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研究文章

流感病毒非结构蛋白1 (NS1)干扰干扰素信号

流感病毒非结构蛋白1 (NS1)干扰干扰素信号

  • Danlin贾,
  • Ramtin拉赫巴尔,
  • 陈颖颖，
  • Suki M. Y. Lee，
  • 陈家强，
  • 本Xuhao王
  • 达伦·p·贝克,
  • Bing的太阳,
  • J. S.马利克·佩里斯，
  • 约翰•m•尼科尔斯
公共科学图书馆
x

摘要

I型干扰素（IFNS）用作通过调节细胞生长，建立抗病毒状态并影响各种免疫细胞的激活来抵抗病毒感染的第一道防线。甲型流感的病毒已经开发出逃避这种防御机制的机制，并且在用流感病毒感染期间，由病毒基因组编码的非结构蛋白1（NS1）抑制IFNS-α/β的诱导。在这里，我们表明，HeLa细胞中的禽H5N1 NS1的表达导致IFN信令中的块。H5N1 NS1减少了IFN-诱导型酪氨酸磷酸化STAT1，STAT2和Stat3，并抑制磷酸盐-TAT2的核转位和IFN诱导的STAT1：1-，STAT1：3-和STAT3：3-DNA复合物的形成。通过NS1在HeLa细胞中对IFN诱导统计信号的抑制部分是NS1介导的IFN受体亚基表达的结果，IFNAR1。为了支持这种NS1介导的抑制作用，我们观察到表达的表达ifnar1在体外感染H5N1和H1N1病毒的人类非肿瘤肺组织。此外，H1N1和H5N1病毒感染人单核细胞来源的巨噬细胞导致抑制两者ifnar1和ifnar2表达式。此外，NS1的表达可诱导JAK/STAT抑制剂SOCS1和SOCS3的上调。相比之下，处理体外含有IFN-α的人肺组织可导致许多IFN刺激基因的上调，并抑制H5N1和H1N1病毒的复制。数据表明，NS1可以直接干扰干扰素信号，以增强病毒复制，但使用干扰素治疗仍然可以克服这些抑制作用，阻止H5N1和H1N1病毒感染。

引用:Jia D, Rahbar R, Chan RWY, Lee SMY, Chan MCW, Wang BX, et al.(2010)流感病毒非结构蛋白1 (NS1)干扰干扰素信号通路。PLoS ONE 5(11): e13927。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927

编辑：张林琪，清华大学，中国

收到:2010年6月29日;接受:2010年10月18日;发表:2010年11月10日,

版权:©2010 Jia等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

资助:这些研究得到了加拿大卫生研究所赠款(mopo -15094)和加拿大公共卫生局给E.N.F的赠款、给j.m.n的传染病控制研究基金赠款(10090202)和给R.W.Y.C的资金的支持。获大学教育资助委员会卓越学科领域计划(中国香港特别行政区卓越学科领域/M-12/-06)授予M.C.W.C.及j.s.m.m.p。D.J.和R.R.是加拿大健康研究所奖学金的获得者。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。D.P.B.受雇于百健艾迪，因此百健艾迪确实在提供ifn beta和对手稿的审查和编辑中发挥了作用。

利益冲突:Darren P. Baker受雇于Biogen Idec。百健艾迪没有为这些研究提供资金，也没有参与研究设计、数据分析或与手稿准备或提交相关的任何决定。百健艾迪免费为这些研究提供干扰素。因此，与达伦·p·贝克(以及百健艾德克)的关系不会影响遵守《公共科学图书馆·综合》关于共享数据和材料的所有政策。

介绍

IFNs-α/β的转录激活在细胞模式识别受体检测到病毒来源的因子时迅速启动［1］．IFNs-α/β随后结合同源细胞表面受体，导致受体相关激酶Jak1和Tyk2的激活[2]．信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白被招募到受体中，被这些Jaks磷酸化在酪氨酸残基上，然后从受体释放形成转录因子复合物，转运到细胞核并上调ifn刺激基因(ISG)的表达。IFN信号可被细胞因子信号抑制家族成员负调控。SOCS1已被证明通过与Jak1的直接物理结合来阻断IFN信号，而SOCS3和CIS可以与磷酸化受体相互作用，以阻止下游介质(如STAT蛋白)的招募和磷酸化[2]．

鉴于IFN -α/β作为抵御感染的第一道防线的关键作用，许多病毒进化出阻断IFN反应的策略以提高复制效率也就不足为奇了[2],[3]．病毒介导的干扰素抑制可以概括为三类，包括干扰素诱导中断、干扰素诱导信号中断和干扰素介导效应功能中断。

甲型流感病毒的非结构蛋白1 (non-structural protein 1, NS1)主要通过干扰IFN的产生来抑制IFN[4]NS1通过首先抑制在甲型流感病毒感染期间检测ssRNA中起关键作用的细胞内传感器RIG-I来干扰干扰素的诱导［5］．钻机I激活导致与下游适配器IPS-1相关联，导致IRF3的磷酸化和IFN-β的后续转录激活［5］,［6］．实验证据表明，NS1可以与RIG-I以及RIG-I激活所需的泛素连接酶TRIM25结合，以阻止其下游IFN-β启动子的激活［7］,[8］．在NS1存在的情况下，IRF3易位和NFκB活化都受到了损害，而NS1反过来又阻止了促炎细胞因子和ifn的诱导［9］,［10]．此外，NS1可以分别与U6 snRNA和裂解聚腺苷酸特异性因子30 (CPSF30)相互作用，干扰宿主mRNA的剪接和聚腺苷酸修饰。值得注意的是，除了抑制IFN-β基因转录外，NS1还促进IFN-β pre-mRNA转录本的积累[11]．

通过用推定的SH2结合结构域与调节亚基相互作用，NS1可以通过与调节亚基相互作用来激活磷酸阳性3-激酶（PI3K）。NS1的PI3K激活导致AKT的下游活化，延迟流感病毒感染细胞的凋亡[12],［13］．鉴于NS1已被证明可以调节细胞内信号事件并抑制IFN的诱导，我们进行了实验，以确定禽流感H5N1流感NS1是否也可以影响IFN-α/β诱导信号的各个方面。此外，随着越来越多的A型流感病毒，包括高致病性禽流感H5N1毒株和正在传播的猪源H1N1大流行毒株(S-OIV, H1N1pdm)对抗病毒药物奥司他韦和/或金刚烷衍生物产生耐药性，迫切需要替代抗病毒疗法［14］,[15],［16］．因此，我们利用一种新的人类非肿瘤肺组织移植模型，研究了合成的IFN-α (IFN alfacon-1)作为对抗H5N1和H1N1流感A感染的抗病毒药物的治疗潜力。

我们提供的证据表明，H5N1 NS1的表达减少了ifn诱导的STAT蛋白磷酸化，并导致下游STAT:DNA复合物的形成减少。我们将这种NS1介导的IFN诱导信号抑制归因于NS1抑制细胞表面IFN受体表达，以及上调信号抑制剂SOCS1和SOCS3的作用。我们提供的证据表明，IFN alfacon-1治疗人类肺组织可以抑制H1N1和H5N1病毒的复制，超过NS1的抑制作用。

材料和方法

细胞和试剂

人宫颈癌细胞系HeLa取自ATCC (Manassas, VA)。细胞在添加10%胎牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素、100µg/mL链霉素(Invitrogen)的Dulbecco's modified Eagle's培养基中培养。质粒pBudCE4.1和pBudCE4.1- h5n1 NS1-HA (A/Duck/湖北/L-1)由Dr. Bing Sun提供。如前所述，产生单核细胞来源的巨噬细胞［17］新鲜肺活检取自香港玛丽医院的肺组织手术切除的非肿瘤肺组织，所有患者均获得书面知情同意，香港大学和医院管理局（香港Western）授予机构批准。机构审查委员会。活检或组织碎片超出临床诊断要求。将每个供体的肺组织切割成多个碎片（2–3 mm）。立即将组织放入培养基（含有L-谷氨酰胺和抗生素的F-12K营养混合物）中，并感染甲型H5N1流感（A/越南/3046/04或A/HK/483/97）或H1N1（A/HK/54/98或A/Ca/04/09（H1N1））病毒收集后三小时内。病毒在37°C下吸附一小时，然后通过在温暖的PBS中清洗组织碎片去除游离病毒。未添加病毒的活组织检查用作对照。活组织检查或组织碎片在37°C下培养指定时间。

人重组IFN alfacon-1 (IFN alfacon-1, specific activity, 6×108.U/mL)由Three Rivers Pharmaceuticals (Pittsburgh, PA)提供。人IFN-β (IFN β-1a，特异性活性，1.2×107.U/mL)由BiogenIdec Inc.， Cambridge, MA提供。p-STAT1、p-STAT2、p-STAT3、STAT1、STAT3、HA、SOCS1、SOCS3抗体购自Cell signaling。抗STAT2和β-actin的抗体从Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)获得。

转染和病毒感染

细胞（2×105.)用Lipofectamine LTX (Invitrogen公司，CA)按照制造商的协议进行转染。简单地说，在转染前24小时将细胞接种在6孔板中。质粒DNA和转染试剂混合于无血清培养基中，室温孵育30分钟。然后将转染复合物轻轻地添加到6孔板的单个孔中。

对于原发性肺组织的甲型流感感染，病毒的滴度为1×107.3TCID50/mL为H5N1, 1×106．4TCID50/mL为A/HK/54/98 H1N1和1×107.TCID50/mL for pandemic A/Ca/04/09 H1N1。人单核细胞来源的巨噬细胞在MOI为2时被A/HK/483/97 H5N1或H1N1感染或模拟感染。

病毒传染性的测量

用TCID测定病毒感染程度50(50%的组织培养感染剂量每毫升)试验。简单地说，在病毒滴定前一天，制备一个融合的96孔MDCK细胞板。然后用PBS洗涤细胞，用含有100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素和2 g/mL TPCK (tosyl磺酰苯丙基氯甲基酮)处理胰蛋白酶的无血清最低必需培养基(MEM)覆盖细胞。将1∶10连续稀释的病毒分四次吸附在平板上。每天观察细胞病变效应。使用Karber方法估计了50%接种井中导致CPE的病毒稀释终点［18］．

免疫印迹和免疫沉淀反应

用30µL的裂解缓冲液(1% Triton X-100, 0.5% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.2 mM苯甲基磺酰氟)裂解细胞。采用Bio-Rad蛋白DC试剂盒(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)测定蛋白浓度。30µg蛋白裂解液/样品在5×样品还原缓冲液中变性，SDS-PAGE分析。分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后用5%牛血清白蛋白(w/v)在TBS-T中室温封闭1小时。用指定的抗体检测细胞膜。使用ECL检测系统(Pierce, Rockford, IL)对蛋白质进行可视化。免疫沉淀试验中，将载体单独或H5N1 NS1质粒转染的细胞置于含10 mM HEPES的低渗裂解缓冲液中，pH 7.4，置于冰上孵育30分钟，然后短暂超声。悬浮液在4°C下14000 rpm离心30分钟。收集上清液，用Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。500µg蛋白与1µg抗stat1抗体、抗stat2抗体或IgG同型对照抗体孵育。 Antibodies were immunoprecipitated with protein A/G-Sepharose beads (Santa Cruz Biotechnology) and washed 6 times with pH 7.4 HEPES buffer. Beads were denatured in 5× sample reducing buffer and resolved by SDS-PAGE.

细胞分选和流式细胞术分析IFNAR1和IFNAR2细胞表面表达

转染24小时后，先用PBS洗涤细胞，然后用Versene孵育15分钟。收集悬浮细胞，1500 rpm离心5分钟。然后在1×10重悬细胞颗粒7.细胞/mL, 2% FCS。5×105.绿色荧光蛋白+分选的细胞与抗人IFNAR1 (BiogenIdec)孵育［19］或抗人IFNAR2抗体(Caltag)，然后是pe标记的抗小鼠IgG抗体。作为同型对照，细胞与pe标记的同型对照IgG抗体孵育(eBioscience)。所有分析均使用FACS Calibur和CellQuest软件进行。细胞门控基于正向和侧向散射。

RNA提取和cDNA合成

使用缓冲液RLT + β-巯基乙醇裂解细胞，Qiagen QIA-shredder柱。根据制造商的协议，使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒进行RNA分离，并进行DNA消化。用RNase-free水洗脱细胞总RNA。采用260 nm (Beckman)紫外分光光度法测定RNA浓度。利用0.5µg RNA、oligo-dT引物和Superscript III逆转录酶根据制造商的协议(Invitrogen公司，CA)合成cdna。

实时聚合酶链反应(RT-PCR)

使用LightCycler®(罗氏)与LightCycler®FastStart DNA Master SYBR Green PLUS I试剂盒(罗氏)进行实时PCR。在20µL体积中加入4µL Master SYBR Green PLUS缓冲液，最终浓度为1X, 5µL 0.1µg/µL cDNA。pcr级水9µL，正反引物20µM各1µL。PCR反应在以下条件下进行:pre-incubation在95°C 10分钟,其次是45放大周期10秒的变性,退火5秒60°C,扩展在72°C 10秒钟,融化在65°C曲线分析15秒和连续采集的95°C模式温度转变速率为0.1°C / s。随后使用RealQuant软件对数据进行分析。pcr采用以下引物:

Ifnar1

(向前)5 ' CACTGACTGTATATTGTGTGAAAGCCAGAG 3 '

（逆转）5 ' CATCTATACTGGAAGAAGGTTTAAGTGATG 3 '

Ifnar2

(向前)5 ' ATTTCCGGTCCATCTTATCAT 3 '

（逆转）5'Actgaacaacgttgtgttcc 3'

甲型流感米基因

(向前)5 ' CTTCTAACCGAGGTCGAAACG 3 '

（逆转）5′GGCATTTGGACAAGCGTCTA 3′

研究小组15

(向前)5 ' TCCTGGTGAGGAATAACAAGGG 3 '

（逆转）5 ' CTCAGCCAGAACAGGTCGTC 3 '

pkr

(向前)5 ' GCCTTTTCATCCAAATGGAATTC 3 '

（逆转）5 ' GAAATCTGTTCTGGGCTCATG 3 '

2 ' 5 ' -美洲国家组织

(向前)5'AGCTTCATGGAGGGGGCA 3'

（逆转）5'aggcctggctgaattacccat 3'

socs1

(向前)5 ' ttgcctgga accatgtgg 3 '

（逆转）5′GGTCTGGCCTCCAGATACAG 3′

socs3

(向前)5 ' GGAGTTCCTGGACCAGTACG 3 '

（逆转）5′TTCTTGTGCTTGCCATGT 3′

β肌动蛋白

(向前)5 'acatggagaaaaatctggcac 3 '

（逆转）5 ' GTAGCACAGCTTCTCCTTAATGT 3 '

电泳迁移迁移试验

如前所述，从未经处理或ifn处理的细胞中提取10µg核蛋白［20］．提取液与1µg poly(dI-dC)poly(dI-dC)在4°C含有60 mM EGTA和5% Ficoll(最终体积30µL)的缓冲液中孵育10分钟。每分钟40000次(cpm)的放射性标签sis-inducible element (5 'AGCTTCATTTCCCGTAAATCCCT加入3’)，室温下再孵育20分钟。以0.5× TBE(最终浓度为45 mM三硼酸盐，1 mM EDTA)作为流动缓冲液，在4.5%聚丙烯酰胺凝胶上解析蛋白质- dna复合物。凝胶干燥并在−80°C下暴露于自动放射线胶片(柯达BioMax MS)过夜。在EMSA之前，通过核提取物与2µg anti-STAT1 (C-136X (batch #s L1004, B0403)， Santa Cruz Biotechnology)或anti-STAT3 (H-190X, Santa Cruz Biotechnology;(9132, Cell Signaling Technology)抗体30分钟后再加入放射性标记的SIE 20分钟。

免疫组化和共聚焦显微镜

用H5N1 NS1质粒转染的细胞如前所述进行染色［21］.使用荧光共轭二级抗体（Alexafluor-488:绿色、Alexafluor-555:红色和Alexafluor-647:蓝色）观察各种蛋白质（英国加的夫阿默森生物科学公司）。使用直立式徕卡SP2共焦激光扫描显微镜收集图像（德国曼海姆徕卡微系统海德堡有限公司）一个100×油浸透镜（1.4数值孔径）和一个4×数字变焦。激光激发分别为488nm（Ar/Kr）和543nm（He/Ne），通过声光传输滤波器分别衰减至10%和50%。使用顺序扫描模式消除检测信号的串扰，这些信号在500至530 nm和560至660 nm之间过滤。图像分辨率为512 dpi乘以512 dpi（12位），线平均（4倍）以0.5µm的间隔收集整个细胞的光学切片。

为了进行流感核蛋白染色，肺组织外植体在10%中性缓冲福尔马林中固定，然后使用小鼠抗流感核蛋白抗体(HB65, EVL Laboratories, The Netherlands)进行石蜡包埋和免疫组化。

结果

H5N1 NS1表达抑制ifn诱导的STAT磷酸化

为了研究H5N1 NS1表达对IFN信号转导的影响，我们分别用含ha标记的H5N1 NS1载体和质粒转染HeLa细胞。转染24小时后，用IFN-β处理细胞(1×103.U/mL)促进ifn诱导信号。与单独转染载体的细胞相比，在表达H5N1型NS1的细胞中，ifn诱导的STAT1、STAT2和STAT3磷酸化显著减少(图1A）.转染H5N1 NS1的人肺上皮细胞A549细胞同样显示IFN-β诱导的STAT1磷酸化水平下降(数据未显示)。

缩略图
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图1所示。H5N1 NS1表达抑制IFN诱导的STAT磷酸化。

A.)单独转染载体的HeLa细胞()或ha标记的NS1质粒(▪)未处理(−)或IFN-β (1×103 U/mL)处理(+)15分钟，24小时后。收集细胞，用SDS-PAGE解析裂解液，用抗磷酸化stat1、抗磷酸化stat2、抗磷酸化stat3和抗ha (NS1)抗体进行免疫印迹。以抗stat1、抗stat2、抗stat3和抗β-微管蛋白抗体作为负载对照，剥离膜并重新探针。磷酸化STAT蛋白的相对诱导倍数是通过磷酸化STAT的信号强度超过总STAT，并与未经处理的载体转染的细胞归一化。这些数据图代表了三个独立的实验。B)转染了ha标记NS1质粒的HeLa细胞用IFN-β处理(1×103.U/mL) 15分钟。然后将细胞固定并进行HA(红色)和phospho-STAT2(蓝色)染色，并通过共聚焦显微镜分析，如前所述材料和方法．白色箭头表示ns1的细胞核优势，中间虚线表示显示磷酸化stat2降低的细胞核。数据代表了两个独立的实验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g001

为了证实ifn诱导的STAT磷酸化抑制是NS1表达的结果，在一系列相同的转染实验中，使用抗磷酸化stat2和抗ha (NS1)抗体对细胞进行固定和染色。共聚焦显微镜显示，与缺乏H5N1 NS1表达的细胞相比，在其细胞核中表现出强烈的ifn诱导的磷酸化- stat2染色，在H5N1 NS1表达的细胞中ifn诱导的磷酸化- stat2染色显著减少(图1B）.

NS1抑制ifn诱导的STAT-DNA结合

STAT蛋白一旦被磷酸化激活，就会形成功能性的homo-或异二聚体复合物，迁移到细胞核并靶向特定启动子元件，启动转录激活。为了研究H5N1 ns1介导的ifn诱导STAT磷酸化抑制的功能后果，我们使用电泳迁移位移法(EMSA)研究STAT- dna结合。用空载体或含有编码H5N1 NS1的cDNA的载体转染HeLa细胞24小时，然后不处理细胞或用IFN-β处理细胞。核提取物与放射性标记的sis-inducible element (SIE)孵育，然后琼脂糖凝胶电泳确定ifn诱导的STAT:SIE复合物的形成。与空载体转染的细胞相比，我们观察到在H5N1型NS1蛋白(图2）.进一步支持NS1介导的ifn诱导的STAT磷酸化的功能结果，NS1对ifn诱导的STAT2激活的影响是明显的，即减少了核磷酸化的STAT2图1B．

缩略图
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图2。H5N1 NS1的表达抑制ifn诱导的STAT:SIE复合物的形成。

A.单独转染载体或ha标记NS1质粒的HeLa细胞未处理(-)或IFN-β处理(+)(1×103.U / ml）15分钟，24小时转染后。将核提取物分离，孵育等量的蛋白质32p标记的筛子探头。配合物通过天然凝胶电泳分解，并通过放射自显影显示。数据代表了两个独立的实验。用IFN-β（1×10）处理HeLa细胞3.U/mL) 15分钟。核提取物分离，等量蛋白孵育32p标记的SIE探针存在或不存在2µg的抗stat1和抗stat3抗体，如图所示。配合物通过天然凝胶电泳分解，并通过放射自显影显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g002

H5N1和H1N1感染影响IFNAR的表达

考虑到NS1对IFN诱导的STATs激活的影响，我们接下来研究了NS1表达对参与IFN信号传导的上游分子，即受体IFNAR1和IFNAR2的影响。用表达GFP的载体或同时表达NS1和GFP的质粒转染HeLa细胞。转染24小时后流式细胞术对gfp阳性细胞进行分选，流式细胞术检测IFNAR1和IFNAR2表面表达情况。与单独表达载体的细胞相比，表达H5N1 NS1的细胞表面IFNAR1水平降低(图3一）.值得注意的是，细胞表面IFNAR2的表达不受NS1表达的影响。在随后的一系列实验中，我们证实了细胞表面IFNAR1表达的减少仅限于表达NS1的细胞(图3 b）.确定微分的表面表达IFNAR1和IFNAR2 H5N1病毒NS1的存在是监管的结果在mRNA水平,海拉细胞转染vector-GFP或上述NS1-GFP质粒,和GFP-positive细胞流式细胞仪排序后24小时为后续RNA转染分析。Ifnar1和ifnar2RT-PCR分析基因表达。与载体- gfp转染的细胞相比，我们观察到细胞中ifnar1但不是ifnar2H5N1 NS1病毒转染细胞的基因表达(图3 c）.

缩略图
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图3。H5N1 NS1减少表面IFNAR1但IFNAR2的表达。

A.)分别用GFP载体(绿色)和含有ha标记NS1的GFP载体(红色)转染HeLa细胞，转染24小时后，对GFP阳性细胞进行流式细胞仪(FACS)分选，并对IFNAR1或IFNAR2染色，进行流式细胞仪分析。数据代表了三个独立的实验。BHeLa细胞转染HA标记的NS1质粒，转染24小时后固定并染色HA(绿色)和IFNAR1(红色;上面板)或IFNAR2(红色;下图)，并用共聚焦显微镜进行分析。数据代表了两个独立的实验。C)单独转染GFP载体()或含有ha标记NS1的GFP载体(▪)。转染后24小时，GFP阳性细胞是对分类，RNA提取的RNA和CDNA合成。Ifnar1,ifnar2和β-actin基因表达情况采用RT-PCR分析。计算基因表达相对于β-肌动蛋白基因表达，并将其归一化到单独转染GFP载体的细胞中。数据代表了两个独立的实验。学生t检验(p<0.05)，差异有显著性(星号)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g003

在肺内，肺细胞和巨噬细胞都是H5N1和H1N1感染的目标。因此，在接下来的一系列实验中，我们使用人类单核细胞来源的巨噬细胞来检测H5N1和H1N1病毒感染对IFNAR表达的影响。我们发现ifnar1和IFNAR.与模拟感染相比，2例在对H1N1和H5N1病毒的反应中在6小时内上调(图4 a, B)，但到了24小时，两者都减少了ifnar1和ifnar2与模拟感染相比(图4 c），

缩略图
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图4。流感病毒感染减少ifnar1和ifnar2人单核细胞来源的巨噬细胞感染后24小时的表达体外肺组织。

用A/HK/483/97 H5N1或A/HK/54/98 H1N1病毒感染人单核细胞来源的巨噬细胞(Multiplicity of Infection, MOI) = 2。从细胞中提取RNAA.3)人力资源,B) 6小时C)感染后24小时。在cDNA合成之后，ifnar1(▪)和ifnar2()表达的实时荧光定量PCR检测。数据显示，在每个样品中对β-肌动蛋白进行归一化后，相对于模拟感染对照的基因表达是折叠诱导的。显示了具有代表性的重复实验的三次测定方法的数据;D)人类肺组织被模拟感染(PBS)或被A/HK/483/97 H5N1或A/HK/54/98甲型H1N1流感病毒感染，如所述材料与方法．将感染后18小时的组织进行RNA提取。合成cDNA并表达ifnar1,ifnar2和β肌动蛋白RT-PCR检测基因表达。计算基因表达相对于β肌动蛋白基因表达并标准化以模拟感染组织。数据代表了两个独立的实验。学生t检验(p<0.05)，差异有显著性(星号)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g004

研究两者是否有抑制作用ifnar1或ifnar2在完整的肺中发生A型流感感染的情况下，人类肺移植组织被H1N1或H5N1 A型流感病毒感染。感染18小时后采集RNA进行分析。两种病毒的感染导致选择性的减少ifnar1与模拟感染的对照组织相比，基因表达(图4 d）.值得注意的是，H5N1流感A毒株的感染导致了更大的减少ifnar1基因表达与H1N1病毒感染相比。H1N1和H5N1感染的适度抑制作用ifnar2基因表达无统计学意义。

H5N1和H1N1调节SOCS的表达

为了确定H5N1型NS1对I型IFN信号的负调控因子即SOCS蛋白的影响，将含有H5N1的质粒转染HeLa细胞NS1基因和转染24小时后提取的蛋白进行处理，分析SOCS1和SOCS3蛋白表达情况。与单独转染载体的细胞相比，我们观察到表达H5N1的细胞中SOCS1蛋白增加，而SOCS3蛋白没有增加NS1(图5一个）.有趣的是，当我们检测socs1和socs3在共同表达GFP和NS1的细胞中，我们观察到两者都增加了两倍socs1和socs3基因表达与单独表达GFP的控制细胞相比(图5 b）.此外，RT-PCR对感染的人肺组织外植体的分析表明，两者均有一定的相关性socs1和socs3通过H5N1感染来上调基因表达，而仅限socs1通过H1N1感染增加基因表达（图5 c）.

缩略图
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图5。NS1调控SOCS1和SOCS3的表达。

A.)用载体或ha标记的NS1质粒转染HeLa细胞，转染24小时后收获细胞，裂解液用SDS-PAGE裂解，用抗socs1和抗socs3抗体进行免疫印迹。用抗ha抗体检测细胞膜以确定NS1的表达，用抗微管蛋白抗体作为负载对照。通过信号强度超载计算蛋白质的相对折叠诱导，并针对载体转染细胞(SOCS1)进行归一化, SOCS3▪)。数据代表了两个独立的实验。B)单独转染GFP载体()或含有ha标记NS1的GFP载体(▪)。转染24小时后，GFP+细胞分选，提取RNA，合成cDNA。基因表达的socs1(），socs3(▪)和β肌动蛋白RT-PCR分析基因表达。计算基因表达相对于β-肌动蛋白基因表达，并将其归一化到单独转染GFP载体的细胞中。数据代表了两个独立的实验。CA/HK/54/98 H1N1或H5N1 A型流感病毒感染人肺组织18小时后采集RNA。合成cDNA并表达socs1(▪),socs3(▪)和β肌动蛋白RT-PCR检测基因表达。计算相对于β-肌动蛋白基因表达的基因表达，并将其归一化以模拟感染细胞。数据代表了两个独立的实验。学生t检验(p<0.05)，差异有显著性(星号)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g005

干扰素治疗可上调干扰素敏感基因并抑制原代人肺细胞中H5N1和H1N1流感病毒的复制

在接下来的一系列实验中，我们使用非肿瘤人肺移植组织，检测了干扰素-α（即干扰素-α-1）对H5N1和H1N1甲型流感感染的影响。在感染H5N1或H1N1甲型流感病毒之前，用干扰素-α-1预处理人肺移植组织16小时。在感染后的不同时间点提取RNA进行cDNA合成。甲型流感病毒的分析米基因表达显示IFN alfacon-1治疗有效抑制H5N1和H1N1流感A复制(图6）.2’5’-基因表达分析美洲国家组织,pkr和isg15研究发现，在H5N1或H1N1病毒感染的组织中，ifn刺激基因(ISGs)的表达水平没有上调。然而，它们的表达在H5N1和H1N1病毒感染的人肺组织经IFN alfacon-1治疗后均上调(图6 b）.

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图6。IFN alfacon-1治疗可抑制H5N1和H1N1在原代人肺细胞中的复制并上调ISG表达。

不同的人类外科肺组织外植体(1-6)，要么不处理(♦)，要么用IFN alfacon-1 (1.2×104 U/mL) (n)处理16小时。随后，组织被H5N1(1-4)或H1N1流感病毒(5,6)感染。在感染后不同时间点收集细胞RNA并合成cDNA。基因表达的A.)甲型流感米基因，通过RT-PCR进行检测B) pkr ()， isg15(▪)，2 ' 5 ' -oas ()、β-肌动蛋白(β-肌动蛋白)在感染H5N1或A/HK/54/98 H1N1后18小时进行RT-PCR检测。数据代表了两个独立的实验和标准化模拟感染的对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g006

在最后的一系列实验中，我们检测了IFN alfacon-1对甲型H1N1流感大流行感染的影响，当IFN被病毒攻击后加入。三种不同的人肺外植体感染了h11pdm病毒，感染24小时后用1.2×10治疗4.U /毫升干扰素alfacon-1。在治疗后24和48小时，通过测量干扰素对病毒复制的影响进行评估米基因表达与TCID50值。的结果图7， A组和B组提供了干扰素治疗的保护作用的证据，即使是在TCID评估的感染后50和米基因的表达。这些结果得到了流感a核蛋白表达减少的证据的支持，在ifn处理的肺外植体中可见(图7 c）.

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图7。IFN alfacon-1抑制治疗流感大流行H1N1 2009人肺组织中的病毒复制。

三种不同的人类手术肺组织外植体感染大流行H1N1 2009病毒24小时，然后留下未经处理的（▪）或用IFN Alfacon-1（1.2×104 U / mL）处理（）另外48小时。在指示的时间A.病毒滴度(TCID50） 和B)甲型流感米检测基因表达;学生t检验:* ~ p<0.05;* *∼p < 0.01。C)对未经处理(i)或ifn处理(ii)的感染人肺外植体的薄切片进行A型流感核蛋白染色(粉红色)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013927.g007

讨论

由于对奥司他韦耐药的甲型流感病毒分离株的增加，本研究开始确定NS1对IFN信号的影响，并探索IFN的治疗潜力，以克服任何NS1介导的抑制作用。任何IFN的响应都被一个正反馈环路增强;具体来说，病毒感染产生的IFN与IFNAR结合并激活，导致基因诱导，其中包括IFN。因此，IFN对产生细胞和邻近细胞均有直接和旁分泌作用。先前的研究表明，H5N1能够克服这种反馈回路，而H5N1的NS1与这种耐药性的发展有关［22］．

在此，我们报告了H5N1流感病毒NS1通过抑制IFNAR和SOCS蛋白表达改变IFN-α/β信号通路的新策略。NS1对IFN -α/β的抑制作用很大程度上归因于其抑制IFN诱导的能力。一些病毒已经进化到以STAT蛋白为靶点并阻断干扰素的抗病毒活性:副粘病毒，如SV5和II型人类副流感病毒(HPIV2)通过其V蛋白阻断干扰素信号，通过多聚化诱导STAT1和STAT2的蛋白酶体降解[23]．HCV核心蛋白通过STAT1核心蛋白相互作用和抑制STAT1基因表达来阻断STAT1的激活和随后的功能[24]我们提供证据证明，H5N1流感病毒NS1在HeLa细胞中的表达导致IFN诱导的STAT磷酸化减少(图1）.

STAT1和STAT2的磷酸化依赖激活对于介导ifn诱导的抗病毒反应至关重要[25]．激活的STAT蛋白形成各种复合物，随后易位到细胞核中，通过结合ISGs启动子区域的特定元素来启动基因表达。在没有这些转录效应蛋白的情况下，细胞对干扰素无反应，对病毒感染高度敏感［26］,[27]．在H5N1 NS1存在的情况下，抑制ifn诱导的STATs磷酸化导致特征stat1:SIE、STAT1:3:SIE和STAT3:3:SIE复合物的形成减少(图2）.

这些结果促使我们评估NS1是否可能影响STATs的上游效应体，从而限制其ifn诱导的磷酸化和激活。流式细胞术和共聚焦显微镜对IFNAR1和IFNAR2表面表达的分析显示，在H5N1 NS1存在时，细胞表面IFNAR1表达减少，但IFNAR2表面表达保持不变(图3）.基于NS1抑制宿主mRNA生成的能力，我们检测了NS1对宿主mRNA生成的影响ifnar1和ifnar2基因的表达，并显示出经过最初的，早期的增加ifnar1和ifnar2表达，可能反映了先天细胞反应，两者都有减少ifnar1和ifnar2在单核细胞来源的巨噬细胞表达24小时，但表达更有选择性的减少ifnar1在体外16小时后，一旦病毒复制完全建立(图4）.这种依赖ns1的减少ifnar1基因表达可能是ifn诱导的STAT磷酸化和DNA结合降低的原因。包括IFNAR1、JAK1、TYK2、IRF9和STAT2在内的不同信号效应子的基础表达水平已被证明与IFN应答的强度直接相关［28］．IFNAR1缺失细胞对IFN治疗完全无反应，而没有IFNAR1的小鼠同样对IFNs-α/β无反应，并且对微生物感染高度敏感［29］．临床研究发现，对干扰素治疗无应答或敏感性降低的HCV患者中，任何一种都降低了ifnar1或ifnar2基因表达与IFN应答者相比［30］．启动子区多态性ifnar1和ifnar2与疟疾、多发性硬化症、锥虫病、丙型肝炎和艾滋病毒等多种疾病的易感性密切相关[31],［32］,［33］,[34]．相反，IFNAR1和IFNAR2的过表达，如唐氏综合征患者的情况，21号染色体是三体，导致对IFN的敏感性增强[35]．

虽然H5N1型病毒NS1下调IFNAR1表达的具体机制还有待进一步研究，但NS1会抑制pre-mRNA剪接、聚腺苷化和核输出。NS1与剪接机制的组成部分U6 snRNA相互作用，U6 snRNA与剪接体的其他成分复杂，介导pre-mRNA剪接[11]．NS1和U6 snRNA之间的关联阻碍了它与剪接体的其他催化亚基的复合能力，从而导致前mrna在宿主细胞的细胞核中积累。此外，NS1通过靶向CPSF30和PABII影响宿主mRNA的聚腺苷酸化[36],[37]．mrna的3 '切割和聚腺苷酸化促进其进入细胞质，而单独经历3 '切割的mrna保留在细胞核中[38].综上所述，流感病毒H5N1 NS1对ifnar1基因表达是使靶细胞对IFN不敏感的一种有效机制，并覆盖了单核细胞来源的巨噬细胞中IFNAR上调的最初非特异性抗病毒作用。

IFNs-α/β不仅是先天性免疫应答的重要组成部分，而且在调节适应性免疫应答中发挥重要作用。IFNs-α促进树突状细胞(DCs)的分化和成熟，随后在主要组织相容性复合体(MHC)的背景下呈现病毒肽来激活T细胞。此外，IFNs-α/β可以调节共刺激分子的表达，进一步刺激或启动病毒特异性CD4+和CD8+T细胞。在A型流感病毒感染期间，DCs中NS1的表达阻止了它们的成熟，随后导致T细胞无效激活［39］．NS1在DCs中的表达改变了许多基因的表达，这些基因对成熟和迁移都是必需的，包括ifnar1［39］．

值得注意的是，H5N1流感A毒株的感染导致了更大的减少ifnar1基因表达与H1N1病毒感染相比（图4 c, D)体外肺组织模型。x射线晶体学研究表明，与其他流感毒株的NS1相比，来自高致病性H5N1流感病毒的NS1在rna结合域和效应域上都表现出结构差异。H5N1的NS1可以与自身结合形成一种新的管状低聚体结构，而来自其他菌株的NS1采用二聚体构象[40],[41]．这些构象差异可能导致了不同程度的抑制ifnar1观察到H5N1和H1N1之间的基因表达。

SOCS蛋白是JAK/STAT信号的有效抑制剂。越来越多的证据表明，流感病毒感染也会通过上调SOCS1和/或SOCS3表达抑制IFN应答［42］,[43]. SOCS1通过与JAK1的直接物理相互作用抑制IFN信号，而SOC3和顺式与磷酸化受体相互作用，阻碍下游效应物（如STAT）的募集和磷酸化［44］,［45］．SOCS1和/或SOCS3的过表达将通过抑制STAT磷酸化和诱导ISGs有效降低IFN的反应[46]．许多病毒，包括呼吸道合胞病毒、疱疹病毒和丙型肝炎病毒，通过调节SOCS1的表达来抑制STAT的激活，作为抑制IFN反应的一种方式[47],[48],[49]．我们的数据显示两者都是socs1和socs3在表达H5N1型NS1的HeLa细胞中，基因表达增加，但我们只能检测到SOCS1蛋白表达增加(图5）.SOCS1的表达可由多种细胞因子以组织特异性的方式诱导[50],[51]．包括STAT1和STAT5在内的STAT蛋白被认为在介导的转录激活中发挥作用soc细胞因子刺激下的基因表达[50],[51]．对乳腺癌细胞的研究表明，MAPK信号的中间效应MAPK p38的激活也可能在上调SOCS1表达中发挥作用。在H5N1而不是甲型H1N1流感感染的原代人巨噬细胞中，促炎细胞因子的过度诱导与p38的激活密切相关，提示了诱导SOCS1表达的可能机制[52],[53],［54］．值得注意的是，SOCS1的表达在翻译水平上由真核起始因子4e结合蛋白以帽依赖的方式调控[55]．NS1通过与eIF4G相互作用并激活PI3K通路来影响细胞翻译[12],［13］,[56],[57].PI3K的激活可通过mTOR和随后4E-BP1的磷酸化导致翻译激活，最终导致cap依赖性mRNA翻译的增加[58]．

金刚烷衍生物金刚烷胺和金刚乙胺作为M2离子通道阻滞剂是第一批获准用于甲型流感病毒的抗病毒药物[59]然而，2009年甲型H1N1流感大流行的所有分离株都对金刚烷胺和金刚乙胺具有耐药性［60］．在全球范围内，还有另外两种药物获得了专门治疗和预防流感的许可。乐感清(zanamavir)是在了解流感病毒NA与其底物唾液酸的三维结构的基础上发展起来的[61]．基于乐感清的结构，达菲(奥司他韦)随后被开发出来[62]．乐感沙的生物利用度较差，必须局部给药，通过吸入器给药，吸入器将药物输送到病毒复制的主要部位上呼吸道。用疏水侧链取代甘油侧链使达菲可以口服。达菲以封装形式作为前药服用，由肝脏酯酶激活形成活性药物[63]．虽然2009年H1N1流感大流行病毒对奥司他韦敏感，但在香港、丹麦、日本和加拿大的分离临床病例中发现了耐药性[64]．关于H5N1病毒，大约2%的成人患者和18%的儿童患者感染了耐药性的报告引起了人们的关注[65]．

在豚鼠和雪貂模型中，IFN-α治疗有效地抑制了H1N1和H5N1病毒的复制［22］,[66]，尽管在豚鼠模型中需要多次注射。结合我们为IFN在人类肺移植组织模型中对H1N1和H5N1的抗病毒作用提供的证据，我们推断，尽管NS1使用抑制机制来靶向IFN反应，但IFN治疗可以覆盖这些作用(图6）.值得注意的是，干扰素治疗对H5N1和H1N1甲型流感毒株，包括2009年H1N1流感大流行均有抑制作用。此外，我们提供了干扰素治疗的证据post-challenge用病毒有效地限制病毒复制:当感染h11pdm时，人肺外植体表现出ifn诱导的病毒滴度、M基因和流感核蛋白表达的降低。鉴于干扰素的广谱抗病毒活性不是病原体特异性的，可以避免产生耐药性。因此，在正在进行的研究中，我们正在评估IFN alfacon-1治疗流感样疾病(特别是大流行性H1N1pdm)患者的安全性和治疗潜力。

致谢

E.N.F.是加拿大Tier 1研究主席。作者感谢中华人民共和国上海生物科学研究所徐珂的技术支持。

作者的贡献

设计了DJ JSMP JMN ENF实验。进行实验:DJ RR RWYC SML MCC。分析数据:DJ RR RWYC MCC BXW JSMP JMN ENF。提供试剂/材料/分析工具:DPB BS JMN。论文作者:DJ RR ENF。参与稿件的编辑和不同稿的评审:DPB。为数据解释提供输入:DPB。参与审阅手稿:BS。

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