-10和238 pg / ml il - 6)减去。盒子,须情节显示10的中位数和四分位范围th-90年th百分位。IQ-stimulated文化之间的差异和IQ-stimulated文化用药物测试邓恩弗里德曼方差分析和多重比较的测试(* *,p < 0.005;* * *,p < 0.001)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.g002

布地奈德和formoterol IFNα生产由RV16-stimulated PBMC从健康和哮喘捐助者

有显示,布地奈德和formoterol TLR7-induced减少细胞因子的组合生产,以下一系列实验研究这些药物的影响RV16-stimulated PBMC。RV16诱导IFNα生产类似的程度上细胞健康和哮喘的捐助者(图3 a, B)。布地奈德(10−8米),结合formoterol (10−8米)完全阻塞IFNα生产RV16引起的,所以不可能确定结合formoterol IFNα生产额外的影响。抑制IFNα达到的程度与布地奈德单独或结合formoterol相似在健康和哮喘。尽管formoterol独自似乎诱导适度减少RV16-stimulated IFNαPBMC从健康和哮喘捐助者、减少无统计学意义。

缩略图
下载:
图3。布地奈德和formoterol对IFNα-induced鼻病毒。

PBMC产生的细胞因子从健康(A)和哮喘(B)捐助者与RV16培养24 h布地奈德(花蕾,10的存在−8米)和/或formoterol(形式,10−8米)表示。盒子,须情节显示值,四分位范围,10th和90年th百分位数的数据在每个学科组12个捐助者。显著差异邓恩弗里德曼方差分析和多重比较的测试如果与RV16-stimulated文化(+ + +,p < 0.005),与RV16-stimulated RV16-stimulated文化与布地奈德治疗和/或formoterol (* * *, p < 0.001)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.g003

布地奈德和formoterol IFNα下游分子

RV16强烈诱导生产同样高水平的I型干扰素反应趋化因子在PBMC IP-10文化的健康和哮喘。在健康的捐赠者,与布地奈德治疗(10−8米)减少RV16-induced IP-10生产78.1% (图4一),而10−9米布地奈德仅显示没有影响(补充图S1A)。这IP-10生产进一步减少formoterol (10−8米,图4一),尽管formoterol独自在这或更高浓度没有影响(10−8米,图4一和10−7米,数据未显示)。

缩略图
下载:
图4。布地奈德和formoterol rhinovirus-induced 1型干扰素诱导基因的表达。

IP-10 PBMC产生的健康(A)和哮喘(B)捐助者与RV16培养24 h布地奈德(花蕾,10的存在−8米)和/或formoterol(形式,10−8米)表示。盒子,须情节显示值,四分位范围10th和90年th索要数据。抗病毒基因的定量rt - pcr分析MxA和美洲国家组织表达健康献血者(C和E, n = 8)和哮喘捐助者(D和F, n = 12)。显著差异邓恩弗里德曼方差分析和多重比较的测试如果与RV16-stimulated文化(+ + +,p < 0.005)和RV16和RV16之间用药物评估邓恩弗里德曼方差分析和多重比较的测试(*,p < 0.05;* * * * *,p < 0.005, p < 0.001)。显示药物对基因表达的影响哮喘患者的数据显示在不同的规模,从健康的捐赠者。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.g004

布地奈德(10−8米)抑制RV16-induced IP-10显著更大程度上文化从哮喘的个体比文化健康个体(p = 0.022)。实际上,布地奈德IP-10诱导的抑制程度的哮喘病患者非常完整,它是不可能确定formoterol额外抑制效果(图4 b)。然而,随着低浓度的布地奈德(10−9米),结合formoterol (10−8米)进一步抑制IP-10合成RV16——刺激PBMC哮喘捐助者(补充图印地)。Formoterol独自没有影响RV-induced IP-10 (10−8米,图4 b,10−7米,数据未显示)。

MxA和美洲国家组织是两个重要的I型干扰素抗病毒分子下游。RV16 MxA和美洲国家组织的强烈诱导mRNA表达文化的PBMC健康的捐赠者(图4C, E)。在健康的捐赠者,布地奈德,但不是formoterol,抑制鼻病毒诱导MxA而单独使用布地奈德和formoterol rhinovirus-induced美洲国家组织的表达减少。然而,几乎完全抑制MxA(95.8%)和美洲国家组织的表达(96.1%),布地奈德和formoterol的结合。

在PBMC哮喘捐助者、RV16也I型干扰素刺激基因的诱导表达(图4D, F),尽管MxA的大小和美洲国家组织在PBMC表达明显低于健康献血者(表2)。布地奈德治疗哮喘的PBMC捐助者显著降低RV16诱导MxA表达式(图4 d)。明显减少RV16-induced美洲国家组织,布地奈德不是统计学意义(图4 f)。布地奈德和formoterol抑制MxA,美洲国家组织诱导PBMC的RV16文化哮喘捐赠者的78.8%和73.5%,分别,这在PBMC的抑制程度明显低于健康献血者(p = 0.007对MxA和美洲国家组织p = 0.0008)。

缩略图
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表2。比较健康和哮喘之间的响应鼻病毒16捐助者。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.t002

布地奈德和formoterol其他先天细胞因子诱导PBMC RV16从健康和哮喘捐助者

RV16刺激不明显诱导il - 6生产上面的如果PBMC文化(补充图S2)。然而,少量的il - 6产生完全废除与布地奈德治疗(10−8米)在健康和哮喘捐助者,formoterol(10的进一步影响−8米)之外没有观察到(补充图S2)。10点−9M,布地奈德不显著抑制il - 6生产有或没有添加formoterol (10−7或10−8米)(数据没有显示)。Formoterol仅在这些RV-induced il - 6浓度没有显著影响生产健康或哮喘捐赠者PBMC(补充图S2和数据未显示)。

大量的引发和TNFα并不在PBMC中发现文化接触RV16 24小时的健康或哮喘捐助者(数据未显示)。

讨论

鼻病毒是常见的诱因急性发作的哮喘和哮喘发病率和死亡率的一个重要原因[3]。吸入糖皮质激素和长期代理beta2受体激动剂形式目前哮喘治疗的基石[9],[33]以前,甚至在健康个体有时会为了减少使用这些代理后长期持续的呼吸道症状,如咳嗽的呼吸道病毒感染。与糖皮质激素联合治疗和长期代理beta2受体激动剂提供限制的优势所需的剂量的糖皮质激素治疗哮喘[33]。然而,目前尚不清楚皮质类固醇和长期代理beta2受体激动剂改变循环免疫细胞的能力增加鼻病毒的早期先天免疫反应。

我们观察到,布地奈德抑制TLR7-induced PBMC IP-10和il - 6的合成,抑制的程度通常是增强与formoterol布地奈德联合使用时。同样,在RV16刺激PBMC布地奈德抑制的各个方面天生的抗病毒反应,主要是抑制的程度是增强与formoterol布地奈德联合使用时。这些药物的抑制效应被认为在PBMC的文化健康以及哮喘捐助者。

我们的观察布地奈德和formoterol治疗抑制早期先天抗病毒免疫循环白细胞与先前的研究一致使用结构细胞的肺。在这些研究中布地奈德和formoterol或丙酸氟替卡松加沙美特罗抑制IP-10和引发生产引起的鼻病毒在人类支气管上皮细胞系培养和初级健康受试者的上皮细胞[25],[34]。糖皮质激素也被证明能阻止rhinovirus-induced IP-10生产气道成纤维细胞(托马斯和Bardin、个人通信)。在人工气道平滑肌、气道上皮细胞和肺成纤维细胞,这些药物的组合表现出协同减少促炎反应,趋化因子和细胞外基质分子参与气道重塑[25],[27],[34],[35],[36],[37]。

有趣的是,我们观察到IQ-induced il - 6生产增加的额外的高剂量formoterol (10−6M;看到图1 d)。这一发现与观测一致,支气管上皮细胞系RV16-induced il - 6生产BEAS-2B被氟替卡松加沙美特罗(10增加2 - 3倍−9米和10−8米)[26],RV1b诱导il - 6在支气管上皮细胞倾向于增加40 - 50%的高剂量formoterol (10−7米和10−6米)[25]。这些发现表明,使用氟替卡松加沙美特罗和formoterol没有皮质类固醇可能促炎效应。此外,2 T辅助细胞巨噬细胞促进因素衍生趋化因子在支气管上皮细胞增强应对formoterol和氟替卡松加沙美特罗建议长期代理beta2受体激动剂本身可以支持Th2肺部炎症[38]。

鼻病毒对哮喘急性加重的贡献已经被很好地记录下来了[5],[6],[7],[8]但是辩论继续是否影响是由于病毒本身直接或间接因异常主机应对病毒。实验后鼻病毒感染的消息和他的同事报道,降低呼吸道症状的严重程度与病毒载量[23]。相比之下,自然rhinoviral感染哮喘患者的纵向研究表明,下呼吸道症状的严重程度不相关的病毒载量[39]。同居伴侣在英国的前瞻性研究(其中一人过敏性哮喘,另一个是健康的)显示,在哮喘患者没有不同于健康人鼻病毒感染的频率,持续时间和严重程度的感染增加哮喘[40]。总的来说,这些研究表明,鼻病毒的异常免疫反应导致的感应和严重性症状在哮喘患者鼻病毒感染之后,虽然多少这是由于哮喘本身,有多少可以归因于药物用于治疗哮喘没有详细调查。格伦伯格等人发现,预处理与布地奈德的嗜酸性粒细胞的炎症反应减少6天邮报RV16挑战,但总的来说,轻微的气道炎症引起RV16没有影响,无论是好是坏,布地奈德[41]。然而,在研究与吸入类固醇和长期代理beta2受体激动剂联合治疗不检查,也没有任何检查的早期先天抗病毒免疫或病毒清除[41]。

尽管布地奈德和formoterol明显抗病毒免疫的抑制方面,特别是I型干扰素通路,两者对气道炎症和主机防御尚不清楚。减少趋化因子如IP-10生产将减少招聘激活T淋巴细胞的免疫应答的重要主角鼻病毒。减少生产IFNβ支气管上皮细胞在哮喘被认为防止有效的抗病毒反应和延迟病毒清除[42],[43]。此外,从哮喘患者PBMC合成少IFNα2当呼吸道合胞病毒感染或新城鸡瘟病毒[20]。然而,过度IP-10, I型干扰素的下游细胞因子,在鼻病毒与哮喘的风险增加相关[42]。

本研究的主要目的是探讨常见的哮喘药物抗病毒先天免疫的影响而不是健康和哮喘捐助者之间的差异。尽管如此,虽然没有可发觉的健康和哮喘患者捐助者之间的差异对IFNα生产、RV16诱导显著降低的两个重要的抗病毒分子的表达,MxA和美洲国家组织,在哮喘患者与健康受试者相比。这个数据是一致认为天生的哮喘病患者的抗病毒免疫受损[43],[44]。看来在哮喘呼吸道病毒感染的免疫特异表达介导不仅结构细胞的肺还通过循环白细胞,可能pDC[45],[46]。

的临床后果布地奈德和formoterol抗病毒免疫的影响仍有待建立。抑制炎症细胞因子的生产和气道炎症显然是一个值得的哮喘治疗目标,有引人注目的临床证据表明这些药物在哮喘都是有益的。然而,仍存在一定程度的担心已经受损的I型干扰素抑制可能导致延迟一些哮喘患者病毒清除。一些研究人员已经研究I型干扰素的管理是否有利于哮喘。在一项小型研究,10严重类固醇抗哮喘患者提供改善与静脉注射低剂量IFNα哮喘的治疗建议I型干扰素的保护作用[47]。此外,I型干扰素治疗可以提供好处rhinoviral引发的哮喘急性加重患者的感染[48]。

布地奈德和formoterol能够调节炎性和1型干扰素的外周血白细胞刺激鼻病毒的反应体外。鉴于I型干扰素反应的重要性在健康和防止鼻病毒哮喘捐赠者和迁徙的免疫细胞之间的复杂的相互作用的循环和结构细胞中提取出来的呼吸道,现在有一个需要进一步清晰在活的有机体内研究布地奈德和formoterol治疗病毒性间隙的影响和持续时间的症状哮喘患者的鼻病毒的挑战。

方法

研究参与者

从呼吸道门诊志愿者招募,亚历山德拉公主医院和正常健康的实验室和卫生保健工作者。研究的对象是皮肤刺痛测试十个小组共同areoallergen提取包括屋尘螨、草和豚草花粉、霉菌和猫皮屑(Holister金牛,斯波坎,佤邦,美国)。参与者完成了一份详细的问卷调查表记录症状的肺疾病和过敏性疾病,如过敏性鼻炎、湿疹和当前药物使用。所有哮喘受试者之前哮喘的诊断证实了医生和典型的轻度至中度哮喘症状的历史在过去12个月。所有健康的对照组无呼吸道症状和消极的过敏原皮肤刺痛测试。进行的这项研究是根据批准的赫尔辛基宣言,亚历山德拉公主医院和昆士兰大学的人类研究伦理委员会。从每个主题通知书面同意了。

外周血单核细胞被隔绝heparinised血液使用Lymphoprep (Axis-shield,奥斯陆,挪威)和低温贮藏对后续实验如前所述[21]。

培养条件

俄亥俄州的海拉细胞和大组鼻病毒株RV16被菲尔教授请捐赠Bardin(澳大利亚墨尔本莫纳什大学医学中心,)。RV16在俄亥俄州的传播海拉细胞和纯化蔗糖梯度如前所述[29],[30]。咪喹莫特(美国圣地亚哥智商,Invivogen CA), formoterol和布地奈德(请捐赠的阿斯特拉捷利康,马格斯菲特柴郡SK10NA,英国)溶解在二甲亚砜在10−2直到使用M和冻结在整除。文化是可以忽略不计的最后DMSO溶液的浓度;在最高浓度的布地奈德和formoterol 10−6米,有0.001% v / v DMSO)。重复2.5×10井5PBMC每1×10的密度6每毫升培养在RPMI媒体补充了青霉素,链霉素,谷氨酸,2-mercaptoethanol和10%胎牛血清。细胞培养有或没有智商(1µg /毫升)或鼻病毒16 (RV16)感染复数。复制文化智商或RV16各种组合的布地奈德和formoterol 10−10米到10−6M是补充道。文化在37°C和5%孵化有限公司2。细胞颗粒从文化在6小时内收集存储在RNA-protect(试剂盒、希尔登,德国),直到RNA提取。上层清液从细胞培养24小时被ELISA收获细胞因子的量化。

ELISA

IP-10 (CXCL10)、il - 6、TNFα和引发ELISA进行使用商用配对抗体和重组细胞因子(美国)正迪金森,富兰克林湖,新泽西,和IFNα化验通过酶联免疫试剂盒(PBL干扰素源,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)根据制造商的指示。这些化验的下限检测如下:IP10, 3.9 pg / ml;il - 6和TNFα4.0 pg / ml;IFNα,4.9和引发7.8 pg / ml。

定量实时PCR。

RNA提取使用RNeasy或RNeasy +旋转设备和反向转录使用Quantitect逆转录工具包(试剂盒),根据制造商的指示。执行实时(RT) PCR与Quantitect SYBR绿色PCR混合(试剂盒)。为Myxovirus mRNA转录蛋白的表达(MxA)和2′,5′-oligoadenylate sythetase (OAS)测定考虑放大的效率值的归一化表达式的引用泛素含有酶D2基因所描述[31],[32]。

统计数据

使用SPSS统计分析进行了18(美国IBM SPSS Inc .,芝加哥,IL)。数据评估供Kolmogorov-Smirnov测试正常。智商或RV16刺激文化之间的差异和没有药物被非参数分析了弗里德曼方差分析邓恩的成对多重比较测试,与p < 0.05被认为是重要的。对刺激的反应值正态分布时那么健康和哮喘捐助者之间的差异被学生的T测试评估。

支持信息

图S1。

影响其他浓度的联合布地奈德和formoterol IP-10鼻病毒引起的。PBMC产生的细胞因子从年龄和体重index-matched女性健康(A)和哮喘(B)捐助者与RV16培养24 h布地奈德(花蕾,10的存在−9米)和/或formoterol(形式,10−8米)表示。盒子,须情节显示值,四分位范围,10th和90年th百分位数的数据在每个学科组12个捐助者。显著差异邓恩弗里德曼方差分析和多重比较的测试如果与RV16-stimulated文化(+ +,p < 0.005)和RV16与RV16用药物(*,p < 0.05)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.s001

(TIF)

图S2。

布地奈德和formoterol对il - 6的影响由鼻病毒引起。PBMC产生的细胞因子从年龄和体重index-matched女性健康(A)和哮喘(B)捐助者与RV16培养24 h布地奈德(花蕾,10的存在−8米)和/或formoterol(形式,10−8米)表示。数据显示为中位数、四分位范围和10th和90年th从12个捐助者索要数据。显著差异的邓恩弗里德曼方差分析和多重比较检验RV-stimulated文化与RV-stimulated文化用药物(*,p < 0.05;* * *,p < 0.001)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027898.s002

(TIF)

确认

我们承认的礼物从阿斯特拉捷利康药物formoterol和布地奈德。虽然科学家阿斯特拉捷利康进行审核和批准这个手稿没有影响的设计、执行或为本研究数据分析。

作者的贡献

构思和设计实验:托拉斯居。进行了实验:托拉斯AMP HL DK MC。分析了数据:托拉斯居。该报写道:托拉斯居。从制造商获得的礼物试剂:居。

引用

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