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研究文章gydF4y2Ba

中性粒细胞的作用在轻微和严重的流感病毒感染的老鼠gydF4y2Ba

中性粒细胞的作用在轻微和严重的流感病毒感染的老鼠gydF4y2Ba

  • 米歇尔·d·泰特gydF4y2Ba
  • 丽莎·j .埃尼迪斯gydF4y2Ba
  • 本·克罗克gydF4y2Ba
  • 罗瑞拉·e·布朗,gydF4y2Ba
  • 安德鲁·g·布鲁克斯gydF4y2Ba
  • 帕特里克·c .阅读gydF4y2Ba
公共科学图书馆gydF4y2Ba
xgydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

中性粒细胞都牵连到保护和流感病毒感染后病理反应。我们使用马伯1 a8专门耗尽LyG6 (anti-Ly6G)gydF4y2Ba高gydF4y2Ba中性粒细胞和诱导小鼠中性粒细胞减少感染病毒株毒力不同。老鼠也接受马伯RB6-8C5 (anti-Ly6C / G或anti-Gr-1), mAb广泛用于研究在小鼠中性粒细胞的作用已被证明绑定和消耗额外的白细胞子集。使用马伯1 a8,我们证实的有益作用的病毒株感染小鼠中性粒细胞中间(HKx31;H3N2)或高(PR8;H1N1流感毒性而治疗小鼠感染无毒株(BJx109;H3N2)并不影响疾病或病毒复制。治疗BJx109-infected小鼠马伯RB6-8C5,然而,伴随着显著的减肥和增强病毒复制其他Gr-1表明gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,中性粒细胞,轻微的流感感染期间限制疾病的严重程度。gydF4y2Ba

引用:gydF4y2Ba泰特医学博士,埃尼迪斯LJ,克罗克B,布朗勒,布鲁克斯AG)、阅读PC(2011)中性粒细胞的作用在轻微和严重的流感病毒感染的老鼠。《公共科学图书馆•综合》6 (3):e17618。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618gydF4y2Ba

编辑器:gydF4y2BaFouchier,伊拉斯谟医学中心,荷兰gydF4y2Ba

收到:gydF4y2Ba2010年10月8日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2011年2月2日;gydF4y2Ba发表:gydF4y2Ba2011年3月14日,gydF4y2Ba

版权:gydF4y2Ba©2011泰特et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。gydF4y2Ba

资助:gydF4y2Ba本研究项目拨款支持的509230年和567122年计划授予国家卫生和医学研究委员会(NH&MRC)的澳大利亚。PCR是一种NH&MRC r•赖特研究员。墨尔本卫组织流感参考和研究合作中心由澳大利亚政府部门支持健康和老龄化。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。gydF4y2Ba

利益冲突:gydF4y2Ba作者宣称没有利益冲突存在。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

中性粒细胞招募到呼吸道流感病毒感染后人类和老鼠gydF4y2Ba[1]gydF4y2Ba和大量渗透到航空与高致病性病毒感染小鼠后重建等1918 H1N1病毒和H5N1菌株gydF4y2Ba[2]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba。目前的证据表明,小鼠感染后起到保护作用的中性粒细胞(i)人类病毒株的中间毒性gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba,(ii) mouse-adapted /公关/ 8/34应变(PR8, H1N1流感gydF4y2Ba[6]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[7]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[8]gydF4y2Ba或(3)致命的流感病毒重组表达血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的1918 H1N1大流行性流感病毒gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba。然而,损耗neutrophil-attracting趋化因子MIP-2与中性粒细胞减少招聘和温和的肺部病理学PR8感染的老鼠后,表明特异表达或中性粒细胞反应过度期间,航空公司可能导致疾病严重的流感感染gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba。因此,特定角色的中性粒细胞在轻微和严重的流感病毒感染仍不清楚。gydF4y2Ba

治疗小鼠马伯RB6-8C5 (anti-Ly6C / G或anti-Gr-1)被广泛用于耗尽中性粒细胞的感染和炎症的小鼠模型(审核gydF4y2Ba[10]gydF4y2Ba),包括流感病毒感染gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[8]gydF4y2Ba。然而,扩展戴利的结果gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba,我们已经表明,mAb RB6-8C5不是非常具体的中性粒细胞但结合一系列额外的白细胞数量在流感病毒感染小鼠的肺,包括CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞,巨噬细胞、NK细胞和常规和血浆树突细胞(分别为疾病预防控制中心和pDC)。结合RB6-8C5 Ly6C这些细胞与表达,不是Ly6GgydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba制造的解释研究使用马伯RB6-8C5诱导中性粒细胞减少复杂的其他Gr-1的不必要的损耗gydF4y2Ba+gydF4y2Ba白细胞。我们表明,mAb 1 a8 Ly6G完全结合gydF4y2Ba高gydF4y2Ba中性粒细胞在流感病毒感染小鼠的航空公司和特定的Ly6G损耗gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞与马伯1 a8导致小鼠感染加剧了疾病病毒株HKx31 (H3N2)。gydF4y2Ba

在初步研究中,我们观察到病毒株的低(BJx109 H3N2)、中级(HKx31 H3N2)或高毒性(PR8, H1N1流感在老鼠的能力明显不同航空公司招募中性粒细胞。鉴于中性粒细胞防护和病理反应涉及流感病毒感染后,我们研究了中性粒细胞的作用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba感染后病毒株在小鼠毒性不同。此外,鉴于马伯RB6-8C5耗尽的广泛使用在小鼠中性粒细胞gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[12]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[13]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba,我们比较小鼠的治疗效果与马伯1 a8或马伯RB6-8C5耗尽Ly6GgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞或Ly6CgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ Ly6CgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(即Gr-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)细胞,分别。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

对小鼠流感病毒株的毒力不同gydF4y2Ba

HKx31 (H3N2)和BJx109 (H3N2)高收益是重组株的PR8爱知/ 2/68 (H3N2)和/北京/ 353/89 (H3N2),分别承担来自PR8 H3N2表面糖蛋白和内部组件。我们首先比较减肥(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)和病毒载量(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba10)B6小鼠鼻内感染gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位的PR8 HKx31 BJx109。小鼠感染BJx109不减肥也没有显示临床疾病的迹象,在为期10天的监测期间的任何时候。HKx31-infected老鼠显示瞬时体重感染但恢复之后的第一周,没有动物死于感染。相比之下,老鼠感染PR8迅速减肥,显示严重的临床疾病的证据(蜷缩,呼吸困难;数据未显示),安乐死感染后4 - 5天。因此这些病毒株分类的低(BJx109)、中级(HKx31)或高(PR8)毒性流感感染的小鼠模型。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图1所示。gydF4y2Ba毒性的C57BL / 6小鼠流感病毒。gydF4y2Ba

老鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位的BJx109 HKx31或PR8。(一)减肥。老鼠体重每天和结果表示为每组平均体重变化百分比(±SEM),相比之前体重立即感染。(B)滴定度在第五天感染后病毒在肺部。肺被移除和传染性病毒在澄清匀浆测定的滴定度标准空斑实验。数据代表的意思是病毒滴定度±1 SEM。的检出限测定由虚线表示。数据显示5组小鼠和代表两个或更多独立的实验。* =病毒滴定度从PR8-infected小鼠显著高于HKx31-infected小鼠(p < 0.001,单向方差分析)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618.g001gydF4y2Ba

病毒载量测定小鼠的肺中每个的病毒感染后5天(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。这个时间点被选为它对应的时间PR8-infected老鼠死于疾病gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。BJx109引发轻微的疾病,从肺部清除白天5感染后(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba),尽管高病毒滴定度时可以恢复先天免疫的组件,如气道巨噬细胞、枯竭gydF4y2Ba[16]gydF4y2Ba。在第五天感染后,病毒滴定度明显高于HKx31-infected老鼠的肺又高出10 - 100倍PR8-infected小鼠的肺。因此,毒性之间的直接相关性观察小鼠和每个病毒株的复制能力的航空公司(即PR8 > HKx31 > BJx109)。gydF4y2Ba

中性粒细胞招募与BJx109呼吸道感染后的老鼠,HKx31或PR8gydF4y2Ba

流感病毒感染的细胞炎症反应是评估肺支气管肺泡灌洗(BAL))(通过分析和上呼吸道(通过分析collagenase-treated鼻组织)在不同跨度为感染后10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位的BJx109 HKx31或PR8。首先,可行的计数进行确定细胞总数从矿山中恢复过来(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba左面板)或鼻组织(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,右面板)感染或感染病毒的老鼠。低数量的平衡细胞恢复BJx109-infected老鼠天1,3,5,7感染后(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba左面板)。同等剂量的HKx31感染的老鼠细胞的积累导致了更大的航空公司,第五天落下帷幕细胞感染后人数∼2.5倍高于从BJx109-infected老鼠中恢复过来。PR8感染与炎症细胞的进步招聘相关航空公司,这样白天5 BAL细胞数量和∼∼14倍倍高于细胞数量从BJx109 HKx31-infected小鼠,分别。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图2。gydF4y2Ba中性粒细胞反应后的航空BJx109感染的老鼠,HKx31或PR8。gydF4y2Ba

5组小鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba每个病毒空斑形成单位通过鼻内的路线,在《纽约时报》表示,老鼠死亡,灌洗。的数量(A)总BAL和鼻组织细胞,和(B)总BAL和鼻组织从病毒感染小鼠中性粒细胞。细胞数量的液体从天真的老鼠都包含比较。中性粒细胞和CD45通过流式细胞术gydF4y2Ba+gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba高gydF4y2Ba细胞。最少50000活细胞(πgydF4y2Ba−gydF4y2Ba)收集和分析来自每个鼠标。* = BJx109相比显著降低HKx31 PR8;gydF4y2Ba#gydF4y2Ba= HKx31 PR8相比显著降低;gydF4y2BaxgydF4y2Ba= HKx31 BJx109和PR8(相比显著降低gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,单向方差分析)。(C)水平的KC, MIP-2和MIP-1αBAL上层清液在不同时期在流感病毒感染。天真(N)动物包括进行比较。趋化因子水平ELISA测定和结果表示在pg / mL。为每个ELISA检测极限是虚线所示。ND =不作为PR8-infected小鼠安乐死在第五天感染后。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618.g002gydF4y2Ba

鼻组织细胞数量的老鼠感染BJx109达到第三天感染后(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,右面板),而那些从HKx31-infected老鼠增加逐步从第一天到第七天感染后。注意,虽然高细胞总数从鼻腔组织BJx109-infected小鼠1和3在天感染后(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,右面板),中性粒细胞数没有显著不同团体之间的病毒感染了每一个在这些时间点(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba右面板)。感染PR8诱导招募大量的白细胞鼻组织第五天感染后,细胞被∼2倍或三倍高于∼号码恢复BJx109——或者HKx31-infected小鼠,分别。gydF4y2Ba

在初步实验中,微分染色的细胞恢复BAL和鼻病毒感染小鼠的组织表明,中性粒细胞浸润在早期的著名的组成部分(1 - 3天,BJx109和HKx31),后来(第五天,PR8)阶段的流感感染(数据没有显示)。因此,流式细胞术被用来量化中性粒细胞数量BAL和鼻组织在不同时期感染后10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位的BJx109 HKx31或PR8 (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。在以前的研究中,我们使用细胞分类和形态分析证明> CD45的95%gydF4y2Ba+gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba高gydF4y2Ba细胞中性粒细胞落下帷幕gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。中性粒细胞反应BJx109和HKx31感染后1 - 3天达到顶峰,人数明显高于落下帷幕的液体从HKx31-infected老鼠跨度为测试。中性粒细胞招募到球的模式与PR8(接种后gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)是明显不同的中性粒细胞数量在第一天感染后较低,但逐渐增加到第五天感染后。因此,在PR8感染落下帷幕的积累细胞,包括中性粒细胞与严重疾病的发展。中性粒细胞被招募进鼻腔组织每个病毒株感染和峰值后中性粒细胞数量BJx109-infected老鼠恢复在感染后3天。相比之下,感染后中性粒细胞数量随着时间的增加与HKx31或PR8和类似的中性粒细胞数量从鼻组织病毒株感染后5天。gydF4y2Ba

概括地说,中性粒细胞浸润到BAL的模式与BJx109感染后,HKx31或PR8与neutrophil-attracting趋化因子的表达KC, MIP-1α和MIP-2航空公司(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。KC和MIP-2 BAL中发现液体从BJx109-infected小鼠在感染后1天,仍低。HKx31诱导趋化因子的类似的模式,但MIP-2水平较高的和额外的低水平的MIP-1α感应。PR8诱导相对高水平的每个3趋化因子,尽管水平相当变量BAL液体在每个时间点。gydF4y2Ba

小鼠中性粒细胞不容易感染流感病毒gydF4y2Ba

由于中性粒细胞招募的不同模式和BJx109感染后气道,HKx31或PR8 (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba),我们接下来研究纯化小鼠中性粒细胞对感染的易感性每个病毒株gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。首先,整除10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba来源于中性粒细胞或小鼠气道上皮细胞的纯化骨(LA-4)与10孵化gydF4y2Ba7gydF4y2BaPFU BJx109, HKx31或PR8 1小时在37°C,清洗以去除多余的病毒和文化一个额外的2 - 24小时后,收集上清液,澄清和传染性病毒的水平上使用标准的空斑实验MDCK细胞。传染性病毒的滴定度增加了上层清液从BJx109∼100倍,HKx31——PR8-infected LA-4细胞感染后2 - 24小时,符合生产感染上皮细胞(数据没有显示)。相比之下,传染性病毒的滴定度没有增加2到24小时在上层清液virus-exposed中性粒细胞,确认他们不支持生产BJx109感染,HKx31or PR8(数据没有显示)。gydF4y2Ba

接下来,我们孵化LA-4细胞纯化中性粒细胞和10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba空斑形成单位的病毒株(如上所述),洗涤后,细胞培养进一步8小时。这一次后,细胞被固定和染色新合成的细胞内表达病毒NP。注意,细胞孵化UV-treated BJx109(传染性病毒灭活)作为控制。每个病毒株(LA-4上皮细胞被感染的gydF4y2Ba图3的人工智能gydF4y2Ba病毒NP),而不是在细胞培养中发现UV-inactivated BJx109。LA-4细胞相比,病毒NP蛋白没有检测到孵化后中性粒细胞与BJx109 HKx31或PR8 (gydF4y2Ba图3还gydF4y2Ba),这表明不容易感染小鼠中性粒细胞BJx109, HKx31或PR8病毒。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图3。gydF4y2Ba中性粒细胞不容易感染流感病毒。gydF4y2Ba

成熟的小鼠中性粒细胞从骨髓净化中描述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。整除的10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(我)LA-4上皮细胞,或(ii)中性粒细胞与10孵化gydF4y2Ba7gydF4y2Ba空斑形成单位的BJx109 HKx31或PR8。控制细胞孵化BJx109被UV-inactivated摧毁病毒传染性(紫外线BJx109)。1小时后,细胞被洗和孵化一个额外的8小时。(A)细胞被固定和水平的细胞内病毒NP蛋白由流式细胞术。直方图显示代表细胞培养病毒(灰色)或未感染控制细胞(白色)。门设置为包含5%的细胞未受感染的控制和细胞染色阳性细胞内NP的比例相对于在每个面板所示。RNA提取细胞(B) (i) vRNA水平和(2)信使RNA编码NP, PA和M基因决定通过定量rt - pcr。细胞孵化仅在媒体(模拟)作为一个控制。数据表示在pg / ml和代表三个独立实验的平均数±标准差。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618.g003gydF4y2Ba

以确定病毒如果中性粒细胞是容易进入和/或病毒复制的早期阶段(通过检测vRNA)和/或翻译(通过检测mRNA),我们孵化LA-4纯化细胞或中性粒细胞与流感病毒(如上所述),在感染后8小时,RNA提取和定量rt - pcr进行水平来确定vRNA和PA和M基因的信使RNA编码(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。vRNA中没有检测到mock-infected LA-4细胞,但被检测出含有高水平与要么BJx109 LA-4细胞孵化,HKx31或PR8 (gydF4y2Ba图3双gydF4y2Ba左面板)。相比之下,vRNA低于检测小鼠中性粒细胞或出席低水平孵化与病毒(gydF4y2Ba图3双gydF4y2Ba右面板)。类似的模式观察病毒mRNA表达高水平的记录与BJx109 LA-4细胞孵化,HKx31或PR8 (gydF4y2Ba图3 biigydF4y2Ba左面板),但是很低/检测水平记录在中性粒细胞(gydF4y2Ba图3 biigydF4y2Ba右面板)。因此,虽然感染小鼠气道上皮细胞基因组复制和生产支持由BJx109 HKx31 PR8病毒,小鼠中性粒细胞。gydF4y2Ba

治疗效果马伯1 a8或毒性的马伯RB6-8C5 BJx109, HKx31和PR8老鼠gydF4y2Ba

马伯RB6-8C5 (anti-Ly6C / G或anti-Gr-1)已经被研究者广泛使用消耗从小鼠中性粒细胞gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[12]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[13]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba然而使用这种马伯复杂化的能力结合(因此耗尽)额外的白细胞数量gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[17]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[18]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[19]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[20]gydF4y2Ba。我们曾利用马伯1 a8 (anti-Ly6G)专门耗尽中性粒细胞小鼠呼吸道感染后的低剂量(10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位)HKx31gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。而细胞排序确认Gr-1gydF4y2Ba高gydF4y2Ba细胞可以分为中性粒细胞gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba,我们证明了一系列额外的白细胞恢复HKx31-infected小鼠肺部的子集,包括CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,NK1.1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,NKT细胞,巨噬细胞,疾控中心和pDCs,表示Gr-1中级水平,因此可能会耗尽后治疗小鼠anti-Gr-1抗体gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。相比之下,mAb 1 a8 Ly6G完全约束gydF4y2Ba高gydF4y2Ba呼吸道病毒感染小鼠中性粒细胞。此外,BJx109 HKx31和PR8显示明显差异的能力引起白细胞,包括NK细胞、CD8 T细胞gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba航空公司,更复杂的使用马伯RB6-8C5比较中性粒细胞的作用与株感染小鼠后不同的毒性。gydF4y2Ba

检查在感染BJx109中性粒细胞的作用,HKx31 PR8,老鼠接受马伯1 a8在感染前10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位的病毒。简单地说,老鼠接受纯化抗体(0.5毫克ip和0.2毫克i.n)。有一天之前感染和每隔一天之后,所述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。控制纯化的小鼠接受同等治疗大鼠免疫球蛋白和老鼠也接受马伯RB6-8C5进行比较。老鼠每天监测疾病的迹象,体重变化和生存。有效的中性粒细胞减少(> 90%)证实了血液和BAL细胞形态分析(数据没有显示)。未受感染的老鼠接受类似的政权纯化马伯1 a8, RB6-8C5或鼠免疫球蛋白g没有减肥或显示任何生理异常10天监测一段时间(数据没有显示)。gydF4y2Ba

小鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2BaPFU BJx109和马伯1 a8或控制免疫球蛋白治疗不存在疾病的临床症状或在任何时间点减肥(gydF4y2Ba图4的人工智能gydF4y2Ba),而BJx109-infected小鼠接受马伯RB6-8C5损失了10%的原始体重,但从感染中恢复过来(gydF4y2Ba图4 bigydF4y2Ba)。小鼠感染HKx31和对待马伯1 a8或马伯RB6-8C5迅速减肥,所有老鼠死于疾病在第五天感染后(gydF4y2Ba图4 / 4 bii暗生gydF4y2Ba),而所有IgG-treated控制感染动物幸存下来。IgG-treated控制相比,治疗PR8-infected小鼠马伯RB6-8C5与轻微的延迟在多个实验(减肥gydF4y2Ba图4哎gydF4y2Ba)治疗而PR8-infected鼠马伯1 a8一直死于感染比IgG-treated控件(提前1天gydF4y2Ba图4 biiigydF4y2Ba)。总之,这些数据表明Ly6GgydF4y2Ba+gydF4y2Ba小鼠中性粒细胞发挥有益作用后的挑战与流感病毒株中度到高毒性。相比之下,特定的中性粒细胞减少使用马伯1 a8没有改变感染后病程无毒BJx109压力。Gr-1枯竭gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(使用马伯RB6-8C5),然而,伴随着显著减肥BJx109-infected老鼠。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图4。gydF4y2Ba马伯1 a8和马伯RB6-8C5治疗小鼠在感染BJx109之前,HKx31或PR8。gydF4y2Ba

5组B6小鼠净化处理(A) anti-Ly6G (1 a8)或(B) anti-Gr-1 (RB6-8C5)抗体病毒感染前24小时,之后每隔一天。控制老鼠收到鼠免疫球蛋白(免疫球蛋白)。数据显示,减肥对小鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2BaBJx109空斑形成单位的(我),(2)HKx31或PR8 (iii)。老鼠体重每天和结果表示为每组的平均体重变化百分比(±SEM),相比原来的体重。动物失去了≥25%的原始体重和/或提供的证据肺炎被安乐死。数据显示来自一个实验中,代表两个独立的实验。的虚线表示天减肥治疗引起的(A)马伯1 a8或(B)马伯RB6-8C5 IgG-treated控件(在统计学上不同gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618.g004gydF4y2Ba

马伯1 a8和马伯RB6-8C5治疗病毒复制后的呼吸道鼻内感染gydF4y2Ba

检查的影响中性粒细胞在呼吸道病毒复制,老鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2BaPFU BJx109, HKx31 PR8和对待马伯1 a8之前和期间每个病毒株感染。额外的老鼠mAb RB6-8C5而控制老鼠收到同等对待和纯化鼠免疫球蛋白治疗方案。肺部的感染病毒含量测定在第五天感染后(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。治疗BJx109-infected小鼠马伯1 a8没有改变病毒载量,而治疗马伯RB6-8C5导致增强病毒复制和延迟清关。类似传染性病毒的滴定度也从鼻中恢复过来的匀浆BJx109-infected老鼠马伯1 a8处理(数据未显示)。IgG-treated控制相比,病毒滴定度都有所升高后HKx31——PR8-infected小鼠的肺治疗马伯1 a8或马伯RB6-8C5。因此,使用马伯1 a8我们证明中性粒细胞可以发挥重要作用在限制病毒复制小鼠肺部的感染HKx31 PR8,但不是BJx109。Gr-1枯竭gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,但不是Ly6GgydF4y2Ba高gydF4y2Ba中性粒细胞,加剧了疾病(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)和病毒复制(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)BJx109-infected老鼠。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图5。gydF4y2Ba病毒的复制与BJx109粒细胞减少性和控制小鼠感染后,HKx31 PR8。gydF4y2Ba

5 B6小鼠收到i.n.和ip组治疗与纯化anti-Ly6G (1 a8,条纹酒吧)病毒感染前24小时,之后每隔一天。相比较而言,感染病毒的小鼠也接受anti-Gr-1 (RB6-8C5,灰色酒吧)抗体和控制小鼠鼠免疫球蛋白(免疫球蛋白、黑人酒吧)。老鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2BaPFU BJx109, HKx31或PR8在第五天小鼠感染后丧生,肺部和传染性病毒在澄清匀浆测定的滴定度标准空斑实验。数据代表的意思是病毒滴定度滴定度±1 SD。的检出限测定由虚线表示。病毒滴定度从治疗小鼠(RB6-8C5或1 a8)显著高于控制(IgG-treated)动物是由* =表示gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* * =gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01(学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618.g005gydF4y2Ba

中性粒细胞严重流感病毒感染期间发挥保护作用gydF4y2Ba

损耗的中性粒细胞与适度增强疾病严重程度和病毒复制小鼠感染高剂量(10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位)的HKx31和PR8 BJx109-infected老鼠(但没有改变疾病gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。这剂高剂量用于允许无毒BJx109建立呼吸道感染。提出了中性粒细胞为肺部病理学,而不是保护,在PR8感染的老鼠gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba。更详细地探讨中性粒细胞的作用,小鼠枯竭的中性粒细胞使用马伯1 a8和感染低剂量(10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位)毒性PR8株(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。在这剂低剂量,粒细胞减少性小鼠体重和死于PR8感染迅速超过控制动物进一步强调中性粒细胞在严重流感感染的有益作用。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图6。gydF4y2Ba中性粒细胞在严重流感感染的老鼠发挥有益的作用。gydF4y2Ba

(一)组5 B6小鼠接受净化anti-Ly6G (1 a8)或鼠免疫球蛋白(免疫球蛋白)抗体病毒感染前24小时,之后每隔一天。数据显示,减肥对小鼠感染10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位PR8。(B)组5 B6或B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠感染10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位的HKx31天5和9感染后,老鼠死亡,落下帷幕。从感染病毒的小鼠显示BAL中性粒细胞的数量。中性粒细胞通过微分项和Diff快速染色,确定所述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。* =从B6.RAG-2γc中性粒细胞数量gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠从B6小鼠相比明显高于数字(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,单向方差分析)。(C)免疫活性的B6小鼠(上层板)或B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠(较低的面板)处理净化anti-Ly6G抗体(1 a8) (i)在天−1 + 1 + 3 + 5 + 7 + 9 + 11(连续治疗,左面板),或(ii)天+ 5 + 7 + 9 + 11(后期治疗,右面板)相对于感染10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位的HKx31天0。控制老鼠接受类似治疗政权鼠免疫球蛋白(免疫球蛋白)。箭头表示的老鼠接受mAb 1 a8或控制老鼠免疫球蛋白。老鼠体重每天和结果表示为每组的平均体重变化百分比(±SEM),相比原来的体重。动物失去了≥25%的原始体重和/或提供的证据肺炎被安乐死。数据显示来自一个实验中,代表两个独立的实验。虚线表示天减肥引起的治疗(A / C)马伯1 a8在统计学上不同IgG-treated控制(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017618.g006gydF4y2Ba

B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠缺乏B、T、NK和NKT细胞gydF4y2Ba[22]gydF4y2Ba因此缺乏天然免疫与适应性免疫的多个组件。在缺乏免疫力的多个介质,我们假设中性粒细胞的作用在流感病毒感染可能是更有效地学习。免疫活性的B6动物相比,B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠极易受到感染的低剂量HKx31 (10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位)和所有老鼠达到扑杀的人道的端点第十天感染后(数据没有显示)。我们确定航空公司的中性粒细胞数量HKx31-infected B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠在每天5和9感染后这些跨度为轻微和严重疾病的相关发展,分别。航空公司的低数量的中性粒细胞恢复B6小鼠在时间点(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。相比之下,中性粒细胞数量从B6.RAG-2γc落下帷幕gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠∼5∼200倍高于B6小鼠在5和9天,分别和白天9∼80%的BAL细胞中性粒细胞。BAL中性粒细胞从B6.RAG-2γc中恢复过来gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba感染10gydF4y2Ba2gydF4y2BaPFU HKx31的6 - 8倍的数字从B6小鼠感染10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba空斑形成单位PR8 (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。注意,类似的数字矿山中性粒细胞中恢复了天真的B6和B6.RAG-2γc的肺gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠(数据未显示)。gydF4y2Ba

过度或中性粒细胞招募特异表达提出了促进炎性肺损伤gydF4y2Ba[23]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba流感病毒感染的病理gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba。考虑到大量中性粒细胞涌入B6.RAG-2γc的航空公司gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠,我们假设在这些条件下中性粒细胞可能有助于病理和疾病。因此,免疫活性的B6小鼠和B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠感染10gydF4y2Ba2gydF4y2BaPFU HKx31和对待马伯1 a8或免疫球蛋白在天(我)−1 + 1 + 3 + 5 + 7 + 9 + 11(“连续治疗”),或(ii) + 5 + 7 + 9 + 11相对于感染(后期治疗)。与我们之前的结果一致gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba,开始治疗HKx31-infected B6小鼠马伯1 a8早期感染后(“连续治疗”)导致快速减肥和死亡(gydF4y2Ba图6 cigydF4y2Ba,上半部分)而“晚期治疗”没有影响的疾病(gydF4y2Ba图6 ciigydF4y2Ba,上半部分)。相比之下,两个连续的(gydF4y2Ba图6 bigydF4y2Ba、较低的面板)和晚期治疗(gydF4y2Ba图6 cigydF4y2Ba,B6.RAG-2γc的上半部分)gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠马伯1 a8与加速减肥和有关疾病HKx31-infected老鼠。在一起,这些数据表明,大量中性粒细胞的航空HKx31-infected B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠不是导致疾病严重程度的主要因素。相反,大量的气道中性粒细胞中发挥有益的作用限制疾病严重程度和延迟死亡。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

当前的研究有助于我们理解一些重要的见解关于中性粒细胞的作用在流感感染的老鼠。但有一个例外gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba,先前的研究已经使用马伯RB6-8C5地址中性粒细胞的作用在流感病毒感染的小鼠模型gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[8]gydF4y2Ba。相比我们有结果后治疗小鼠马伯1 a8 (anti-Ly6G,具体为中性粒细胞)或马伯RB6-8C5 (anti-Ly6G / C或anti-Gr-1,表达的一系列附加白细胞子集)和报告Ly6G的损耗gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与Gr-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞在小鼠体内可以关联到不同的结果对病毒复制和疾病。此外,我们的研究定义中性粒细胞的作用与病毒株感染小鼠后已知引起轻微、中间或严重疾病的老鼠。最后,我们使用病毒感染免疫缺陷小鼠和马伯1 a8证明过度的条件下航空公司招聘,中性粒细胞仍然发挥保护而不是病理作用。gydF4y2Ba

应变PR8高度适应小鼠肺癌和引起间质性肺炎的增长gydF4y2Ba[25]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[26]gydF4y2Ba,类似于人类病毒性肺炎病例观察。提出了多种因素导致PR8的毒性,包括其高增长的能力,一个函数的内部基因导致代其使用高产重组菌株与疫苗的潜力gydF4y2Ba[27]gydF4y2Ba。BJx109 HKx31和PR8病毒共享内部组件来自PR8株但是不同的能力显著诱导疾病后鼻内接种的老鼠(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba),发现归因于特定HA和/或NA每个病毒株的糖蛋白。BJx109的鉴别能力,HKx31 PR8复制小鼠和诱发疾病(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba),招募中性粒细胞上下航空公司(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)和特定的角色,中性粒细胞在控制复制和疾病(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)可以与不同的血凝素和神经氨酸酶的表达糖蛋白的每个所使用的病毒株。gydF4y2Ba

BJx109复制不佳,不诱导小鼠的减肥或疾病(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)和HA BJx109高度糖基化的,使其敏感组件先天免疫系统的破坏,包括collectinsgydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba和气道巨噬细胞gydF4y2Ba[30]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[31]gydF4y2Ba。在先前的研究中,我们已经表明,当特定组件的先天免疫枯竭(如气道巨噬细胞)gydF4y2Ba[16]gydF4y2Ba或阻塞(如鼻内治疗的小鼠与甘露聚糖块lectin-mediated防御)gydF4y2Ba[32]gydF4y2Ba,BJx109复制高水平和能导致严重疾病和死亡的老鼠。相比之下,具体损耗的中性粒细胞通过马伯1 a8治疗没有提高BJx109毒性B6小鼠,这表明替代免疫防御足以包含和明确的感染。鼻内感染B6。抹布或B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠10gydF4y2Ba5gydF4y2BaPFU BJx109不引起体重或疾病和BJx109-infected B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠接受马伯1 a8没有显示增强的发病率(MT和公关,未发表的观察)。马伯RB6-8C5我们的发现,但没有马伯1 a8,诱导BJx109-infected小鼠体重和增加病毒复制,将符合最近的发现Gr-1调节巨噬细胞在气道,以及NK细胞,NKT细胞,疾控中心和pDC,在流感病毒感染gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。治疗病毒感染小鼠马伯RB6-8C5因此可能耗尽一系列先天免疫系统的细胞,包括气道巨噬细胞。gydF4y2Ba

中性粒细胞肺病理学涉及的系统,如急性肺损伤(ALI),急性呼吸窘迫综合征(ARDS),感染性休克和哮喘了gydF4y2Ba[23]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba)。先前的研究表明,治疗PR8-infected小鼠超免疫血清上调为中性粒细胞化学引诱物MIP-2改善肺部病理学在不影响病毒的复制,导致降低发病率和死亡率gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba,符合中性粒细胞的作用在推动肺部病理学与严重疾病有关。大量的中性粒细胞也招募了小鼠的肺部感染致病的H1N1病毒和H5N1流感病毒gydF4y2Ba[2]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba,但Gr-1枯竭gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,包括中性粒细胞(使用马伯RB6-8C5单独或结合clodronate-loaded脂质体耗尽气道巨噬细胞)与加剧了经济增长和传播高致病性病毒重组表达的1918年大流感病毒的血凝素和神经氨酸酶gydF4y2Ba[3]gydF4y2Ba。尽管进步积累的中性粒细胞在气道感染mouse-adapted PR8 (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba),neutrophil-depleted老鼠被迅速超过控件(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。感染免疫缺陷B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠低剂量(10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位)HKx31also诱导大量中性粒细胞招募航空公司(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)然而,中性粒细胞减少感染的后期(即从第五天开始)并没有改善疾病(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。因此,本文提供的数据支持了这样的观点,即中性粒细胞在保护中发挥作用,而不是导致病理与严重疾病有关。之前的研究使用马伯RB6-8C5评估严重流感感染时中性粒细胞的作用,而我们的研究利用Ly6G-specific马伯1 a8。gydF4y2Ba

孵化的人类中性粒细胞与流感病毒与细胞内检测的特异蛋白质gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[34]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[35]gydF4y2Ba然而,感染效率很低gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba。此外,immunohistological本地化的H5N1病毒蛋白质在人类中性粒细胞的胞浆和核中性粒细胞的提议可能作为病毒运输车辆在致命的流感病毒的感染和传播gydF4y2Ba[34]gydF4y2Ba。在小鼠模型中,先前的研究已经表明,酪蛋白或glycogen-induced腹膜中性粒细胞不支持高效的病毒复制gydF4y2Ba[6]gydF4y2Ba。相比,我们有毒性的能力和无毒病毒株感染和复制在纯化骨骨髓来源从天真B6小鼠中性粒细胞。与以前的研究一致gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba、放大的传染性后代中没有检测到细胞上清液接触BJx109后24小时,HKx31或PR8。细胞内NP并不使用流式细胞仪检测(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)和病毒mRNA水平和vRNA低相比,小鼠LA-4上皮细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。兴趣,vRNA水平明显高于信使rna,与先前的报道一致,中性粒细胞吞噬吸收调停的流感病毒gydF4y2Ba[6]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[36]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

总之,我们已经使用Ly6G抗体介入损耗gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞研究的角色在流感病毒感染小鼠中性粒细胞。我们证明中性粒细胞参与限制疾病严重感染后的老鼠污渍的中间(HKx31;H3N2)和高毒性(PR8;H1N1流感而不是用无毒BJx109控制感染的关键。先前的研究已经表明,压倒性的或中性粒细胞在炎症反应可能导致肺损伤特异表达条件,然而大嗜中性粒细胞与严重感染(例如PR8涌入B6小鼠或HKx31 B6.RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠)提供了一个有益的而不是有害的影响。获得与数据使用马伯1 a8, BJx109-infected老鼠马伯RB6-8C5显示增强的疾病严重程度和治疗呼吸道病毒复制。在一起,这些证明中性粒细胞可以调制流感疾病中扮演不同的角色取决于特定菌株的毒力检测。此外,我们的数据确认相关的限制使用马伯RB6-8C5定义中性粒细胞的作用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在炎症和感染。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

老鼠和病毒gydF4y2Ba

C57BL / 6 (B6)小鼠和RAG-2常见伽马chain-deficient B6背景(B6小鼠。RAG-2γcgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)培育和安置在特定的无菌条件的微生物学和免疫学,澳大利亚墨尔本大学。男性6 - 10周大的老鼠在所有实验中使用。本研究中使用的甲型流感病毒株/公关/ 8/34 (PR8, H1N1流感,以及BJx109 (H3N2)和HKx31 (H3N2),这是高收益的表面糖蛋白重组的PR8熊/北京/ 353/89 (H3N2)和/爱知/ 2/68 (H3N2),分别。病毒生长在10天受孕的母鸡的蛋标准程序和滴定Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)所描述gydF4y2Ba[37]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

感染和治疗的老鼠gydF4y2Ba

总呼吸道感染,老鼠和异氟烷麻醉,感染10gydF4y2Ba5gydF4y2BaPFU BJx109, HKx31或PR8通过鼻内(i.n)路线在50µl磷酸缓冲盐(PBS)。在一些实验中,小鼠接种10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位HKx31。老鼠体重每天为视觉和评估缺乏临床疾病包括活动的迹象,折边的皮毛,缓慢的呼吸和缩行为。动物失去了≥25%的原始体重和/或显示肺炎被安乐死的证据。所有程序依法进行了墨尔本大学动物实验伦理的方针、政策和制度伦理委员会批准(ID 0911208.1通过生物化学与分子生物学、牙科科学、医学(RMH)和微生物学与免疫学委员会)。在不同时期感染后,小鼠安乐死和肺部和鼻腔组织被移除,看在PBS和离心澄清。传染性病毒的滴定度组织匀浆测定标准空斑实验MDCK细胞胰蛋白酶的存在。gydF4y2Ba

Ly6G耗竭gydF4y2Ba高gydF4y2Ba中性粒细胞或Gr-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba白细胞gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,老鼠被纯化anti-Gr-1 (Ly6G和Ly6C RB6-8C5)或anti-Ly6G鼠马伯(1 a8,礼物教授托马斯•马列部微生物学和免疫学,迈阿密大学,佛罗里达,美国),分别。腹腔内(i.p。在0.2毫升)和鼻内0.5毫克(i.n。0.2 mg 0.05毫升)路线被用来获得> 90%损耗血液中的中性粒细胞以及> 90%损耗在流感病毒感染小鼠的航空公司,如前所述gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。小鼠治疗感染和前24小时每48小时之后,除非另有说明。控制动物收到类似的剂量的净化整个鼠免疫球蛋白(杰克逊实验室、美国)。消耗血液中的中性粒细胞IgG-treated控制老鼠相比(> 95%)和航空公司(> 80%相比IgG-treated控制)证实了微分白细胞计数(数据未显示)。gydF4y2Ba

恢复小鼠的白细胞gydF4y2Ba

支气管肺泡灌洗(BAL)细胞和鼻组织细胞(鼻腔和鼻甲骨)得到描述gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba。获取单个细胞悬浮液,鼻组织切碎用剪刀,孵化30分钟37°C 2毫克/毫升胶原酶(罗氏诊断、德国)和通过钢丝网。样本Tris-NH对待gydF4y2Ba4gydF4y2BaCl NH(0.14米gydF4y2Ba4gydF4y2BaCl 17毫米三,调整pH值7.2)溶解红细胞和洗RPMI 1640中补充10% FCS (RFgydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。细胞数量和细胞生存能力评估通过台盼蓝排斥使用血细胞计数器。gydF4y2Ba

微分白细胞计数和流式细胞术gydF4y2Ba

BAL和血液样本分析微分白细胞计数所描述gydF4y2Ba[4]gydF4y2Ba。流式细胞术分析,单个细胞悬浮液落下帷幕,准备从肺部和鼻腔组织与上层的冰上孵化20分钟从2.4杂种细胞g2阻止Fc受体,然后沾的适当组合异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE), allophycocyanin (APC)或生物素化的单克隆抗体Gr-1 (RB6-8C5)或CD45.2 (104)。可行的细胞进行分析的propidium碘(π;10µg /毫升)每个样本和细胞流式细胞仪上分析了石中剑流式细胞分析仪。最少50000πgydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞被收集。白细胞数量排序使用MoFlo细胞分选仪(DakoCytomation、丹麦)。gydF4y2Ba

检测中性粒细胞化学引诱物落下帷幕上层清液gydF4y2Ba

BAL上层清液从天真和病毒感染小鼠评估水平的MIP-1α(CCL3) MIP-2 (CXCL2)和KC(处于)使用ELISA试剂盒(研发系统、美国)根据制造商的指示。化学引诱物浓度计算从标准曲线和表达为pg / mL。gydF4y2Ba

从骨髓净化的中性粒细胞gydF4y2Ba

成熟的中性粒细胞从B6小鼠的骨髓净化本·克罗克博士沃尔特和伊莱扎霍尔医学研究所的,墨尔本,澳大利亚,改编自Boxio使用方法gydF4y2Ba等gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba。简而言之,骨髓细胞分离使用的3 - layer梯度1.110 g / ml, 1.090 g / ml,和1.083 g / ml Percoll + (Amersham、瑞典)。Percoll层由稀释100% Percoll(9份Percoll + 1份10×哈佛商学院,pH值7.1)与哈佛商学院。离心后(1500gydF4y2BaggydF4y2Ba,30分钟,没有刹车),中性粒细胞收集从1.110克/毫升1.090 g / ml接口。污染物通过孵化与生物素化的进一步丰富anti-B220 anti-Ter119抗体,随后添加streptavidin-labelled Dynabeads(美国表达载体)。细胞被台盼蓝排斥和纯度> 99%的评估微分项cytospin准备沾Diff-Quick(琥珀科学、澳大利亚)。gydF4y2Ba

流感病毒感染的小鼠细胞并使用流式细胞仪检测病毒抗原gydF4y2Ba

检测细胞内的病毒核蛋白(NP), 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba纯化骨髓成熟中性粒细胞(如上所述)准备或LA-4细胞(小鼠气道上皮细胞线)与媒体mock-infected单独或感染10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba流感病毒空斑形成单位在悬架为1小时37°C。细胞被洗和孵化为8小时37°C。细胞被固定为80% (v / v)丙酮和马伯MP3.10G2孵化。IC7,具体的核蛋白(NP)的A型流感病毒(世卫组织流感参考和研究合作中心),其次是FITC-conjugated羊anti-mouse搞笑(西勒诺斯、澳大利亚)0.2%皂苷的存在。水平的细胞内病毒NP决心使用流式细胞仪。gydF4y2Ba

定量rt - pcr(存在)流感病毒基因gydF4y2Ba

10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba纯化骨髓成熟中性粒细胞(准备如上所述)和LA-4细胞孵育10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba流感病毒空斑形成单位在悬架为1小时37°C。细胞被洗和孵化为8小时37°C。从细胞中提取RNA是颗粒使用RNeasy迷你包(美国试剂盒)根据制造商的指示和储存在−70°C。水平的病毒RNA (vRNA)和病毒信使核糖核酸(mRNA)聚合酶亚基(PA)和矩阵(M)基因通过使用TaqMan存在化学测定。反应5µl RNA模板,包含1×TaqMan一步法rt - pcr反应混合液(美国应用生物系统公司),1×MultiScribe和核糖核酸酶抑制剂混合(应用生物系统公司)和0.5µM每个引物和探针的反应总量25µl。检测的负vRNA,正向引物添加到反应混合物首先,和逆转录酶反应是孵化50°C 30分钟。反向引物被添加和定量PCR进行使用以下条件;94°C 15分钟,其次是40变性/周期放大(95°C 30秒,60°C 60秒)。积极意义的检测病毒mRNA,反向引物添加到反应混合物首先其次是底漆。创建一个标准曲线用连续稀释含有目标基因的质粒,检出限1 pg / ml,最低标准包括在分析中。 RNA content in test samples were expressed as pg/ml. The following primer and probe sequences were used: M; Forward:ATG CAA CGG TTC亚美大陆煤层气有限公司TGA苑TgydF4y2Ba反向:gydF4y2BaGTC亚美大陆煤层气有限公司TGC亚美大陆煤层气有限公司ATC CCA ATGgydF4y2Ba调查:gydF4y2BaCAC答TGC公司治理文化AAA TgydF4y2Ba(VIC)和PA;转发:gydF4y2BaACA gg猫GCG AAC TGA CAgydF4y2Ba反向:gydF4y2BaTGG AGC CAC ATC TTC苑AAgydF4y2Ba调查:gydF4y2BaAGC ATT CAA GCT GGA标签gydF4y2Ba(VIC)。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

比较两组的值,一个学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba使用测试(双尾,两个示例等于方差)。比较三个或更多套值时,单向方差分析测试应用的图基测试后紧随其后。一个gydF4y2BapgydF4y2Ba值≤0.05,对于所有的测试被认为是显著的利用。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们要感谢艾琳真实性和史蒂文洛克曼(CSL有限,Parkville,维多利亚,澳大利亚)的援助中存在。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

构思和设计实验:联合化疗AGB PCR。进行了实验:联合化疗LJI PCR BC。该报写道:PCR联合化疗1 AGB。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

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