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研究文章

嗜酸性粒细胞增加人类和小鼠皮肤的神经元分支在体外

嗜酸性粒细胞增加人类和小鼠皮肤的神经元分支在体外

  • 艾琳L.福斯特，
  • 埃里克·l·辛普森
  • 洛娜j . Fredrikson介绍
  • 詹姆斯·李笃，
  • 南希A.李某，
  • 埃里森·d·弗莱尔
  • 大卫·雅各比B.
公共科学图书馆
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抽象

特应性皮炎的皮肤神经增多，瘙痒是突出的症状。我们研究了嗜酸性粒细胞和神经之间的功能相互作用在人类和小鼠皮肤和培养。我们证明了人类特应性皮炎皮肤有嗜酸性粒细胞颗粒蛋白存在于增加的神经相同的区域。转基因小鼠白介素-5 (IL-5)表达受角蛋白-14 (K14)启动子驱动，表皮有较多嗜酸性粒细胞，表皮神经数量也明显增加。在共培养中，嗜酸性粒细胞显著增加了从小鼠背根神经节(DRG)分离出的感觉神经元的分支。与肥大细胞或死亡嗜酸性粒细胞共培养的DRG神经元不存在这种效应。嗜酸性粒细胞与神经元的物理接触是不需要的，对神经生长因子的抗体也不能阻断作用。DRG神经元表达eotaxin-1、ICAM-1和VCAM-1，它们可能在皮肤神经区域嗜酸性粒细胞的募集、结合和激活中起重要作用。这些数据表明嗜酸性粒细胞在特应性皮炎的皮肤神经生长中的病理生理作用，并提示他们可能在特应性皮炎和其他有神经症状(如瘙痒)的嗜酸性粒细胞性皮肤条件下提供一个治疗靶点。

引文：福斯特EL，辛普森EL，Fredrikson LJ，李JJ，李NA，油炸锅AD，等人。（2011年），嗜酸性粒细胞增加神经元分支在人类和小鼠皮肤和在体外。PLoS ONE 6(7): e22029。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029

编辑：乔治C. Tsokos，贝斯以色列女执事医疗中心，美国

收稿日期：2011年4月15日;公认：2011年6月13日;发布时间：2011年7月21日

版权：©2011 Foster等。这是在Creative Commons署名许可，这允许在任何介质无限制地使用，分发和再现的条款分布式开放式接入制品，提供的原始作者和源记。

资助:这项工作得到了NIH T32AI007472 (DBJ)和OHSU Tartar奖学金的支持，和the Mayo Foundation for Medical Education and Research, as well as NIH HL61013 (DBJ), HL71795 (DBJ), AI75064 (DBJ), HL55543 (ADF), ES14601 (ADF), HL065228 (JJL), RR109709 (JJL), and HL058723 (NAL). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

利益争夺：作者声明没有竞争的利益存在。

介绍

特应性皮炎的特征是痒，这极大地影响患者[雅凯，1904和生活质量[1]]。痒常常始于任何出现病变之前，对皮肤标记可以被限制在表皮脱落，或划痕，由患者提出。特应性皮炎的经验痒代替疼痛患者当用机械，电气，低pH，或热刺激测试[2]。感觉神经元发射痒是初级传入其细胞体是在背根神经节（DRG）。在表皮和真皮上层这些游离神经末梢可以由多种刺激，包括蛋白酶，神经营养蛋白，细胞因子和其他小分子被活化（综述[3])。

特应性皮炎瘙痒感觉增强的机制尚不清楚。一种可能的机制是特应性皮炎患者的神经末梢增加[4]。具体地，存在于乳头和真皮上部作为疾病进展更神经纤维从临床上正常表现，或non-lesional，皮肤活动性疾病，或皮损，皮肤[5]。

嗜酸性粒细胞已与过敏性皮炎为超过四十年，由于高数量在血液中循环的特应性皮炎患者[6]。嗜酸性粒细胞颗粒蛋白的血清浓度与特应性皮炎的严重程度相关[7]，[8]和从患者外周血嗜酸性粒细胞有更多的神经营养因子受体和更功能活性响应于神经营养因子比来自健康对照嗜酸性粒细胞[9]。特应性皮炎活组织检查中未发现大量完整的嗜酸性粒细胞，这使一些人怀疑这些细胞是否在本病的发病机制中起作用。然而，在受损皮肤中存在的嗜酸性粒细胞颗粒蛋白表明，活化的嗜酸性粒细胞存在，但无法识别，已脱颗粒[10]，[11]。

以前，我们发现嗜酸性粒细胞相互作用与患者气道神经患有哮喘，在哮喘的动物模型，并在文化。嗜酸性粒细胞被发现邻近的神经人类谁从哮喘病发作去世，即在抗原攻击的豚鼠和大鼠概括组织学发现的气道活检[12]。从豚鼠和人的气道副交感神经元的原代培养表达趋化因子-1，以及ICAM-1和VCAM-1，和这些参与神经元嗜酸性粒细胞的结合[13]，[14]。气道嗜酸性粒细胞神经的关联是在病理生理变化重要的是导致气道高反应[12]，[15]。

嗜酸性粒细胞通过各种特定的信号与其它的细胞类型进行通信。它们可以活化后作为抗原呈递细胞，释放细胞因子和趋化因子作用，或释放的颗粒蛋白质，如主要碱性蛋白（MBP）和嗜曙红细胞过氧化物酶（EPO）[16]，[17]。他们还组成合成特殊的神经营养因子，包括神经生长因子（NGF），脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养因子3（NT-3），并且它们可以被触发释放刺激后这些因素[9]，[18]。

在这项研究中，我们研究了特应性皮炎的人的皮肤嗜酸性粒细胞和感觉神经之间的物理和功能的关系，特应性皮炎的小鼠模型，并与初级感觉神经元嗜酸性粒细胞共培养。我们在这里报告，嗜酸性粒细胞颗粒位于上部，或乳头的神经元附近，人体皮肤真皮层，该区域中的神经也增加。在转基因小鼠中IL-5是由K14启动子驱动的，嗜酸性粒细胞定位于表皮，并导致在该区域中增加的神经。在文化方面，嗜酸性粒细胞直接造成分支的感觉神经元，通过不涉及NGF的机制。这些数据表明对在人类过敏性皮炎看到神经的增加的潜在机制和治疗靶标。

结果

人类皮肤活检是健康皮肤和不同阶段特应性皮炎的代表

皮肤活检从五个健康志愿者和六个科目与特应性皮炎聚集。异位性皮炎患者取活检之前没有使用外用皮质类固醇最少一个星期的。每个主题是由皮肤科医生检查，确诊为过敏性皮炎，都是由临床检查和患者及家族病史。所有的特应性皮炎受试者之前被诊断与Hanifin和劳伊考标准[1]。每个健康对照取1个活检，每个特应性皮炎受试者取2个活检，用于双损(L)和非损(NL)皮肤。非损伤性皮肤是指特应性皮炎患者的正常皮肤。主题特征和活检位点显示在表1。所有患者有阳性家族史和个人史为特应性皮炎，包括过敏和哮喘。伊红（H＆E）染色的人皮肤活检证实健康对照的临床诊断，非皮损特应性皮炎皮损或特应性皮炎（图1A)。

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图1。特应性皮炎皮损具有比配对非皮损多神经。

(A)人类皮肤活检的典型特征是健康对照皮肤(左)、非损伤性特应性皮炎(中)和损伤性特应性皮炎(右)。(B)神经染色(灰色)，代表性切片为健康对照(左)、非损伤性(中)和损伤性特应性皮炎(右)。(C)健康对照或特应性皮炎皮肤中神经的数量和长度的定量。对来自同一受试者的损伤和非损伤的皮肤活检进行配对t检验。具有高血嗜酸性粒细胞和增加的神经的离群控制受试者以菱形表示。*表示与对照显著不同。照片比例尺= 50 um。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.g001

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表格1。人类皮肤活检。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.t001

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表2。人皮肤活检中的嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)染色。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.t002

特应性皮炎皮损处皮肤活检比从同一科目的非皮损多神经

活检切片染色用抗体的泛神经元标记PGP9.5。沿皮肤切片的长度拍照，在皮肤的乳头状真皮和基底膜区计数PGP9.5阳性的神经染色。正常、非受损和受损皮肤的代表性显微照片显示，并进行定量分析(图1 B, C)。神经被增加，在数量和长度，在病变特应性皮炎的皮肤，与来自相同患者的每个非皮损皮肤样品。总体而言，神经相比健康对照皮肤也增加，除了一个健康的控制与更多的皮肤神经。这可能是显著，这种异常受试者在高数的嗜酸性粒细胞在血液中，并在皮肤上增加了嗜酸性粒细胞颗粒蛋白。

特应性皮炎皮肤活检有较多的嗜酸性粒细胞颗粒蛋白，这些蛋白位于真皮乳头周围的神经周围

为了确定是否发生嗜酸性粒细胞定位于神经皮肤特应性皮炎活检，我们首先用抗体对嗜曙红细胞过氧化物酶（EPO），存在于嗜酸性粒细胞颗粒的蛋白质进行单免疫组织化学。EPO存在于损伤性特应性皮炎的皮肤在较高的数量比正常或非病变皮肤，并且它通常位于真皮乳头（图2的A，B和表2)。这种定位的位置和疾病的阶段，其中神经增大两者相关。完整嗜酸性粒细胞存在于一些损伤皮肤的部分，更频繁地在血管（数据未显示），这表明已迁移到倾向于脱颗粒组织嗜酸性粒细胞。此外，嗜酸性粒细胞过氧化物酶和双PGP9.5免疫组化确定嗜酸性粒细胞过氧化物酶可以围绕神经真皮乳头层中找到，尤其是病变皮肤样本中（图2C)。

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图2。嗜酸性粒细胞颗粒蛋白存在于特应性皮炎皮肤，神经附近的区域增加。

A）人皮肤活检物用抗EPO抗体染色（深红褐色）。代表性显微照片示病变皮肤的。B）在皮肤EPO阳性簇的定量。C）使用用于神经和抗EPO（红棕色）抗PGP9.5（黑色）双免疫组织化学的代表性显微照片。前面板是健康对照皮肤的两个样本。底部面板有两种皮损特应性皮炎的样品。左下方显示与EPO +细胞神经附近，而右下方示出了神经覆盖有EPO。*表示与对照显著不同。Scale bar = 50 um.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.g002

肥大细胞在增加非病变特应性皮炎的皮肤和皮损不增加

因为在正常和病理状态下，肥大细胞都存在于皮肤中与神经有关[19]，[20]之前的研究报告显示，与健康对照组相比，受损皮肤的肥大细胞有所增加[21]，[22]，我们用甲苯胺蓝给活组织染色。非损伤性特应性皮炎皮肤中肥大细胞增多的趋势不明显，但非损伤性皮炎皮肤中肥大细胞增多的趋势不明显(图3)。

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图3。对照组和特应性皮炎患者的肥大细胞。

肥大细胞非显著上升主要出现在过敏性患者非病变皮肤活检。有在皮损没有增加肥大细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.g003

在转基因小鼠的表皮中，神经在基底角质形成细胞中表达IL-5

产生NJ.692小鼠以组成型表达IL-5在基底角质形成细胞角蛋白14个的调节元件的控制下。小鼠有轻度外周血嗜酸粒细胞增多，在皮肤嗜曙红细胞数目大于30倍增加。一些小鼠发展自发的皮损和临床明显的炎症。这些动物也有嗜酸性粒细胞颗粒蛋白沉积在皮肤中，主要是在表皮，其可使用抗MBP抗体来检测（图4C)。

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图4。角蛋白14白细胞介素5只小鼠具有主要在嗜酸性粒细胞表皮主要碱性蛋白（MBP），并具有在在真皮和表皮比野生型对照基底膜带，但类似的编号的详细神经。

5微米在载玻片上使用抗MBP（红色，在顶三段）进行染色和抗PGP9.5蒙皮部分以显现神经（褐色，在底部三段）。每个整个截面的照片是，并且由不知道所述基因型的观察者分配给每个对神经的量化随机数。（A和d）IgG阴性对照，（B）抗MBP染色野生型小鼠的，（C）抗MBP染色K14-IL-5的皮肤部分的。MBP染色很大程度上出现在表皮，这是其中IL-5表示。（E）染色PGP9.5野生型小鼠，（F）PGP9.5染色K14-IL-5的皮肤部分。注意，来自基底膜区的广泛线性神经穿过表皮的许多层。的神经显示（G）定量的增加表皮（其中IL-5被表达和嗜曙红细胞主要碱性蛋白可见），而不是在真皮。Scale bars = 50 µM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.g004

我们研究这些小鼠的神经数目皮肤切片，发现他们都在表皮和基底膜区比野生型对照更紧张，但紧张的类似号码真皮（图4)。因此，在IL-5表达的区域和嗜酸性粒细胞所在的区域也发现了神经的增加。

嗜酸性粒细胞增加感觉神经元的分支在体外

支配皮肤的感觉神经元的胞体位于背根神经节（DRG），而这些是从野生型小鼠解剖，分离酶并镀上基质胶。血从NJ1638小鼠的，其中，IL-5基因在CD3δ启动子的控制下表达，导致高水平的循环嗜酸性粒细胞[23]。使用密度离心和荧光激活细胞分选(FACS)分离未染色细胞的嗜酸性粒细胞，根据细胞的大小和粒度。嗜酸性粒细胞加入DRG细胞培养24小时。然后将培养物固定，用PGP9.5染色，通过对实验条件不了解的观察者量化细胞体数量、神经突长度、每个细胞体的神经突数量和每个神经突的分支点数量。与单独生长的神经元相比，与嗜酸性粒细胞一起生长的神经元显著增加了神经元的分支(图5的A，B)。细胞体，每个细胞的神经突体的数量和最长突起的长度的数量不是神经元单独或与嗜酸性粒细胞的神经元之间显著不同（数据未显示）。也有在具有或不具有嗜酸性粒细胞DRG细胞存活没有差异（数据未显示）。

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图5。嗜酸性粒细胞增加背根神经节（DRG）神经突的分枝。

(A)分离小鼠DRG神经元，与嗜酸性粒细胞共培养24小时。细胞用anti-PGP9.5染色固定，观察神经元。与单独培养的DRG神经元相比，嗜酸性粒细胞培养的DRG神经元(右)的神经元突起分支显著增加(左)。(B)量化每个细胞体的分支点数量，n = 7。*表示与单独DRG显著不同，**表示与DRG+NGF显著不同。(C)从野生型小鼠腹膜中分离肥大细胞，加入DRG神经元培养24小时。载玻片染色定量如上。n = 4。(D)嗜酸性粒细胞在无菌去离子水中复苏，冷冻解冻2次，在培养基中复苏，加入DRG神经元培养24小时。n = 2。 (E) Culture medium from eosinophils cultured alone or with DRG for 24 hours was applied to new DRG cultures for 24 hours. n = 4. (F) DRG neurons were plated and incubated alone (white bar), with 40 ng/ml NGF (gray solid bar), with NGF and 20 ug/ml anti-NGF (gray hatched bar), with eosinophils (black bar), or with eosinophils and 20 ug/ml anti-NGF (black hatched bar) for 24 hours. n = 2. * denotes significant one-way ANOVA across all groups.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.g005

肥大细胞不增加神经元的分支在体外

由于肥大细胞在周围人的皮肤活检神经本地化，我们分离肥大细胞从野生型小鼠的腹膜和增加他们，在同样号码的嗜酸性粒细胞，对神经元培养了二十四小时。肥大细胞没有增加轴突分支（图5C)。

嗜酸性粒细胞必须是活增加神经元分支，但不是必需的身体接触

为了确定嗜酸性粒细胞是否需要存活才能对神经突分支产生这种影响，我们将嗜酸性粒细胞冷冻断裂并将其加入神经元培养24小时。以这种方式杀死嗜酸性粒细胞并没有增加神经突分支(图5D)。从铺于基质胶二十四小时至DRG培养物中嗜酸性粒细胞增加的培养基增加了神经元的分支，表明该形态变化不需要细胞接触，并且从添加培养基DRG神经元共培养物与嗜酸性粒细胞到新鲜DRG培养进一步增加神经突的分支的量（图5E)。

阻断神经生长因子（NGF）不抑制嗜酸性粒细胞诱导的轴突分支

添加外源小鼠NGF（40纳克/毫升）至DRG培养增加神经突分支和这个作用可被抗体对NGF（20微克/毫升）（图5F)。然而，添加抗NGF的至DRG培养相同的浓度与嗜酸性粒细胞共同培养（图5F）或与嗜酸性粒培养基处理（数据未显示）没有阻止在神经突分支的增加。因此NGF生产嗜酸性粒细胞是不负责对神经分支的影响。

从背根神经节产生趋化因子-1，ICAM-1和VCAM-1的神经元

DRG神经元单独培养二十四小时，染色中eotaxin-1，通过对嗜酸性粒细胞的趋化因子CCR3受体的作用趋化因子[24]，[25]。神经元合成趋化因子-1，无论是在外源NGF的存在和不存在（图6A)。此外，神经元也产生粘附分子ICAM-1和VCAM-1，但仅当外源性NGF加入到培养物(图6B，C)。这表明，可以通过嗜酸性粒细胞或表达的其它细胞的存在的影响的粘附分子的调节表达NGF[9]，[26]。

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图6。DRG神经元产生eotaxin-1、ICAM-1和VCAM-1。

（A）DRG神经元进行分离和24小时，然后固定并用抗eotaxin的-1（红色）染色的单独培养。细胞核被DAPI使用（蓝色）复染。两个代表性的显微照片所示。Scale bars = 50 um. (B–C) DRG neurons were cultured alone or with 40 ng/ml NGF for 24 hours, then fixed and stained with anti-ICAM-1 (B) or anti-VCAM-1 (C). Left, no primary with secondary negative control; center, DRG stained with antibody in cultures without exogenous NGF; right, DRG stained with antibody in cultures with NGF added. GRAPH: Quantification of relative fluorescence units, compared to background and to negative controls, was performed using Metamorph.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022029.g006

讨论

我们的数据表明，第一次，嗜酸性粒细胞可以显着提高感觉神经元分支，而且这种影响是重要的，嗜酸性皮肤疾病，如过敏性皮炎。我们发现，有更多的神经皮损与非皮损特应性皮炎，这与量和嗜酸性粒细胞颗粒蛋白的位置相关。在转基因小鼠中表达IL-5通过一个K14启动子驱动的，都和嗜酸性粒细胞增加的神经支配分别定位到表皮。最后，嗜酸性粒细胞显着增加在培养的背根神经节感觉神经元的神经突的分支。嗜酸性粒细胞，促进轴突分支在感觉神经元中文化的能力支持特应性皮炎嗜酸性粒细胞在神经变化中的作用。ICAM-1和VCAM-1，以及趋化因子-1的感觉神经元表达，表明嗜酸性粒细胞的活性募集至神经，如我们以前已经证明在气道副交感神经元[13]。

我们活检从几个地方采取解剖，控制患者的活检均从手臂内侧取（表1)。虽然这可能会影响神经的数量，在皮肤神经密度区域差异将有利于在手臂上多神经比腿[27]，我们发现对面比较特应性皮炎活组织检查对照活检时。虽然是在我们人类的皮肤活检皮肤的肥大细胞普遍提高，不同的是嗜酸性粒细胞皮肤的肥大细胞没有在皮损，其中神经被的增加而增加。这一发现，与肥大细胞的破坏，促进神经体外沿分支，表明嗜酸性粒细胞更可能负责。

在人类和小鼠的皮肤中，我们没有确定哪种类型的神经数量增加了，尽管这些神经在真皮乳头和基底膜带的位置暗示了感觉起源。然而，我们的培养实验专门检测了感觉神经元的分支与背根神经节的细胞体，其中包括瘙痒特异性的c型神经元[2]，[28]，[29]。

据报道，瘙痒特异性的c型神经元具有更多高度分支的末端，使它们能够支配异常大的组织区域[29]。这可能是嗜酸性粒细胞不是简单地刺激神经生长，但也产生受影响神经细胞的表型的转变。一种用于在这种类型的转变所在的先例痛觉过敏和异常性疼痛，在其改变神经递质的释放，离子通道调节和阈值的刺激导致非疼痛刺激的疼痛知觉[30]，[31]。

我们证明了NGF并不是嗜酸性粒细胞诱导的神经突分支的必要因素，我们使用的阻断抗体对BDNF和神经营养因子3和4的交叉反应活性小于1% (NT-3, NT-4)。然而，嗜酸性粒细胞合成其他神经营养因子，包括BDNF和NT-3[18]，[32]，以及白介素和其他介质，可能是负责神经生长。因此，有可能在该系统中可观的冗余度，以及其他的，非神经营养蛋白嗜酸性粒细胞的产品，所涉及的可能性。例如，主要碱性蛋白，嗜酸性粒细胞颗粒的主要constitutent，与神经元在几个层次上相互作用，包括对神经阻断M2毒蕈碱受体[15]，增加感觉神经兴奋性[33]和活化p38MAP激酶[34]。主要碱性蛋白，以及其他嗜酸性粒细胞颗粒蛋白和非颗粒产物的影响，不得而知。

我们的研究结果也为其他嗜酸性皮肤疾病，其中一些引起瘙痒为主要症状很重要。痒丘疹性爆发已经在增多综合征（HES），并且可以用紫外线成功治疗已有描述（UV）治疗[35]。在单纯以瘙痒为特征的结节性瘙痒病中，免疫荧光法检测了大量嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和EDN的沉积。完整的嗜酸性粒细胞常位于神经附近，在嗜酸性粒细胞较多的区域神经数量增加[36]。最后，疾病称为致敏马甜痒结果蠓和随后的“挑战”或进一步咬咬。嗜酸性粒细胞趋化因子通过和MCP-1，这是致敏马的皮肤表现招募和马搔抓，摩擦，咬了病变，从而导致皮肤增厚和脱发[37]。

我们的报告显示嗜酸性粒细胞在神经分支中的作用体内和在体外，并有力地表明，这是有关人类皮肤疾病，包括过敏性皮炎，其中嗜酸性粒细胞和神经被发现在一起。感觉神经元的能力，表达粘附分子和趋化因子与嗜酸性粒细胞相互作用表明嗜酸性粒细胞相关的皮肤疾病潜在的药物靶点。

方法

人体皮肤活检

人类研究由俄勒冈健康与科学大学（IRB批准＃2568）的机构审查委员会批准，所有患者签署知情同意书。健康受试者和特应性皮炎患者采访了特应性个人和家族病史，然后由皮肤科医生检查，以确定疾病的程度。被要求过敏症的自我报告的历史纳入为特应性皮炎的患者，所有患者有过敏性的以往的诊断由OHSU皮肤科皮炎。四个毫米钻取活组织检查从正常表现（非损伤）或活性（病变）疾病的区域中去除。从健康受试者正常皮肤活检从手臂内侧或膝关节后面切入。所有活检固定在10％中性缓冲福尔马林，石蜡包埋。

人体皮肤免疫细胞化学

5微米石蜡切片切成在载玻片上，并且将这些通过二甲苯和乙醇的顺序稀释液再水合。抗原修复溶液根据所述协议，[向量]使用的，并施加在甲醇中的3％过氧化氢十分钟，以猝灭内源性过氧化物酶活性。将切片用10％正常山羊血清和小鼠抗人蛋白基因产物9.5（PGP9.5）[Serotec公司]，在4℃下施加过夜。将载玻片在PBS中漂洗和生物素化山羊抗 - 小鼠IgG涂覆在室温下30分钟。所述的Vectastain ABC试剂盒和生色底物用于显现阳性抗体染色。载玻片在自来水中漂洗，然后通过乙醇稀释和二甲苯脱水。使用Cytoseal CrystalMount封片并干燥过夜。同样，染色嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）的人皮肤活检物阻塞，在4℃下用抗体温育过夜，然后作为PGP9.5染色的载玻片相同处理。染色两者EPO和PGP9.5切片与抗生物素蛋白 - 生物素来自Vector阻断试剂盒，以防止非特异性信号处理。用于H＆E或肥大细胞识别切片脱蜡并再水化如上，然后用苏木精和伊或甲苯胺蓝染色。

人体皮肤的免疫染色的半定量分析

40×或60×显微照相每个皮肤活检的整个区域的。测量是乳头状真皮，网状真皮，下皮，表皮和真皮区;然而，仅报告乳头表皮和真皮/基底膜的测量。神经长度通过各照片校准到与它被带到目标然后画一条与PGP 9.5阳性神经的两个最远点之间的直线，用Metamorph软件计算。神经数目手动计数。数据报告为平均每照片神经，并且每张照片神经的平均长度。肥大细胞在双重染色60×照片进行计数，并接近使用Metamorph软件来测量神经。15微米，或大约一半肥大细胞的直径，被确定为肥大细胞和神经之间的“关联”的极限。

动物

雌性野生型C57BL/6小鼠，6 - 8周龄，购自Jackson实验室。NJ.1638 IL-5转基因小鼠,小鼠IL-5序列,每一个基因内区和1.2 kb的3′侧翼序列,但没有一个上游调控元件,是由CD3δ型和组织增强剂,过表达IL-5在T细胞。这些小鼠的产生、繁殖和基因分型如前所述(67)。NJ.692只小鼠(K14/IL5转基因小鼠)是通过创建含有1.9 kb K14启动子的质粒构建而获得的(由Elaine Fuchs博士提供)[38]融合到IL-5基因。质粒载体切除后，将质粒插入小鼠胚胎中。用C57Bl/6J小鼠(Jackson实验室)繁殖小鼠，并使用南部分析BamHI消化的尾DNA印迹到放射性标记的IL-5 cDNA或使用针对IL-5注入DNA的特异性引物的PCR反应进行维护。PCR引物为(K14)5'GCG TTG CTA GCC TGT GGG 3'和（IL5的β2）5 ' CAG CCT ACC CTA CAT AGC AAG TTT g3 '。所有的动物实验是由美国俄勒冈州健康与科学大学（批准＃B11249）的机构动物护理和使用委员会批准，并按照国家卫生研究院和梅奥基金会的机构准则进行。

小鼠皮肤免疫细胞化学

小鼠皮肤切片用4%甲醛固定，石蜡包埋。使用兔抗哺乳动物PGP9.5和生物素化山羊抗兔IgG对5微米切片进行与人类皮肤相同的免疫染色。序列样本用Lee实验室产生的PGP9.5和主要碱性蛋白(MBP)抗体进行双染色。大鼠抗鼠MBP于4℃过夜，与荧光团Alexa Fluor-555偶联的二抗于37℃孵育2 h。用PBS冲洗玻片，用Vectastain和DAPI固定，染色细胞核。

小鼠皮肤免疫组化半定量分析

整个小鼠皮肤切片的60×的照片是。载玻片去标识使用算法来每张照片分配的随机数，以及由不知道的状况的调查被采取在乳头状真皮PGP-阳性斑点，网状真皮层，并且每个盲照片的表皮 - 真皮区的测量活检。神经长度通过校准每个照片的60×物镜和然后画一条PGP 9.5阳性神经的两个最远点之间的直线，用Metamorph软件计算。神经数目手动计数。从每个照片数据进行平均以确定平均数目每张照片神经，每张照片神经长度的总和，并且每张照片神经的平均长度。每一张照片已被取消编码的所有测量和计算完成后。每单位面积或每基底膜的长度神经神经的定量没有给从每张照片神经的数目不同的结果。

背根神经节的分离（DRG）

背根神经节，根据以前公开的方案修改隔离[39]，[40]。将野生型C57BL/6小鼠的颈椎、胸椎、腰椎DRG解剖，于0.05%胶原酶37℃下孵育4 h, 300×g室温离心10 min, 37℃下3 ml 1.25%胰蛋白酶- edta重悬15 min。细胞再次离心，用DMEM、10%胎牛血清、青霉素-链霉素重悬，并预镀。次日，无贴壁细胞离心，于含青霉素-链霉素的C2神经生长培养基中复苏，浓度为5×10五细胞/ ml。神经铺板在基质胶包被室载玻片。鼠NGF在40纳克/毫升的浓度加入到培养物中的一些。羊抗NGF进行20微克/ ml的最终浓度加入。在每个实验结束时，将细胞固定在4％多聚甲醛5分钟。

鼠血嗜酸性粒细胞的分离

稀释的血液从NJ.1638（IL-5转基因）的小鼠中铺在15毫升无菌的Percoll（密度1.084克/毫升），并在2000×g下离心45分钟。白色层在界面处，其中载有粒细胞，收集，洗涤，并在4℃以300×g离心15分钟℃。红细胞裂解和嗜酸性粒细胞通过尺寸和粒度使用荧光激活细胞分选（FACS）分离。台盼蓝染色来确定活力。％的纯度通过细胞离心涂片上滑动Hemacolor测定法测定。FACS染色后，嗜酸性粒细胞的百分比纯度通过Hemacolor染色和细胞分类计数下的20×物镜亮视野显微镜的测定。嗜酸性粒细胞的分选后的纯度为91％。将细胞重悬于C2神经介质细胞在指定浓度，并加入到DRG神经元培养24小时。

鼠腹腔肥大细胞的分离

根据Jensen等人的方法腹膜肥大细胞中分离得到。[詹森B，诈骗E，磐S，Gilfillan的A，CURRENT PROTOCOLS IN免疫学，2006，威利INTERSCIENCE]。一个单一的鼠标被打死，腹膜与HBSS灌洗。灌洗液在400×g下离心5分钟，红血细胞裂解，将细胞用HBSS洗涤两次。物再悬浮于70％的等渗的Percoll溶液的球粒，并将细胞铺在过滤灭菌的腹膜肥大细胞（PMC）培养基（DMEM，5个％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，50微克/毫升庆大霉素，20mM的HEPES）和在580×g下离心，在室温下15分钟。肥大细胞沉淀重悬浮于PMC平台。细胞的等分试样计数并用台盼蓝染色来确定生存力或甲苯胺蓝，以确定肥大细胞的纯度。最后，将细胞调整至指定浓度，加入到幻灯片或孔中，并在35.5℃，5％CO 2温育。

背根神经节免疫细胞化学

与DRG载玻片固定在4％多聚甲醛5分钟，漂洗用HBSS与钙和镁，以及储存在PBS中直至染色。玻片用10％血清和用抗体染色，以PGP 9.5，ICAM-1，VCAM-1，嗜伊红素或-1过夜，在4℃。在PBS中清洗后，第二抗体缀合到Alexa氟-555，或生物素，施加。载玻片漂洗并要么安装在矢量封固介质用DAPI，以染色细胞核，或完成后，利用Vector的Vectastain抗生物素蛋白 - 生物素复合免疫组织化学试剂盒和安装。

背根节神经成像和定量

每组治疗后拍照30张40×，抗pgp 9.5抗体染色。照片总是从四孔腔体滑道的每口井的中心开始拍摄，然后以所有滑道相同的定义模式拍摄每一个后续的视野。利用变形，每个细胞体的细胞体、神经突和分支点的数量被手工计算。每张照片中的每个细胞都被量化了。此外，使用分段线函数测量神经突长度，使神经突可以从一端到另一端进行追踪，并根据40×物镜的像素/微米比进行测量。每个测量的平均值(细胞体的数量，神经突，分支点和神经突的长度)在所有的细胞体在30个图片被确定。提供了验证该方法的两种方法:第一,一组照片各两个实验被蒙蔽量化观察者,谁知道治疗组和预测结果,第二,照片被随机在每个地方的一个实验中,然后一个失明的观察者进行了测量。发现盲法观察结果与非盲法观察结果相吻合。

数据的统计分析

所有数据都表示为平均值+/- SEM。两组之间的比较使用由t检验未配对数据，而在来自同一人的皮损和非损伤皮肤的神经比较使用配对t检验进行。多重比较采用单因素方差分析，与杜克的后测试来评估组间差异。小于0.05的p值被认为是统计学显著。

致谢

非常感谢伊丽莎白·比文斯 - 史密斯，王振英聂，和杰西·洛顿在项目过程中提供技术援助，以及为山月桂Buels和Jon Hanifin咨询和富有成效的讨论，并格雷戈里·斯科特，谁提供的软件编码分配随机数照片，在不知情的量化使用。

作者投稿

构思和设计实验：EF LF NL JL AF DJ。进行的实验：EF ES LF NL。分析数据：EF AF DJ。贡献试剂/材料/分析工具：ES LF NL JL。写文章：ES NL DJ。

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