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研究文章

间充质干细胞(MSC)的新范式:极化炎性MSC1或免疫抑制MSC2表型

  • 露丝·沃特曼,

    联系杜兰大学麻醉学系,新奥尔良,路易斯安那州,美国

    ⨯
  • 苏珊娜l . Tomchuck

    联系微生物学和免疫学、杜兰大学癌症中心,杜兰基因治疗中心杜兰大学,新奥尔良,路易斯安那州,美国

    ⨯
  • 汉高皮膜,莎拉·l .

    联系微生物学和免疫学、杜兰大学癌症中心,杜兰基因治疗中心杜兰大学,新奥尔良,路易斯安那州,美国

    ⨯
  • 艾琳·m·贝当古

    alibscan@tulane.edu

    联系微生物学和免疫学、杜兰大学癌症中心,杜兰基因治疗中心杜兰大学,新奥尔良,路易斯安那州,美国

    ⨯

间充质干细胞(MSC)的新范式:极化炎性MSC1或免疫抑制MSC2表型

  • 露丝·沃特曼,
  • 苏珊娜l . Tomchuck
  • 汉高皮膜,莎拉·l .
  • 艾琳·m·贝当古
公共科学图书馆
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文摘

背景

我们的实验室和其他报道,刺激特定的toll样受体(通常)会影响人类多能间充质基质细胞的免疫调节反应(hMSCs)。toll样受体识别“危险”信号,激活导致的细胞和系统性动员先天和适应性宿主免疫细胞的反应。危险信号,触发通常被释放后组织病理。因为危险信号招募免疫细胞的损伤,我们推断hMSCs可能以类似的方式招募。的确,我们发现hMSCs表达几个通常(例如,TLR3和TLR4),他们的迁移,入侵,分泌的免疫调节因素大大影响特定TLR-agonist订婚。特别地,我们指出不同后果的刺激后hMSCs TLR3 TLR4的低级相比,短期TLR-priming协议。

主要研究结果

我们扩展我们的研究影响免疫调制的特定TLR-priming hMSCs,和基于我们的研究结果,提出一个新的范例hMSCs从单核细胞文献的提示。特别,hMSCs可以通过下游TLR信号极化成两个同质的表型进行分类,采取行动MSC1和MSC2。这个概念来自我们的观察,TLR4-primed hMSCs,或MSC1,主要是精细的炎性介质,而TLR3-primed hMSCs,或MSC2,表达主要是免疫抑制的。此外,同种异体TLR-primed共培养的msc与外周血单核细胞(PBMCs)可以导致抑制早期激活后MSC2共培养,宽容在培养早期激活MSC1。

意义

我们的研究提供了一个解释的一些矛盾的报告对TLR刺激的净效应及其下游影响干细胞的免疫调节特性。我们进一步表明,MSC分化提供了一种方便的方法来呈现这些异质细胞制剂更均匀而引进一个新的方面研究,以及提供了一个需要考虑的重要方面的改进当前干细胞疗法。

引用:汉高皮膜SL Tomchuck SL,沃特曼RS,贝当古(2010)一个新的间充质干细胞(MSC)范式:极化炎性MSC1或免疫抑制MSC2表型。《公共科学图书馆•综合》5 (4):e10088。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088

编辑器:Derya Unutmaz,纽约大学,美利坚合众国

收到:2010年2月23日;接受:2010年3月18日;发表:2010年4月26日

版权:©2010年沃特曼等。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:资金是由美国国立卫生研究院提供1 p20rr20152-01和国防部OC073102概念奖和研究杜兰大学癌症中心的支持。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

多能间充质基质细胞(原名为间充质干细胞,msc)很容易与其他骨骨髓来源的细胞分离的倾向来坚持塑料。msc分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞在合适的培养条件[1]- - - - - -[4]。进一步说,他们提供了一个好处,那就是它们很容易扩展和存储体外,被认为是“immunoprivileged。“因此,一旦收获他们可以安全地注入自体或异体主机由于缺乏宿主免疫反应性[2]。这些细胞受损组织和促进修复分泌的细胞因子,趋化因子和细胞外基质蛋白[3],[5]。由于这些品质,msc是很有吸引力的候选人在干细胞组织修复和基因治疗的策略。众多的调查人员已经证明了成功的招聘和多器官移植的能力注入msc在各种动物模型和人类的临床试验[6]- - - - - -[10]。然而,精确的分子机制调节干细胞的命运,动员,招聘网站的移植并没有完全理解。此外,尽管有明显的临床效益观察msc被用于细胞疗法时,一些注入细胞(0.1 -1%)被发现在目标站点[2],[11],[12]。这个观察促使研究人员观察表明,好处是由于局部免疫调制通过这些细胞而不是分化或更换受损的靶组织的注入干细胞[9]- - - - - -[11]。

我们实验室和其他人建立了一个联系具体toll样受体的刺激(通常)和人类多能间充质基质细胞的免疫调节反应(hMSCs)[13]- - - - - -[15]。toll样受体识别“危险”信号,激活导致深刻的细胞和系统性动员先天和适应性宿主免疫细胞的反应[16]- - - - - -[20]。通常由一个大家庭的进化保守受体(e.g.-TLR1-9)。危险信号,触发通常被释放后组织病理。外源性危险信号通常释放以微生物感染后内毒素或脂多糖(LPS)脱落。内源性危险信号流入循环异常或受伤的细胞表现为细胞内的组件(比如热休克蛋白质或RNA。通常,这些摆脱危险信号激活通常在前哨先天免疫细胞(e.g.-dendritic细胞),并开始一个适当的宿主反应,重建体内平衡[16]- - - - - -[19]。因为受伤的危险信号招募免疫细胞网站我们推断hMSCs可能采用相同的机制来找到他们的组织需要修缮的任务。令人惊讶的是,我们发现不仅hMSCs表达几个通常也是他们的迁移能力,入侵,分泌的免疫调节因素大大影响特定TLR-agonist订婚[15]。特别是,我们观察到,TLR3刺激导致分泌的因素主要是免疫抑制特性,而TLR4与LPS刺激导致更多的促炎因子的分泌。

其他调查评估的影响TLR订婚的典型的间质干细胞性能tri-lineage分化(chondrogenic,成骨、脂肪形成的)和扩散。例如,曹et al。描述了一种角色通常在人类脂肪中提取干细胞的增殖和分化(hADSCs)[13]。在另一份报告,小鼠MSC (muMSCs)表达通常发现在激活其增殖和分化的影响[14]。然而,在hMSCs相比,他们建议激活muMSCs TLR2抑制分化和迁移的同时促进增殖。李欧塔et al。没有发现影响脂肪形成的TLR激活,成骨的,或在hMSCs chondrogenic分化[21]。此外,与我们的研究中,他们的报告建议等效角色TLR3和TLR4参与hMSC免疫调制。最近,伦巴都et al。报道,TLR3和TLR4订婚hADSCs增加成骨分化但没有影响他们的脂肪形成的分化和增殖[22]。TLR3,他们也认为TLR2和TLR4结扎并不影响hADSCs抑制淋巴细胞激活的能力,相比之下李欧塔et al。报告。

最近描述免疫调节这些细胞似乎相当复杂的性质。例如,免疫调制hMSCs不仅归因于分泌的可溶性因子也依赖MSC-to-immune细胞接触[23]。msc表达低水平的人类白细胞抗原(HLA)主要组织相容性复合体(MHC)类我不表达co-stimulatory分子(B7-1 2 CD40、CD40L),并可诱导表达MHC II类和Fas配体解释为什么他们不激活alloreactive T细胞。msc抑制树突状细胞(DC)成熟B细胞和T细胞增殖和分化,以及减弱自然杀伤(NK)细胞杀死,也支持抑制T调节细胞亚群)[3],[23]- - - - - -[26]。几个因素与这些有关msc的免疫调节特性,包括转化生长因子β(TGFβ),肝细胞生长因子(HGF) HLA-G,前列腺素(铂族元素2),il - 10,吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)和移行细胞(IFNγ)[3],[27]- - - - - -[33]。最近的角色等级家庭成员Jagged1免疫调制是专门归因于下游TLR信号msc[21]。

whi这一点,对比和复杂的免疫调节效应的解释报告到目前为止对TLR激活在大多数干细胞可能在于重新诠释所有的数据考虑大多数当前的干细胞制剂产量异构池的细胞,以及承认通常表示在不同的细胞类型和不同物种(众生)并不总是有相同的反应[34],[35]。其他重要因素可能占的TLR反应冲突的报道干细胞是孵化的浓度和长度与特定的toll样受体激动剂,以及关注和维护,共同有限合伙人(TLR4受体激动剂)在实验室污染。

这里,我们扩展我们的研究通常由hMSCs和免疫调制提供了一些支持这些概念和建立在我们的初步观察,低级,短期刺激与特定TLR3和TLR4受体激动剂(或TLR-priming)内hMSCs介导不同的免疫调节反应。建立,刺激单核细胞与已知细胞因子或受体激动剂通常,像interferon-γ内毒素(LPS TLR4-agonist),分化成一个经典M1表型,参与早期炎性反应,而il - 4的治疗单核细胞收益率替代M2表型与后抗炎有关决议的反应[36]。我们引入一个新的hMSC生物学方面暗示了这项工作,这表明hMSCs,单核细胞,由下游TLR信号分成两个同质的极化行为表型这里分类MSC1、MSC2后单核细胞命名。我们建议hMSCs回应的方式类似于单核细胞特定的TLR启动后,最终将有助于使MSC准备更均匀,并将重要的研究和考虑未来干细胞疗法的改进设计[36]- - - - - -[38]。

结果

细胞因子和趋化因子的分泌模式后TLR3和TLR4激活hMSCs符合不同的免疫调节效应的这些受体激动剂

在这项研究中,我们扩展我们的以前的观测的影响,TLR信号对hMSCs的免疫调节特性,以及可能提供一个解释对比报告[15]。在实验中,我们通常使用一个TLR-priming协议定义为孵化与有限合伙人(10 ng / mL)或聚(我∶C)(1µg /毫升)添加TLR4和TLR3 hMSCs受体激动剂,分别为不超过1小时前洗,在生长介质进一步24 - 48小时孵化[15]。孵化时间短(< 1小时)和最小的toll样受体激动剂浓度以下假设用于模拟内源性msc遇到危险信号的梯度和应对距离受伤的网站。Bio-Plex细胞因子的条件培养基是收集和分析化验(人类组I和II)。符合我们公布结果,TLR3 hMSCs刺激导致高分泌的某些免疫调节因素不同于阐述了TLR4在hMSCs激活(图1一个)[3]。提供进一步支持这些受体的具体影响,hMSCs与占主导地位的消极的质粒转染的每个TLR-receptors,和分泌的因素被BioPlex试验再次测量。这个策略证实TLR3-driven影响hMSC分泌CCL10 (IP-10) CCL5(咆哮),和在较小程度上IL4 IL10。看来TLR4信号是白细胞介素6的上游,IL8所示图1 b。

缩略图
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图1所示。MSC1与MSC2分泌的免疫调节剂。

答:数据显示已知的免疫抑制因素的表达增加了TLR3-primed hMSCs (MSC2),但不是由TLR4-primed hMSCs (MSC1)。方法:msc预处理的toll样受体激动剂的1小时(MSC1有限合伙人或聚(我∶C) MSC2),清洗和培养为一个额外的收获前48小时花了媒介与Bio-Plex细胞因子和分析化验(人类I和II组;Bio-Rad大力神,CA)后,制造商的指示。给出的数据定量比较CT(阈值)的方法[46]。误差线表明SEM。数据代表的一式三份测量5 MSC捐助者。b的数据表明直接TLR3感应IP10 (CCL10)和咆哮(CCL5)分泌。方法:hMSCs被转染和pZERO-hTLR3 pZERO-hTLR4 (Invivogen),使用250 ng质粒/ 1×106细胞(nucleofector)。从每个转染细胞不及时治疗或刺激TLR3和TLR4受体激动剂为48小时1小时清洗和孵化。条件培养基是收集和分析一个。转染效率是由这些方法30 - 35%。数据代表的一式三份测量3 MSC捐助者。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g001

toll样受体激动剂接触的时间影响的迁移和入侵功能hMSCs治疗

除了TLR3和TLR4的明显影响激活细胞因子/趋化因子分泌最初我们也报道,TLR激活促进hMSC迁移,而Pevsner-Fischeret al。报道说,在小鼠msc TLR激活抑制这些细胞的迁移[14]。hMSC迁移化验再次进行不同培养时间和兴奋剂hMSCs内更好地了解这一过程,并考虑相关报告指出CCL5(咆哮)驱动hMSC迁移引起的高度与TNFαhMSCs的预处理[39]。因此,迁移的TLR-primed hMSCs分析后初步接触有限合伙人(TLR4配体),聚(我∶C) (TLR3配体),CCL5, TNFα一小时或24小时之前加载的顶部细胞室transwell迁移分析(图2)[15]。刺激的1小时内TLR3和TLR4 hMSCs促进迁移和入侵对16.5%含血清培养基相比,未经处理的样品,之前报道[15]。然而,24小时孵化与这些配体抑制迁移和入侵hMSCs治疗。相比之下,这个较长的潜伏期时间对于CCL5和TNFαhMSCs迁移和入侵的驱动。TLR3和TLR4的表达抑制受体通过与击倒nucleofection质粒减少迁移> 50%未灌注的hMSCs,符合我们以前的报告[15]。然而,有限合伙人或聚(我∶C)转染细胞的治疗导致更大的移民相比,如果控制(数据未显示)。我们推测,nucleofection的压力和/或内生toll样受体的抑制可能去阻遏TLR-associated抑制剂的迁移,从而提高而不是抑制转染的迁移hMSCs正如我们预期。看来,迁移和入侵机制由通常在hMSCs比原来更复杂的感激。

缩略图
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图2。短期hMSCs TLR刺激促进迁移。

数据显示,短期TLR-priming刺激迁移。相比之下,24小时孵化需要增强迁移由CCL5(咆哮)和TNFα治疗。方法:hMSCs迁移被transwell检查迁移试验与TLR-ligands pre-incubation之后,CCL5 (150 ng / mL),或TNFα(1 ng / mL) 1或装货前24小时Matrigel-coated插入。隔夜孵化后,移民对血清化学引诱物被荧光显微镜可视化和记录。迁移从获得量化的显微图通过计算荧光标记细胞的数量剩余后删除不迁徙的细胞一井。条形图的结果归一化未灌注的细胞。误差线表明SEM。(n = 6)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g002

不同效果的TLR3和TLR4刺激hMSCs脂肪形成的和成骨分化潜能

接下来,考虑到差异的影响报道,TLR3和TLR4激活对tri-lineage(软骨、骨、脂肪)hMSCs分化能力,我们还测量了这些使用特定方法的TLR激活和减少大量的TLR配体相比,大多数其他研究[13],[14],[22]。hMSCs同时诱导分化在不断存在TLR3(1µg /毫升保利(我∶C))和TLR4受体激动剂(10 ng / mL有限合伙人)期间保持分化诱导培养基的化验。通过这个方法,我们注意到一个抑制所有骨骼、脂肪、软骨(图中未显示)程序hMSCs TLR3激活后(图3)。同时TLR4激活hMSCs抑制脂肪生成,刺激骨生成,并不影响软骨形成(没有显示)。

缩略图
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图3。TLR3激活抑制骨骼和脂肪分化。

TLR4激活促进骨分化和抑制脂肪在hMSCs分化。方法:hMSCs诱导(+)来区分的TLR3和TLR4配体四周的潜伏期为分化标记染色之前建立的方法。未经处理的hMSCs (untx)诱导(+)或不作为检测控制。(n > 3)

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g003

hMSCs存款更多的TLR3激活后,纤连蛋白和胶原蛋白当TLR4是刺激

因为我们到目前为止见过不同的TLR hMSCs内激活的影响及其分泌的细胞因子/趋化因子和分化,这是感兴趣的研究是否这些不同的影响扩展到另一个建立经典hMSCs:细胞外基质沉积。hMSCs被种植在室幻灯片70%融合准备与TLR3和TLR4-agonists 1小时前,清洗和孵化进一步固定前24小时。ECM抗体染色后进行固定和膜的透化作用TLR-primed hMSCs播种室幻灯片(图4)。控制,主要抗体是省略了染色过程(数据未显示)。光密度分析表明,TLR3刺激hMSCs导致减少胶原蛋白I / II沉积相比未灌注的或TLR4 hMSCs刺激。这种治疗也导致大于双重纤连蛋白沉积相比未灌注的或TLR4刺激hMSCs (图4 b)。有趣的是,integrin-linked激酶(同类)和冯Hippel-Lindau蛋白质(VHL),也与ECM沉积机制,也是TLR-stimulation后差异表达。TLR3-stimulation hMSCs的亲属和VHL的表达增加,而TLR4-stimulation抑制其表达(数据没有显示)。

缩略图
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图4。TLR3-primed hMSCs存款更纤连蛋白,而TLR4-primed hMSCs存款更多的胶原蛋白。

答:数据表明TLR4-primed细胞沉积两倍胶原蛋白I / II和一半的纤连蛋白TLR3-primed细胞。b光密度分析的显微图a .离开酒吧(灰色)胶原蛋白I / II和正确的酒吧(黑)纤连蛋白结果归一化背景吸光度。方法:hMSCs被种植在室幻灯片70%融合预处理的1 h和配体:1毫米保利(我∶C) (TLR3)或10 ng / mL有限合伙人(TLR - 4)和进一步孵化24小时之前固定。ECM抗体染色后进行固定和膜透化作用TLR-primed或未灌注的hMSCs播种在室幻灯片(抗体Chemicon国际,CA,胡锦涛纤连蛋白MAB1926和胶原蛋白I / II MAB3391)。控制,主要抗体是省略了染色过程(数据没有显示,n > 6)。光密度分析的显微图进行ImageJ软件。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g004

转化生长因子β(TGF) 1,3分泌物是由TLR3压抑但不是TLR4 hMSCs的刺激

TGFβhMSCs分泌物的测定的条件培养基TLR3和TLR4启动后,像以前一样(图5)。我们感兴趣的是这个家庭的因素,因为已知TGFβ调解升高胶原蛋白沉积如上TLR4-priming结果支持,也是一个已知的免疫调节因子[40],[41]。TGFβ1 2和3测量从花培养基luminex免疫测定按照制造商的建议(LINCOplex从微孔)。的TLR-primed hMSCs清洗和培养了一个额外的收获前48小时花了媒介TGFβ检测。TLR3激活hMSCs大大减少(> 65 - 80%)的分泌TGFβ1和3。TGFβ2分泌的水平测量小样本(5 pg / mL),并降低治疗(< 1 pg / mL,数据未显示)。正如所料,TLR4刺激hMSCs导致没有变化或变化很小的未经处理的样品为这个参数(数据没有显示)。

缩略图
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图5。改变增长factorβ(TGFβ1和3)表达式是减少TLR3-primed TLR4-primed msc与测量的水平相比,未灌注的msc。

TGFβ2水平虽小但都进一步压抑疗法。方法:msc预处理了1小时与TLR4受体激动剂(MSC1 LPS)或TLR3受体激动剂(聚(我∶C) MSC2),洗,培养一个额外的收获前48小时花了TGF媒介β检测。TGFβ1、2和3是被luminex免疫测定(luminex®珠免疫测定装备,LINCOplex从微孔)。数据代表的一式三份测量6 hMSC捐助者。误差线表明SEM。*p <0.005比较未灌注的msc。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g005

下游TGFβ效应器SMAD3和SMAD7差异表达TLR3和TLR4 hMSCs启动

下游TGFβ效应器SMAD3和SMAD7可能支持上述TGFβ结果测量hMSCs TLR刺激后。hMSCs被种植在室融合滑至70%,为1小时TLR3和TLR4受体激动剂预处理,水洗,并进一步孵化24小时之前固定。荧光标记SMAD3 phospho-SMAD3(激活SMAD3)和SMAD7抗体被孵化TLR-primed hMSCs表示(图6 a和B)。控制,主要抗体是省略了染色过程(数据未显示)。光密度分析表明,TLR3刺激hMSCs导致SMAD7表达升高,降低和分散核phospho-SMAD3 SMAD3,而TLR4刺激导致增加集中核phosphoSMAD3表达式和减少SMAD7表达式与未经处理的hMSCs相比。这些标记流式细胞术分析支持这些观察结果(数据没有显示)。

缩略图
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图6。SMAD3表达式和激活(phosphoSMAD3 pSMAD3),以及在hMSCs SMAD7表达式。

答:数据显示,SMAD3被激活在TLR4-primed(增加核pSMAD3)但不是TLR3-primed hMSCs。黄色箭头指向相应的放大的细胞核。b . SMAD7表达式是诱导后TLR3但不是TLR4 hMSCs的刺激。方法:hMSCs被种植在室幻灯片70%汇合,TLR-primed,并进一步孵化24小时之前固定。SMAD3、SMAD7 phosphoSMAD3抗体染色进行显示方法。代表显微图5 hMSC捐赠者进行测试。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g006

不同的影响发现TLR3和TLR4刺激在hMSCs参差不齐的1和2的表达

我们下一个测量参差不齐的1和2表达TLR刺激hMSCs因为这些蛋白与免疫调节的一些有争议的报告msc TLR激活后,也被认为是与TGFβ信号[21],[42],[43]。hMSCs被种植在室融合滑至70%,为1小时TLR3和TLR4受体激动剂预处理,水洗,并进一步孵化24小时之前固定。荧光标记锯齿状1和锯齿状2抗体是孵化TLR-primed hMSCs,表示(图7)。控制,主要抗体是省略了染色过程(数据未显示)。锯齿状1和锯齿状2表达在无撇号hMSCs扩散。TLR3 hMSCs导致的刺激减少,细胞核周围的锯齿状1表达,和不起眼的锯齿状2表达。TLR4刺激导致锯齿状增加1表达发现细胞核周围的和焦点沿着细胞边缘。锯齿状2表达这些细胞有endosomal分布特征。这些标记流式细胞术分析支持这些观察结果如下所示。

缩略图
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图7。锯齿状1和锯齿状2 hMSCs表达式。

答:数据显示,锯齿状1表达升高,细胞核周围的,关注边缘TLR4-primed但不是TLR3-primed hMSCs。黄色箭头指向相应的放大的细胞核。b .锯齿状2表达式是分散在TLR3-primed hMSCS,增加,细胞核周围的和endosomal hMSCS TLR4刺激后。方法:hMSCs被种植在室幻灯片70%融合TLR-primed作为前24小时之前和孵化进一步固定。锯齿状1和锯齿状2抗体染色进行显示方法。代表显微图5 hMSC捐赠者进行测试。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g007

吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)和前列腺素E2(铂族元素2),其他已知介质hMSC免疫调制的影响也不同,TLR3和TLR4启动

借给进一步支持hMSCs免疫调制的二分法观察到下游TLR3和TLR4的刺激,我们还测量了其他已知的电位器hMSCs免疫调制,被罩和铂族元素2后,tlr3和TLR4启动协议[26],[44]。我测量的实时PCR分析RNA提取TLR-primed hMSCs孵化进一步RNA收获前6小时。给出的数据定量比较CT(阈值)的方法(图8)[45]。铂族元素2从花了1小时后培养基测定TLR-agonist预处理、清洗,48小时后来文化的商业化ELISA检测(图8 b)。与前面的结果一致,看来这些免疫抑制指标升高后TLR3(保利(我∶C))的刺激,而且,相比之下,大部分由TLR4不变(LPS) hMSCs的激活。

缩略图
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图8。MSC1与MSC2炎症介质的表达。

数据显示增加表达已知的免疫抑制的效应器吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)和前列腺素E2(铂族元素2)TLR3-primed但不是TLR4-primed hMSCs。方法:msc预处理的toll样受体激动剂的1小时(MSC1有限合伙人或聚(我∶C) MSC2),洗,培养一个额外的收获前48小时的花中铂族元素2检测。铂族元素2测量与商用ELISA检测(开曼化工、马)。我测量,msc描述被试,另一个收获前6小时孵化RNA和实时PCR分析。给出的数据定量比较CT(阈值)的方法[56]。误差线表明SEM。n> 3至少有4种不同的hMSC捐助者。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g008

精氨酸酶和HLA-G表达其他相关的免疫调节效应物hMSCs TLR3和TLR4刺激后进行测试。这些不幸的是给不确定的结果,尝试各种方法(数据没有显示)。

同种异体培养hMSCs和hPBMCs导致T细胞激活只有TLR4影射hMSCs但不是未灌注的或TLR3 hMSCs

异构msc描述最初的免疫抑制作用同种异体共培养的msc与PBMCs或孤立的幼稚t细胞的准备工作[3],[31]。添加未灌注的MSC池alloreactive阻止t细胞活化和/或扩散。此外,msc注入同种异体主机不引起宿主的免疫反应性。这主要是由于这一事实未灌注的msc表达低水平的人类白细胞抗原(HLA)主要组织相容性复合体(MHC)类我不表达co-stimulatory分子(CD80 / B7.1、B7.2 / CD86, CD40、CD40L),并可诱导表达MHC II类和Fas配体只有在干扰素治疗[3],[32]。

t淋巴球在人类外周血单核细胞(hPBMCs 106至少5无关的捐助者,标记),是否存在的孤立TLR-primed msc或未灌注的msc、resuspended和刺激1µg CD3 / CD28抗体珠子。72小时后,与CD8细胞被染色或CD4-antibody CFSE-label稀释的CD8 +细胞进行流式细胞术分析。数据表示为激活或改变的百分比% t淋巴球激活不激活hPBMCs hMSCs培养获得(图9)[3]。之前报道,孵化未灌注的hMSCs hPBMCs大大减少他们的激活> 90%[3]。然而,TLR4刺激抑制这种免疫抑制效应的hMSCs(回到几乎100%激活),而TLR3支持免疫抑制(> 90%)。基于这些观察结果,我们建议TLR-priming有效极化hMSCs朝着两个不同的表型。TLR4-priming hMSCs结果在我们称这里为炎性签名MSC1;然而,TLR3-priming支持免疫抑制我们的术语MSC2。TLR4激活hMSCs也持续了两倍non-adherent细胞恢复的实验相比,细胞恢复un-activated PBMCs,未灌注的hMSC,或TLR3-primed hMSC (表1)。

缩略图
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图9。MSC1支持PBMC (T细胞)激活,而未灌注的msc, MSC2抑制它。

数据显示差异(红色箭头)在同种异体T细胞激活PBMCs刺激(PBMCs *),和未经处理的msc (A)培养,MSC1 (B)或MSC2 (C), 9 d和9 e。表达式的锯齿状1和SMAD7 MLMR培养化验。有锯齿状的升高1表达与MSC1 MLMR化验(TLR4-primed)相比,MSC2 (TLR3-primed)和未灌注的分析文化。相比之下,MSC2 SMAD7表达升高,MSC1相比,未灌注的分析文化。9 d。锯齿状1的表达和SMAD7 CD45 + non-adherenthPBMCs收集最后MLMR实验。9 e。锯齿状1的表达和SMAD7 CD90 +附着hMSCs收集最后MLMR实验。方法:T细胞在外周血单核细胞(PBMCs)激活1µg CD3 / CD28抗体珠子,之前与荧光标记标签(CFSE),监控他们的激活或细胞分裂,在10∶1比例加载hMSCs。hMSCs未经处理,准备1小时与地(MSC1),或TLR3 (MSC2)受体激动剂,清洗介质,与PBMCs加载。大于72人力资源的培养后,CFSE-labeled PBMCs从附着msc、收获沾propidium碘为活细胞门,并通过流式细胞仪测定。无污点的细胞和PBMCs不激活抗体作为检测控制。数据表示为改变% T细胞激活获得CD3 / CD28抗体激活PBMCs不是培养msc = 100。误差线表明SEM。数据是一式三份的平均值决定5 MSC捐赠者和2 PBMC捐助者。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.g009

缩略图
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表1。细胞计数后hMSC-PBMC培养。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.t001

各种免疫调节因子的表达测量最后花了培养介质的实验BioPlex化验,像以前一样[46]。的表达CCL5和CCL10上面都遵循着相同的模式。增加了这些观察分泌物培养与TLR3-primed hMSCs相比未灌注的或TLR4-primed文化。相比之下,白细胞介素6和IL8分泌高TLR4-primed共培养培养基的细胞相比,其他两组(数据没有显示)。锯齿状1和SMAD7表达式在培养细胞,流式细胞术测定(图9 d和E)。为目的的分析,CD45 +细胞被认为是hPBMCs, CD90 +贴壁细胞被认为是hMSCs。锯齿状1表达升高hPBMCs和hMSCs人口从TLR4-primed MSC培养相比,未灌注的文化。SMAD7表达式都是高架TLR3-primed MSC培养相比,未灌注的文化。

讨论

通常现在明显的toll样受体)是至关重要的在协调不仅pro-homeostatic组织损伤反应的免疫细胞,多能间充质基质细胞(msc)的起源。试图梳理出的分子细节TLR信号在人类msc (hMSCs),我们最初观察到明显的影响刺激后TLR3 TLR4激活使用我们的短期相比,低级TLR启动协议[15]。使用该协议的研究,TLR3刺激hMSCs支持他们建立免疫抑制效果,而TLR4激活hMSCs更加一致提供了促炎签名。从这些观察结果,我们提出一个新的范式,msc,单核细胞的启示文学,这些不同种类的细胞可以诱导分化为两个不同但均匀表型[36]。我们还认为,许多矛盾的报告的净效应的TLR刺激干细胞可以通过考虑细胞的来源,来解决他们的原始物种,以及toll样受体激动剂接触的时间和浓度。符合这个新MSC范式,我们建议短期、低层次的接触与TLR4受体激动剂极化hMSCs促炎症MSC1表现型重要的早期损伤反应。相比之下,下游hMSCs TLR3受体激动剂接触的后果是其极化对免疫抑制MSC2表型的关键后来抗炎反应,帮助解决组织损伤。当我们发现hMSCs可以促炎挑战目前的教条,最近的一份报告连同这里给出的工作支持了这一指控[47]。Romieu-Mourezet al。表明,TLR在MSC刺激导致炎症的形成网站吸引先天免疫细胞中性粒细胞趋化性免疫效应器的化验和分析从TLR-activated检索MSC在小鼠微环境。我们画的结论基于一致但不同的结果观察MSC1相比与MSC2许多参数测试和提交。这些包括不同的分泌细胞因子和趋化因子(表S1和S2),分化能力的差异,ECM沉积,TGFβ信号通路,参差不齐的表达,语言和铂族元素2表达式,最后极早期激活MSC1、MSC2相反的影响。

我们提供进一步支持TLR3介导的高分泌CCL10 (IP10) CCL5(咆哮),和IL10,因为这种影响可以通过显性负专门抑制TLR3表达而不是TLR4-dominant负表达式(图1 b)。然而,我们发现,增强白细胞介素6和IL8 TLR-priming后下游TLR3和TLR4表达激活,和其他的分泌可溶性介质间接受到这些因为没有直接影响的占主导地位的消极策略(图1 b注意IL4和数据未显示)。我们添加的所有siRNA-driven TLR3抑制策略我们尝试未果由于双链rna作为干扰剂也最有可能充当目标TLR3受体激动剂。TLR3和TLR4的表达抑制受体通过与击倒nucleofection质粒减少NF-kB-driven荧光素酶表达> 90%(数据未显示),以及对可溶性介质的影响。接下来,我们发现hMSC迁移受兴奋剂和暴露的时间(图2)。而TLR-priming提升hMSC迁移,相当于短期暴露与TNFαCCL5并没有促进迁移。相反,长期TLR-priming抑制hMSC迁移,但有效TNFα和CCL5介导迁移。我们认为,短期内,低级TLR-priming模仿内生msc遇到危险信号的梯度和应对距离受伤的网站,吸引他们到适当的目标。一旦hMSCs到达站点溢出大量的这些危险信号,迁移途径需要关闭,reparitive程序打开。转染的hMSCs显性负TLR3和TLR4表达质粒减少迁移> 50%如果hMSCs如预期。然而,聚(我∶C)或LPS刺激这些转染细胞导致进一步增强移植相比,如果控制(数据未显示)。我们推测,具体TLR3或TLR4受体表达质粒转染抑制的主要负面de-represses趋化因子或其它趋化因子受体的抑制下游这些受体而其余替代聚(我∶C)或LPS受体。一个潜在的机制,目前我们正在追求来解释这一发现是由细胞因子信号的抑制(soc) 1和SOCS3 hMSCs之内。TLR3刺激触发JAK / STAT信号级联的间接诱导型I-interferons导致soc 1和3的激活。 The activation of these proteins downregulate the expression of the chemokine receptor, CXCR4, altering CXCR4-CXCR7-dependent migration of hMSCs. Our study suggests a new role for SOCS, CXCR4, and CXCR7 in hMSC migration (S. Tomchuck unpublished observation).

我们假设极化的hMSCs TLR-priming也影响他们对tri-lineage编程分化,和各种报告对比效果也可以解释为不同的来源,数量,和时间的孵化TLR-agonists在诱导期。我们测量了影响hMSC分化与低水平toll样受体激动剂期间保持hMSC分化的诱导,再一次发现,TLR3和hMSCs TLR4有不同的影响。通过这些方法,我们的报告,TLR3激活抑制所有的tri-lineage程序(图3)。TLR4刺激hMSCs抑制脂肪生成,刺激骨生成,不影响软骨形成。其他人已经报道,小鼠msc激活muMSCs TLR2抑制分化和迁移[14]。李欧塔et al。没有发现影响脂肪形成的TLR激活,成骨的或在hMSCs chondrogenic分化[21]。此外,与我们的研究中,他们的报告建议等效角色TLR3和TLR4参与hMSC免疫调制。最近,伦巴都et al。报道,TLR3和TLR4订婚hADSCs增加成骨分化但没有影响他们的脂肪形成的分化和增殖[22]。他们还报告,TLR2, TLR3和TLR4结扎并不影响hADSCs抑制淋巴细胞激活的能力,相比之下李欧塔et al。报告。从这些不同的研究,我们认为,特定的TLR激活影响许多方面指导干细胞命运,但不幸的是达成共识的影响TLR刺激和tri-lineage分化的干细胞是不可能因为一些实验细节别人的研究并不总是包括在内。

除了对分化的影响,TLR-priming协议影响hMSCs存放ECM的能力,这些细胞的另一个经典函数建立。与未灌注的hMSCs和TLR4-primed hMSCs沉积更多的胶原蛋白,TLR3-primed hMSCs沉积更多的纤连蛋白(图4)。帮助解释这些结果,我们下一个评估TGFβ作为建立组件控制ECM沉积的机制,因为它也与免疫调制[40],[41],[48]。事实上,我们发现,TGFβSMAD3, SMAD7受到TLR-priming hMSCs (图5和6)。正如所料,增强胶原蛋白沉积在TLR4-primed hMSCs与TGFβ表达和激活其下游的信号(phosphoSMAD3)。相比之下,TLR3-primed hMSCs,更高层次的纤连蛋白沉积TGFβ1和3表达降低,增加SMAD7 (TGFβ信号传导抑制剂)表达式。尽管我们希望TGFβ,immunoregulating因素,将与TLR3-primed表型相关而非炎性TLR4-primed,很可能TGFβ扮演一个小角色hMSC比免疫细胞免疫调节。hMSCs的免疫调节机制可能更多地依赖于当地IL10受体机制最近了[24],[49],[50]。免疫调节机制控制TGFβ显得很复杂,像TLR-signaling实现他们的影响依赖于特定的细胞环境。举例来说,在最近的一项研究中,调查人员试图平息炎症在大脑中操纵TGFβ和SMAD3免疫细胞作为一种新的方法来预防阿尔茨海默氏症。策略出奇的巨噬细胞浸润增加大脑边缘直接对比原来的假说,但意外地这些细胞更有效地清除淀粉样斑块[51]。

TGFβ免疫抑制效果也与重组相关的早期效应细胞对免疫抑制t调节细胞(t - reg)。TGFβ与Notch1家族成员合作监管关键转录因子(Foxp3)亚群。此外,已知hMSCs招募和支持t - reg immunedampening影响的一部分[52],[53]。TLR3和TLR4信号在msc最近下调Notch1受体家族成员,参差不齐的1,通过这个方法来抑制t细胞抑制msc[21]。相比之下,我们发现通过TLR-priming协议,Jagged1表达升高TLR4-primed hMSCs,只在未灌注的抑制或TLR3-primed hMSCs。我们推测,不同浓度和时间的孵化项目TLR-agonists可能有助于解释这些差异。除了独特的TLR-driven迁移和可溶性免疫调节剂hMSCs的影响,我们观察到的差异IDO的表达和PGE2的分泌(图8)。TLR3-primed hMSCs阐述了高浓度的这两个相比,未灌注的或TLR4-primed hMSCs。这些观察结果提供进一步支持我们提出极化方案。我们正在评估这些介质的影响免疫反应的上下文中,TLR-primed hMSCs影响。

我们做调查TLR-primed细胞免疫调节效应的早期激活(图9)。根据矛盾的报告上面提到的影响TLR3和TLR4刺激对msc的能力抑制早期激活,感兴趣的看看影响我们TLR-priming协议对这hMSC函数。关键的主要前提这项研究中,我们发现TLR4-primed hMSCs表现为李欧塔等。报道,抑制了t淋巴球的公认的MSC抑制激活。虽然在我们的手中,TLR3-primed hMSCs和未灌注的msc抑制早期激活,如预期。符合我们提出新的极化MSC范式,TLR4-primed hMSCs (MSC1)将支持炎性环境包括t效应细胞中发现的环境而TLR3-primedMSC2将支持一个免疫抑制。支持这个论断,我们治疗炎症性肺损伤与我们的小鼠模型MSC1和MSC2细胞,发现了几个参数,如预期的那样,MSC1治疗加重炎症损伤,而MSC2改进,相比未灌注的hMSC治疗(黛博拉·沙利文博士发表的观察)。早期激活集内的实验中,我们进行了经典的同种异体培养与hMSC-hPBMCs之间的直接接触。我们没有解决潜在的可溶性介质在这种情况下。来自人体的msc和信息联系似乎是重要的免疫调节机制[31],[50]。事实上,我们发现contact-dependent分泌的hMSCs CCL10 (IP-10) CCL5(咆哮),HGF和gm - csf第三方培养卵巢癌细胞系和hMSCs(数据没有显示)。我们还指出,在细胞的直接接触培养执行,这些因素的分泌物遵循相同的趋势,也符合那些报道hMSCs单独培养。这一发现并不容易解释的对比效果TLR-primed hMSCs t淋巴球增生因为我们没有测量IL2水平或其他潜在的t细胞激活因子。更多的信息关于这些影响可能从动物疾病模型获得msc和白细胞(PBMCs)交互,可以更直接的测试。或者,更好地处理分子细节的重要贡献TLR-primed细胞可能提供的研究使用单独标记细胞车厢专门为不同的报废的基因。

有趣的是,我们注意到,在这些化验TLR4-primed hMSCs更容易涂上一轮hPBMCs,相比与未灌注的或TLR3-primed hMSCs,培养化验,隔夜孵化后,在整个实验过程中通过显微镜。这个样本组的细胞计数,总是高于其他两组样本(表1)。我们没有调查这个观察的重要性,但与增加的样本组t细胞激活报道图9。我们当前工作的重点是确定特定的早期TLR-primed msc和单核细胞的影响。其他报告显示直接细胞contact-dependent由msc调节抗原递呈细胞的影响[31],[49],[50]。我们的目标是扩展这些观察与TLR-primed的影响,或极化,MSC1、MSC2、巨噬细胞和淋巴细胞)。依赖细胞接触锯齿状1和SMAD7表达的培养与观察到的影响TLR-primed hMSCs独自一人(图7和9)。这些发现的意义仍有待探索的研究上面提到的。

最后,我们推测,到目前为止只有一个免疫抑制表型已经认识到当前异构MSC的准备,因为他们是孤立的方式从主机和扩大体外文化。我们默认的MSC表型的原因必须是一个免疫抑制为了避免深远的和有害的后果从上下文中的炎性MSC1表型hematopoetic干细胞(hsc) MSC维护和支持在祖/干细胞利基市场这两种细胞。我们设想,循环或静止的干细胞/祖细胞具备应对环境因素但不能积极参与免疫细胞或修复细胞在全身循环或维持肝星状细胞在骨髓中。的方式类似于不成熟状态维持单核细胞,树突状细胞和其他免疫细胞,直到响应是必要的,msc是免疫抑制直到促炎作用促进组织修复至关重要。我们还推测TLR4-priming不是最佳方式诱导MSC1表现型。很可能结合其他因素如干扰素或接触其他炎性细胞及其微环境的报道,Romieu-Mourez等人将更容易诱发MSC1表型[47]。目前在实验室里努力旨在进一步定义MSC1、MSC2表型的基因阵列综合分析,将导致更大的线索和更优的编组异构MSC准备进入这两个新定义的表型。

总之,我们发现hMSCs分化成两个截然代理具体TLR-activation后表型。TLR3-priming专门导致增强纤连蛋白沉积,免疫抑制介质的表达和维护抑制t细胞激活。相比之下,TLR4-priming导致胶原蛋白沉积,促炎症介质的表达和逆转MSC-established抑制t细胞激活的机制。我们的研究挑战目前的教条,注入msc只是免疫抑制,而表明他们有更复杂的免疫调节活性。这些发现也提供了一个解释的一些相互矛盾的报道TLR-activation及其对干细胞的免疫调制的结果。我们也认识到,hMSCs有许多细胞命运和极化可能代表了一个有趣的描述这个新模式值得进一步研究。的方式类似于单核细胞,我们警告说,尽管极化是一种方便的方法来更好地定义一个异质的细胞,可以帮助他们的学习,它不是一种绝对的这些细胞的命运。我们的目标是扩大当前的理解MSC与这些新定义的生物学表型,并也提供指导当前MSC-based疗法的改进设计。

材料和方法

msc

主要人类msc (hMSCs)获得我们的合作者在杜兰大学基因治疗中心。此外,hMSCs取自Lonza(马里兰州Walkersville)确保起始细胞群的变化,并确保结果是普遍的,不是唯一的一个捐赠者池源于一个独特的来源,如前所述[15]。所有这些来源的MSC捐赠准备检测hematopoetic干细胞标记物的来源和在我们的实验室。在这项研究中使用的MSC准备不足1% CD34、CD45阳性。msc的通道数不大于4使用在所有的实验中保持一致性。同时,不少于5种不同的无关供者MSC池进行了测试实验。msc从独特的捐赠者都单独进行检测,从不集中在我们的研究与其他捐助者。

TLR启动协议

在这项研究中,有限合伙人(10 ng / mL, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和聚(我∶C)(1µg / mL, Sigma-Aldrich)被用作TLR4受体激动剂和TLR3,分别描述[15]。通常,hMSCs confluency增长到60 - 70%在生长介质(DMEM-alpha和16.5% FCS)开始之前一个实验。TLR-agonists被添加到新鲜的生长介质和细胞孵育1小时。然后细胞在生长介质没有TLR-agonists和洗两次化验所描述的实验。请注意,我们相信基于我们的观察,潜伏期短(< 1小时)和最小TLR激动剂暴露在浓度上面所提到的(或更少)是必不可少的到达这些phenotypes-which模拟内源性msc遇到危险信号的梯度和应对距离受伤的网站。

有限合伙人污染

严格的测试对LPS污染通常表现在所有使用的试剂在这项研究中,以避免虚假结论由于这种潜在TLR-agonist污染物(鲎变形细胞溶解产物显色端点检测,Hycult生物技术,荷兰)。此外,为单个或所有试剂都能整除的最小使用部分来防止污染。

TLR3和TLR4抑制

hMSCs融合增长到70%,收获,然后转染和pZERO-hTLR3 pZERO-hTLR4 (Invivogen),使用250 ng质粒/ 1×106细胞(nucleofector)。50 ng pMAX-GFP控制和co-transfected pZERO独自转染质粒监控转染效率。每个转染镀在半个24-well板和允许恢复48小时。从每个转染细胞不及时治疗或刺激TLR3和TLR4受体激动剂为1小时,洗,培养48小时。条件培养基是收获和储存在−80°C到分析。转染效率还监视co-transfection 500 ng NF-kB-promoter驱动的荧光素酶(LUC)表达质粒(Stratagene /安捷伦科技LaJolla, CA)。转染效率是由这些方法30 - 35%的细胞。

BioPlex化验

msc是镀的密度5×10424-well板块,让坚持一夜之间,然后启动toll样受体激动剂为1小时。条件培养基与Bio-Plex 48小时后收集和分析细胞因子分析(人类I和II组;Bio-Rad大力神,CA)后,制造商的指示。这些实验进行至少三次三个体MSC捐赠者池。

Transwell迁移/入侵检测

迁移进行了分析与8-µm transwell插入孔膜过滤板与经济增长因素都可以降低人工基底膜™层模拟基底膜[15],[54]。TLR-primed或未灌注的细胞生长subconfluence收获前(70%)通过胰蛋白酶化和标签CellTracker™绿色(1µM,分子探针,尤金,或)为1小时37°C。荧光标记hMSCs (2.5 - 5×105细胞/ 300年µL)加载到参议院,和500年µL hMSCs生长介质加载到室底部。隔夜孵化上的过滤器后仔细洗冷PBS和不迁徙的剩余细胞被棉花涂布。迁移细胞的荧光图像采集使用尼康TE300倒置荧光显微镜数字化(DP控制器v1.2.1.108,奥林巴斯光学有限公司;尼康美国路易斯维尔,TX)。每个实验进行了一式三份,五个独立hMSCs捐助者。数据表示为数字统计,每200 x迁移细胞领域为每个样品显微照片,和归一化细胞计数得到的未经处理的控制。

hMSC Tri-lineage差异化协议

修改后的[55]。

Chondrogenic分化

hMSCs (2.5×105)放入chondrogenic定义中,轻轻离心机(800 g×5分钟)在15毫升锥形管合并成一个细胞群或颗粒在24小时内。Chondrogenic中(CM)由高葡萄糖(4.5 g / L) DMEM补充的+ 1(6.25µg /毫升胰岛素,转铁蛋白6.2µg /毫升、6.25µg /毫升亚硒酸、亚油酸5.33µg /毫升、1.25 mg / mL牛血清白蛋白),0.1µM地塞米松,10 ng / mL TGF-β3,50µg /毫升抗坏血酸盐2-phosphate, 2毫米丙酮酸,和抗生素。TGF -β3准备刚从冻干粉,和厘米文化是每三天更换一次。收获,样品被固定在10%中性缓冲福尔马林几个小时,然后在石蜡和嵌入式处理。部分chondrogenic丸是沾染了红色染料O检测蛋白聚糖的积累。

成骨分化

hMSCs培养在3×104细胞/在6-well盘子confluency生长介质到70%,然后中被替换为介质包含成骨的补充剂(OS)。操作系统由50µ米抗坏血酸盐2-phosphate 10 m米β-glycerol磷酸,10−8米地塞米松。三周后细胞与40米固定和染色米茜素红(pH值4.1)可视化钙沉积在ECM 10分钟。

脂肪形成的分化

脂肪形成的诱导培养基介质(MDI + I): 1µ米地塞米松和0.5米methyl-isobutylxanthine 10µg /毫升胰岛素,100µ米吲哚美辛,10%的边后卫在DMEM (4.5 g / L的葡萄糖)添加到支流层hMSCs 48 - 72小时。中就变成脂肪形成的维护中24小时。脂肪形成的维护(媒介)包含10µg胰岛素和10%的边后卫在DMEM /毫升(4.5 g / L葡萄糖)。细胞治疗两次MDI +我总共三个治疗。细胞被洗PBS和固定在10%的福尔马林1 h在4°C,在室温下彩色10 - 15分钟的工作解决方案油红O染色,然后用蒸馏水冲洗3 x。

流式细胞术

人类msc收获和流式细胞术分析了BD-FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞,CA)如前所述[54]。胞内抗体染色实现固定和透化作用后的细胞的制造商(cytofix / cytoperm缓冲区,BD生物科学,圣何塞,CA)。同形像控制和未经处理的或无污点的样本并行运行,作为标准。MSC捐赠池进行分析BD-FACSCAlibur (BD生物科学,圣何塞,CA)使用BD CellQuest Pro软件。多色流式细胞术分析与CellQuest BD LSRII分析仪和分析软件。

主要的抗体:Isotype-control FITC鼠标IgG1K;isotype-control PE鼠标IgG1K;isotype-control鼠标IgG1K;anti-CD105;存在;-CD90;cd44, cd34;-CD31;-CD106 (BDBiosciences);-CD45 cd3, cd4, CD8, cd14, -CD15, -CD19, -CD36, -CD56, -CD123, 235 (eBiosciences) -SMAD3, -phosphoSMAD3, -SMAD7, -JAGGED1和-JAGGED2(细胞信号技术,研发生物系统,和圣克鲁斯生物技术); β Actin (Sigma-Aldrich, MO, #A-2066).

采用免疫荧光分析(如果)

如果进行固定和permeabilized细胞室的幻灯片[54]。主要的抗体稀释在适当的浓度(0.5µg Ab / 1×10的比例6细胞)和可视化,作为标准。遗漏主要抗体作为消极的控制。在尼康TE300显微图被倒置荧光显微镜数字化。彩色显微图和量化的数据提出了ImageJ软件从至少三个类似的彩色部分微密度分析。

转化生长因子β(TGF) 1, 2, 3化验

TGFβ分泌测定的条件培养基luminex免疫测定按照制造商的建议(luminex®珠免疫测定装备,LINCOplex从微孔)。1小时的msc预处理是有限合伙人或聚(我∶C),洗,培养一个额外的收获前48小时花了媒介TGFβ检测。

吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)测定

我测量的实时PCR分析RNA提取TLR-primed msc孵化为一个额外的RNA收获前6小时。给出的数据定量比较CT(阈值)的方法,所述[46]。

HLA-G表达式

HLA-G免疫印迹分析和流式细胞仪检测。免疫印迹anti-HLA-G抗体(克隆4 h84),两膜和胞浆内的分子和流式细胞术检测FITC-conjugated Ab针对anti-HLA-G1 / g5亚型(克隆MEM-G / 9)或HLA-G5(克隆5 a6g7),分别[33]。

前列腺素E2(铂族元素2)分析

铂族元素2测量从花了1小时TLR-agonist启动培养基后,清洗,48小时生长介质的后续文化商业化ELISA检测(开曼化工、马)。

同种异体混合淋巴细胞和MSC反应(MLMR)

发表的变体使用方法来评估alloreactive t细胞增殖[3],[32]。人外周血单核细胞(PBMCs)准备从leucopheresis包(血液中心、新奥尔良、洛杉矶)通过标准离心聚蔗糖Hypaque密度梯度。一千万CFSE-labeled-PBMCs(至少5无关的捐助者,分子探针)的存在与否孤立TLR-primed msc或未灌注的msc resuspended和刺激1µg CD3 / CD28抗体珠子(σ,圣路易斯,密苏里州)10∶1比例。72小时后,细胞计数的整除被台盼蓝排斥作为标准和其余non-adherent细胞CD4抗体,然后沾anti-CD8或CFSE稀释的CD8 +细胞通过流式细胞术分析评估(eBiosciences)。不少于100000个事件/样本收集。细胞表面标记物的表达CD4 / CD8在任意单位评估和量化的平均荧光强度(MFI)活的细胞(propidium碘负)贴上fluorescence-conjugated单克隆Ab (eBiosciences)。

统计分析

通常,数据表示为平均+ /−平均数标准误差(S.E.M.)。多个组比较由单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni过程比较的意思。任意两组之间的比较分析了双尾学生的学习任务或双向方差分析(Prism4 GraphPad软件Inc . CA)。的值p< 0.05被认为是具有统计学意义。

支持信息

表S1。

TLR-regulated基因cDNA数组。内TLR刺激对基因表达的影响分析了hMSCs TLR-pathway集中cDNA数组(参见“http://www.superarray.com/genetable.php?pcatn=aphs - 018 a“基因排列的细节)。结果表现为褶皱基因表达的变化TLR-primed MSC1、MSC2相对于未灌注的hMSCs 6不同捐赠者部分报道[15]。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.s001

(0.15 MB RTF)

表S2。

BioPlex人类细胞因子,趋化因子,生长因子分析。1小时的hMSCs是预处理的toll样受体激动剂(MSC1有限合伙人或聚(我∶C) MSC2),洗和培养一个额外的收获前48小时花了介质与Bio-Plex细胞因子和分析化验后,制造商的指示。数据表示平均pg / mL获得纠正一式三份测量至少3 MSC捐助者在四个独立的实验。占主导地位的消极转染质粒是pZero-TLR3 (p0-TLR3)和pZero-TLR4 (p0-TLR4 InvivoGen,圣地亚哥,CA)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010088.s002

(0.08 MB RTF)

确认

我们感谢技术、文书和微生物学研究的支持部门,在路易斯安那州的癌症研究协会和杜兰大学癌症中心,以及杜兰大学基因治疗中心由布鲁斯·a·邦内尔博士。

作者的贡献

构思和设计实验:RSW AB。进行了实验:RSW SLT SLH AB。分析了数据:RSW SLT SLH AB。造成试剂/材料/分析工具:SLT SLH AB。该报写道:RSW AB。

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