我和二参数Arg是M2与M1巨噬细胞表达的

在初步的方法论的研究中,我们发现骨骨髓来源MØC57BL / 6小鼠产生参数我和Ym1/2 (M2 MØ表达的几丁质酶家族的成员[6])当受到隔夜il - 4 (pro-M2极化条件),和Arg II LPS刺激后(pro-M1两极分化的条件)。在这些实验中,偏振刺激被应用于IFNγ-primed MØ群Mosser所描述的[7]。因为这IFNγ启动步骤可能偏见极化,此参数测试(图1一个)。我们发现IFNγ启动增强Arg我表达MØ受到M2在伊诺极化条件没有重大变化,参数二世和Ym1/2表达式。另一方面,这一步增加M1极化MØ伊诺表达式和减少他们的第二参数表达式,之前报道的王等[8](图1一个)。无极M0 MØ这些基因没有表达任何和IFNγ启动步骤没有效果。IFNγ启动步骤是用于以下实验,因为它进一步M0之间的歧视,M1和M2表型在体外。

媒介受制于M2巨噬细胞诱导血管平滑肌细胞的增殖

测试的优势是否精氨酸酶的表达在伊诺赋予了M2 MØ修复功能,血管平滑肌细胞(VSMCs)与MØ-conditioned培养基培养。M2-conditioned介质诱导的扩散VSMCs (图1 b)和外膜成纤维细胞(数据没有显示)。相比之下,M1-conditioned媒介并不影响细胞增殖(图1 b和数据未显示)。效果并不是由于存在有限合伙人/ IFNγ或il - 4的媒体,因为孤独,这些代理不能够诱导细胞增殖(图1 b)。

ApoE KO M2-Prone巨噬细胞

精氨酸酶的明显表达式M1和M2亚型的巨噬细胞的表型可以用来建立损伤apoE KO小鼠巨噬细胞渗透。先决条件使用精氨酸酶亚型M1和M2标记是他们不同的表达式适用于MØapoE KO小鼠。为了解决这个问题,我们研究了活动(2、4、6、24和48 h)的表达参数,参数二世,伊诺和il - 6在极化骨骨髓来源MØC57BL / 6 (MØ^B6)和ApoE KO (MØ^ApoE老鼠)。

正如所料,伊诺和Arg II的转录,但不是Arg的我,观察il - 6的生产M1-polarized MØ^B6,峰值表达式在10小时(图2)。相比之下,没有产生的il - 6 M2-polarized MØ精我是唯一记录观察到M2-polarized MØ^B6,表现出相似的动力学(图2)。

缺乏ApoE影响定性而不是定量反应两极分化的代理。M1 MØ^ApoE显示全球(Arg II +间接宾语)M1基因表达水平接近MØ^B6(图2)。Arg的高表达在M1 MØII^ApoE证实,它可以是一个可靠的M1表型标记在动脉粥样硬化病变。MØ从ApoE KO小鼠似乎M2-prone M2极化诱导显著更高的参数我在MØ表达式^ApoEMØ相比^B6。

巨噬细胞表型在ApoE KO小鼠早期和先进的斑块

因为相同的两个亚型酶M1和M2出现相互排斥的表型(图2),immunofluorescent参数的分析我和二参数表达式(图3)是用于识别分别M2与M1型MØ(Mac3⁺细胞)在主动脉根cryosections从20周前(脂肪条纹)和55个星期(先进的斑块)ApoE KO小鼠。

在20周的年龄、病变中几乎只有Arg我⁺MØ(图3 b)。在55周,情况发生了戏剧性的改变相当数量的参数⁺参数我⁺Arg二世⁺双正MØ检测(图3 b)。正如所料,表面积被MØ(Mac3⁺)直接与病灶大小成正比(图3 c)。当考虑M2的相对丰度在M1 MØ(Arg我⁺单积极/参数二世⁺单积极比率)看来,不管疾病的阶段,M2表型的患病率与小斑块表面区域(图3 d)。

为了探索可能的细胞因子微环境的变化在疾病进展,pro-M2转录水平的细胞因子,il - 4[9],IFNγpro-M1的细胞因子[2]量化,通过实时PCR reverse-transcribed RNA提取microdissected动脉粥样硬化病变(图3外:我刚刚从20到55 ApoE KO小鼠。

所示图3 e,il - 4的主要记录20周前ApoE KO小鼠动脉粥样硬化病变,但在55周的年龄急剧减少。相比之下,IFNγ表达式在斑块检测不到20周前老鼠而成为主要的55刚刚老鼠(图3 e)。

ApoE PPARγ的巨噬细胞表达的影响

更明显的M2 MØ的潜力^ApoE建议对il - 4的反应可以在缺乏ApoE加剧。il - 4可以通过两个信号heterodimeric受体IL-4Rα链的组成与普通γc链或IL-13Rα1链。所示图4IL-4Rα的表达,在无极MØIL-13Rα1是相似的两个基因型。这种排除的可能性增强反应il - 4是依赖于不同的基底在MØ受体表达^ApoE。

接下来我们分析了下游转录因子的表达水平的il - 4受体,特别是的过氧物酶体proliferator-activated受体,核受体超家族的成员PPARγ转录因子结合脂肪酸和胆固醇的衍生品。我们发现PPARγ成绩单在无极MØ显著增加^ApoE相比MØ^B6(图4 b)。添加外源ApoE PPARγ表达式在MØ水平降低^ApoE和MØ^B6(图4 b)。所示图4摄氏度添加PPARγ合成受体激动剂吡格列酮,进一步增加了参数的表达式在M2 MØ我。介质条件由这些M2-polarized MØ吡格列酮的存在增加了VSMCs扩散(图1 b)。相反,抑制的PPARγGW9662显著降低参数的表达我,不管极化条件,但程度不一样的M2 MØApoE KO小鼠(图4摄氏度)。PPARγ抑制也减少了pro-mitotic VSMCs M2 MØ-conditioned介质的属性(图1 b)。选择性注意的精氨酸酶抑制剂,Nor-NOHA也显著降低的pro-mitotic活动MØ条件培养基(图1 b)表明,精氨酸酶活动有助于MØ的pro-mitotic活动。

ApoE-Deficient巨噬细胞保留他们的可塑性

尽管内在M2偏见的MØApoE KO小鼠,数量一致的参数⁺(M1) MØ被发现在先进的动脉粥样硬化病变。这可能是由于招聘MØ在病程不同的表型。因此我们评估参数的位置我和斑块内的第二参数标签使用新的量化方法(图5),假设新招募了MØ将驻留在腔的一侧的斑块。当参数我⁺(M2) MØ积累在细胞腔的一侧的斑块在年轻的老鼠,在55周的年龄,我和二参数标签参数是均匀地分布在整个斑块(图5 b)反对顺序招聘MØ与不同的表型。另外,先进的动脉粥样硬化斑块的浓缩在M1 MØ可能由于表型转换plaque-infiltrated MØ。因此,我们测试了,没有ApoE的情况下,在体外极化MØ保留他们的可塑性。骨骨髓来源MØ首次被极化到M1和M2和随后受到第二次和相反的刺激。

如MØ^B6老鼠,完全极化MØApoE KO小鼠完全恢复从他们最初的表现型相反的一个接一个的第二个刺激。10 h后,M1 MØ培养与il - 4打开参数的表达我虽然伊诺的表达,Arg二世和il - 6的生产被关闭(图6(左))。另一方面,M2 MØ刺激与有限合伙人/ IFNγ伊诺的表达,增加参数二世,我表达il - 6, Arg是大大削弱了(图6,对吧)。

因此完全极化MØ保留他们的可塑性不管ApoE的缺失。

Plaque-Infiltrated巨噬细胞最初的修缮的表现型

分析plaque-infiltrated MØ年轻ApoE KO小鼠显示统一的参数⁺(M2) MØ表现型。与此同时,病变始终包含大量的il - 4。il - 4在这些网站的来源可以是中性粒细胞[10]或NKT细胞[11]所显示最近的研究显示这些细胞动脉粥样化形成的重要贡献[12],[13],[14]。意想不到的M2修复协会MØ动脉粥样化形成的初始阶段不一定意味着这MØ表型导致疾病进展。或者,我们建议M2 MØ发挥修复行动以来,动脉粥样硬化M2-conditioned媒介促进了血管的增殖细胞在体外。

PPARγ倾向于修缮的巨噬细胞表型

在体外极化的研究表明,缺乏ApoE有利于修复M2表型对il - 4的回应。ApoE的更加明显M2潜力KO MØ并非是由于增加的可用性受体表达il - 4而是增加过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)γ,主要下游转录因子il - 4受体[15]和一个新兴MØ分化的关键调节器,将脂质代谢和炎症[16]。添加PPARγ受体激动剂(吡格列酮)进一步提高参数的表达我对il - 4的ApoE KO MØ回应。相反,由GW9662 PPARγ抑制减少参数。与之前的研究结果相一致的表达人类MØ上执行[17],我们提议PPARγ维持MØM2激活途径的老鼠。

有趣的是,添加外源ApoE衰减,在剂量依赖性的方式,ApoE KO MØPPARγ表达水平和恢复一个反馈控制ApoE转录因子。事实上,这种效应也发现MØ从野生型小鼠,表明载脂蛋白e施加生理控制PPARγ转录。

的Pro-Mitotic活动M2巨噬细胞与精氨酸酶的表达

我们发现VSMCs pro-mitotic M2 MØ-conditioned媒介的影响是显著降低MØ极化时表现在Nor-NOHA面前,精氨酸酶抑制剂,这表明精氨酸酶活动有助于pro-mitotic M2 MØ的效果。MØ偏振实验与介质条件的吡格列酮的存在或GW9662证实这种说法。事实上,媒介受制于MØ极化与吡格列酮,表达高水平的参数,诱导强烈的VSMCs扩散。相反,VSMCs扩散减少这些细胞和培养基培养时受制于MØ极化与GW9662表达低水平的参数即为什么M1 MØ条件中未能促进VSMC增殖令人费解,因为M1 MØ表达Arg II,一种酶,这种酶催化的反应参数。鉴于伊诺和精氨酸酶使用L-Arg作为常见的基质和各自公里(∼5µmol / L vs 10更易/ L)和Vmax值(10³-10年⁴精氨酸酶倍),这些酶有望争夺L-Arg。因此,伊诺表达上调可能在M1 MØ脯氨酸和聚胺生产与Arg L-Arg II。精氨酸酶的变化根据极化同种型可以让每个MØ类型明显解决精氨酸酶的胞质(Arg)或线粒体(Arg II)提取亚细胞的隔间,他们可能在内皮细胞产生不同的生物效应[18]。

巨噬细胞表型转换与病变进展

疾病进展,Arg II⁺Arg (M1) MØ战胜了我⁺(M2) MØ。回归分析表明,M1, M2 /比plaque-infiltrated MØ成反比apoE KO小鼠损伤的发展规模,说明斑块的增长与炎性M1 MØ的浓缩。

先进的动脉粥样硬化斑块的浓缩Arg II⁺(M1) MØ可能是由于plaque-infiltrated表型转换,极化MØ。支持这一假设的参数我可以使用Arg co-detected II(双阳性染色)MØ出现在先进的斑块。这一发现让人想起我们发现在体外:M2细胞再极化M1表型保持一定程度的参数表达式,在直接极化M1 MØ缺席。MØ可塑性被广泛描述的野生型细胞[19],[20],[21]。尽管MØIFNγ促进M1表型,il - 4诱发M2表现型[2],[22]。重要的是,空斑细胞因子微环境改变随着时间的推移,因为我们记录当地的增加为代价IFNγil - 4的表达在先进的动脉粥样硬化斑块。另外,斑块的表现型的变化渗透MØ在先进病变可能导致新招募了M1 MØ。如果是这种情况,一个期望M1细胞主要出现在腔的一侧。我们发现这两个参数我和二参数标签均匀分布在先进的病变。这些数据从而不支持连续招聘M2与M1 MØ。但是我们不能完全排除局部细胞因子的改变环境的可能性不同极化的新传入的单核细胞。因此,我们建议M2型的初始MØ表型和细胞因子的变化环境的先进斑块有利于炎性M1 MØ的出现,与斑块的增长直接相关的流行。

在目前的研究中,我们使用Arg我和二参数替代标记的M1和M2 MØ以来这两个亚型的精氨酸酶明显调节骨骨髓来源M1和M2 MØ极化在体外。然而,它已被证明,IFNγ和有限合伙人不同调制参数二世在M1 MØ表达式[8]和参数,我可以表达的独立已激活MØM2-polarizing条件(il - 4 / IL-13)[23],[24]。因此,我们不能正式排除参数⁺和参数二世⁺MØ观察在活的有机体内也反映了MØ激活状态不同的极化条件下获得的,我们使用在体外。

巨噬细胞在动脉粥样硬化塑性:病理生理和治疗方面的考虑

斑块的表型变化MØ可能依赖的类型(先天或适应)免疫效应器浸润病变发展。感兴趣的是死胡同等人的最近的一项研究显示,最初的M2 MØ表型的炎症是独立于适应性免疫系统的细胞,而M2 MØ表现型的维护需要IL-4-producing T细胞,在缺乏的M2 MØ切换到M1表型[25]。置换这动脉粥样硬化机制表明,Th1表型可能引发M2 - > M1表型开关在先进的动脉粥样硬化斑块,先天免疫的效应物移交时,继电器的效应器适应性免疫系统[26]。

在治疗的角度来看,控制当地的细胞因子在动脉粥样硬化斑块环境在活的有机体内将难以实现。另一方面,最近的一次人类颈动脉斑块病理研究[17]建议PPARγ激活可能倾斜MØ极化M2表型。目前的实验研究表明,PPARγ受体激动剂,它已经被用于临床实践和显示一个atheroprotective效果[27],确实加强响应鼠标MØM2偏振代理。因此我们建议使用PPARγ受体激动剂可能导致动脉粥样硬化病变的稳定支持的分化和/或转换plaque-infiltrated MØ修缮的M2表型。

分析动脉粥样硬化病变

免疫组织化学和病变形态分析进行了如前所述[28]在串行主动脉cryosections 20 (n = 10)或55 (n = 10)刚刚ApoE KO小鼠(从杰克逊获得实验室和饲养设施)保持在正常饮食。老鼠依照欧盟指令(86/609 / EEC)的护理和使用实验动物。调查动物伦理委员会批准的国家卫生研究所et de la医学。审查和批准的研究也得到了当地动物伦理委员会(没有。B 7518 03)。

免疫组织学

Cryosections在丙酮固定,用酒精和甲苯脱脂,re-hydrated。内源性过氧化物酶和抗生物素蛋白生物素被封锁使用商业套装(DAKO)。当使用鼠标anti-mouse抗体,幻灯片pre-incubated F (ab)”2 fragment-goat anti-mouse免疫球蛋白(杰克逊immunoResearch)和M.O.M. immunodetection工具包(向量实验室)。参数我⁺和参数二世⁺MØ被确定与纯化鼠anti-mouse Mac3单克隆抗体(BD生物科学),一个immunopurified兔子anti-mouse Arg II多克隆抗体[29]和纯化小鼠anti-mouse ArgI单克隆抗体(BD)。使用荧光染色显示了二次抗体(分子探针):Alexa萤石647山羊anti-rat免疫球蛋白(H + L) Mac3, Alexa萤石546 anti-mouse Arg我和Alexa萤石488山羊anti-rabbit ArgII。应用幻灯片与延长cover-mounted黄金不变色试剂(表达载体)。荧光检测的蔡司显微镜Axiovert 200配备了AxioCam MRm更小。3相机,ApoTome®系统和AxioVision®软件捕获图像。图像获得使用EC“Plan-Neofluar”40 x / 0, 75 (df = 0, 71毫米)客观的显微镜。

为了评估参数的空间分布和参数II斑块内的标记,我们建立了一个基于强度的形态学方法配置文件的每个应用和规范化的内部弹性板之间的距离(IEL)和腔内斑块的边界。为了这个目的,我们通过计算机辅助图像分析量化资料在10段(平均收敛≥7)穿过每个主动脉斑块的每个鼠标(30概要/应用/鼠标;图5)。

骨骨髓来源的巨噬细胞隔离和分化

主要文化来源于MØ取自股骨的骨的6 - 10周前C56BL / 6 (B6, Janvier)或载脂蛋白e KO小鼠所描述[20]在完全培养基和培养(MEM补充10% FCS, 800 pg / ml巨噬细胞集落刺激因子- 1 [20% l - 929条件培养液])。Non-adherent细胞24小时后收集,并分化为7天Mac3收益率98%⁺,98% F4/80⁺和99% CD11b⁺细胞(数据未显示)。

骨骨髓来源的巨噬细胞的极化

分化骨骨髓来源MØ极化与100 ng / ml有限合伙人+ 100 U /毫升IFNγ(M1)或5 ng / ml il - 4 (M2)[2]。一夜启动的效果与100 U /毫升IFNγ极化之前[7]也是考验。无极MØ独自在完全培养基培养。

检验PPARγ的影响,药物受体激动剂(吡格列酮,1µM)或拮抗剂(µM GW9662, 1)极化前添加了2个小时,进行如上所述。

人类重组ApoE (rApoE)脱盐消除有毒碳酸氢铵和使用0.03分,30µM。

MØ可塑性研究细胞在上述pro-M1条件培养了10小时,洗,然后提交额外的10个小时pro-M2环境(M1 - > M2)。实验是反映研究M2 - > M1开关。

结束时的刺激,文化上层清液被收集并存储在−80°C il - 6之前分析(ELISA, BD生物科学)。MØ洗和细胞溶解在试剂盒RNA的提取和分析基因的表达。

基因表达的研究

从细胞总RNA或从升主动脉粥样硬化病变microdissected略高于主动脉尖点(图3外:我使用上标)是孤立和reverse-transcribed II逆转录酶。实时PCR进行互补的引物对中列出表1排名100 (Biorad)或SDS7700(应用生物系统公司)周期计(2µl cDNA 250海里引物11µl Syber-Green大师混合试剂盒;1循环:50°C, 2分钟,1周期:95°C 15分钟和60周期:95°C 40年代,60°C 1分钟)。解离曲线分析60年底周期验证的身份PCR产物。没有模板中没有检测到信号控制。当结果三个M0、M1和M2条件要求,4 cDNA控制串行¼稀释样本被用来建立一个标准曲线在每个反应。感兴趣的基因的表达是归一化的表达水平既定的表达hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase产生HPRT基因和表示为任意单元(au)。当M1和M2条件表示为M0参考相比,2^−ΔΔCt公式被Pfaffl兆瓦[30]应用,阈值周期“Ct值对应的周期PCR进入对数生长期。

动脉VSMC增殖

主要血管平滑肌细胞从外植体获得文化从C57BL / 6小鼠主动脉组织的描述[31]没有酶消化步骤。的完整长度的胸主动脉无菌解剖和动脉外膜被移除。主动脉是切成小段(∼1毫米³),孵化1 h在37°C的5%股份₂在下跌10% FCS DMEM培养2周在标准条件。

VSMCs使胰蛋白酶化,播种的初始密度在96 - 5000细胞/孔板和种植sub-confluence(2天)。细胞就离开静止在1% FCS DMEM 48 h。培养基条件M0、M1、M2 MØ,收获10 h极化后,被添加到VSMCs 48 h。在某些井,媒介是受制于MØ极化的µM 50或100µM Nor-NOHA,特定的精氨酸酶抑制剂或在1µM吡格列酮或1µM GW9662。控制井包括VSMCs培养的100 ng / ml IFNγ有限合伙人+ 100 U /毫升、5 ng / ml il - 4, 50或100µM Nor-NOHA, 1µM吡格列酮,或1µM GW9662在无血清培养基(BSA 4%)来测试是否在使用的分子极化MØ仍然留在MØ-conditioned介质对细胞增殖有直接的影响。在试验结束时,可行的细胞的数量在每个条件评估的还原染料3 - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5 diphenyltetrazolium (MTT四唑,0.5毫克/毫升最终浓度井)[32]通过标准曲线,建立了与已知数量的细胞(8井从1000年到80年000 VSMCs)。麻省理工是孵化3小时37°C,中移除,甲瓒产品溶解在DMSO溶液100毫升。产品形成评估spectrophotometrically通过测量OD在590海里。

统计分析

结果表示为±SEM手段。组之间的差异被单向方差分析评价。差异p < 0.05时被认为是重要的。连续变量之间的相关性被回归计算。使用Statview 5.0执行统计分析软件SAS研究所Inc .)、美国)。